Summary
这里介绍的是一种在成年斑马鱼端脑中进行质粒DNA传递和脑细胞标记的电穿孔方法。该协议是一种快速而有效的方法，用于可视化和跟踪单个细胞，并开辟了将电穿孔应用于各种基因操作的新的可能性。
Abstract
电穿孔是一种转染方法，其中电场应用于细胞，在细胞膜中产生临时孔隙，提高渗透性，从而允许将不同的分子引入细胞。本文采用电穿孔技术将质粒引入脑膜细胞，使成年斑马鱼的腹室区域划线。这些细胞的一小部分显示了干细胞的特性，并在斑马鱼大脑中产生新的神经元;因此，研究他们的行为对于确定他们在神经发生和再生中的作用至关重要。通过电穿孔引入质粒，可以长期标记和跟踪单个细胞。此外，Cre重组酶或Cas9等质粒可输送到单个细胞，从而实现基因重组或基因编辑，并为在受控、自然中评估细胞的自主基因功能提供了独特的机会环境。最后，采用这种详细的分步电穿孔方案，成功地将质粒引入大量单细胞。
Introduction
斑马鱼是优秀的动物模型，用于检查刺伤后的大脑再生。与哺乳动物相比，在进化阶梯上，斑马鱼等进化较少的物种通常表现出较高的形成性神经发生率和成人神经干细胞栖息的更广区域，导致在整个过程中不断产生新的神经元成人生活中的大多数大脑区域。与哺乳动物1相比，这一特征似乎与斑马鱼的再生能力显著提升有关，因为斑马鱼在所研究的大多数脑损伤模型中具有显著的潜力，能够有效地产生新的神经元。 3，4，5，6，7，8 。在这里，斑马鱼端脑研究，因为它是一个大脑区域与突出的神经发生在成年。这些成年神经发生区与成年哺乳动物脑中神经原发生区9、10、11同源。
由于存在径向胶质细胞或脑细胞等径向胶质，斑马鱼端脑素中存在丰富的神经原发生区。Ependymoglial细胞作为常驻的成人神经干细胞，负责在完整和再生的大脑3，5中产生新的神经元。系骨追踪实验表明，心室叶膜对损伤有反应，然后增殖并产生新的神经细胞，迁移到病变部位5。由于斑马鱼端脑的电化性质，腹腔细胞排列在心室表面，并建造心室壁。背叶心室壁由背端阴膜细胞层形成（图1A）。重要的是，斑马鱼叶黄体体现了哺乳动物径向胶质和阴叶细胞的特征。长径向过程是径向胶质细胞的典型特征，而细胞延伸和紧密结（及其心室位置）是阴囊细胞12、13、14的典型特征。因此，这些细胞被称为阴叶细胞。
为了在再生过程中遵循单个阴叶细胞的体内行为，需要可靠地标记它们。荧光显微镜的体内细胞标记方法已经描述过，如内源性报告剂或亲脂染料15。与电穿孔相比，这些方法可能需要较长的时间，而且通常无法提供单细胞标记或永久长期跟踪的可能性。然而，电穿孔（除了单细胞标记）提供了将新的DNA引入宿主细胞的可能性。此外，与其他DNA移植到细胞的方法相比，电穿孔已被证明是最有效的方法之一16，17，18，19。
这里介绍的是一个电穿孔协议，已细化，以标记在成年斑马鱼端脑中的单一脑细胞。该协议允许标记单个细胞，以便长期跟踪它们20或操纵特定途径在细胞自主的方式21，22。
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Protocol
本议定书中使用的所有动物均按标准饲养条件饲养，实验均按照欧盟和上巴伐利亚州政府的处理准则和条例进行（AZ 55.2-1-54-2532-0916）。
1. 用于电穿孔的质粒混合物的制备
- 稀释无菌水中感兴趣的质粒，并加入快速的绿色染色剂溶液[1毫克/mL]。确保质粒的最终浓度为±1 μg/μL。以不超过3%的浓度添加污渍，因为它的唯一目的是给溶液着色和可视化心室注射。
- 制备后，通过上下移液或手指敲击，混合质粒溶液。在室温 （RT） 下储存，直到使用。
注：对于将两个质粒共电到同一细胞中，请确保混合物中使用的每个单个质粒的浓度至少为 0.8 纳克/μL，摩尔比为 1：1，以获得 80%-90% 共电效率。
2. 注射和电穿孔程序的准备
- 准备针拔装置中注射所需的玻璃毛细管（外径 1 mm，内径 0.58 mm）。
- 为了注入正确的质粒量（见上文），在 68.5°C 的温度下用两个轻重和两个重物拉毛细管（参见拉拔器规格的材料表）。
注：在使用不同的拉拔器时，校准毛细管以提供适当体积的电穿孔组合。 - 手动将喷射设备设置为 200 hPa 的喷射压力（通过转动 Pi 旋钮）和 0 hPa 的恒定压力。手动将喷射时间设置为手动模式，并用脚踏板控制压力。
- 将电穿孔装置设置为"LV 模式"，54-57 V（每个脉冲 25 ms，间隔为 1 秒），带五个脉冲。将电极连接到设备。
- 用干净的鱼水准备一个鱼缸，在电穿孔程序后，鱼将被麻醉唤醒。在整个回收期间，将空气石固定在空气泵上，直到鱼完全苏醒。
- 采取一个普通的厨房海绵，并在海绵中做纵向切割，以在注射和电穿孔过程中将鱼放入水中（见上一份出版物3）。
注：厨房海绵应定期清洗或更换，以去除潜在的有毒化学品。 - 在注射和电穿孔设置旁边放置少量高导电性多用途超声凝胶。
注：这将确保足够的导电性，因此，电化电池在整个端脑中分布。
3. 斑马鱼麻醉
- 麻醉前，在蒸馏水中制备0.2%MS222的麻醉液，用Tris-HCl缓冲液将pHH调整为7。用鱼水稀释此库存 1：10（即 0.02% MS222）。
- 麻醉鱼，保持他们在这个工作的解决方案，直到身体和刺的运动消退（通常几分钟）。
4. 质粒溶液注射
- 使用微装载机尖端将制备的玻璃毛细管填充 10 μL 质粒溶液。避免毛细管内形成气泡。
- 按注射设备上的菜单/更换毛细管。将针头插入针头，并将其固定到针架中。
- 在放大倍率为 3.2 倍或 4 倍的立体显微镜下，仅使用细端钳切割毛细管的尖端。将注射设备从"改变毛细管"模式切换到注射模式，然后用脚踏板施加压力，以确保质粒溶液在针头中轻松流出且不受阻碍。
- 用麻醉液将鱼从养殖罐转移到容器（塑料盒）。等待几分钟，直到刺的移动消退。
- 将鱼放入预湿海绵中，背侧朝上。在立体显微镜下执行以下所有注射步骤，以确保程序的准确性。
- 使用不锈钢的解剖微刀，具有40毫米切削刃和0.5毫米厚度，在端脑后侧的鱼头骨上形成一个小洞（图1B），紧邻与光学技术的边界。
注：这一步应该小心执行，因为孔应该非常小和肤浅，穿透只头骨，以避免脑损伤。 - 根据需要倾斜鱼，以正确角度将玻璃毛细管的尖端朝向头骨，以方便毛细管尖端穿透孔。
- 小心地将毛细管的尖端插入颅骨的孔中，直到到达脑心室（参见图1B）。这将需要穿透背端阴膜细胞层。特别小心不要将毛细管插入太深，以免与脑组织接触。将毛细管精确地保持在半球之间，在刺穿背端下阴层后留在心室内。
注：这是一个非常微妙的步骤。使用色素化突变线（如黄铜24）提高此过程的准确性，从而在注射过程中更好地可视化玻璃毛细管位置。 - 在心室内的毛细管尖端时，通过用脚踏板施加约 10 s 的压力来注入质粒溶液，这相当于大约 1 μL 的质粒溶液。
注：如果更换针拔器、毛细血管或注射器，应校准系统，以便始终提供 1 μL 质粒溶液。校准可以通过测量排入矿物油（如石蜡油）的质粒滴的直径，然后计算滴的体积来进行校准。注射10小时后，应有±1 μL的质粒液体排入矿物油。 - 通过观察液体在整个心室的传播，确认上一步的成功。
5. 电穿孔
- 将鱼从注射设置中取出，同时仍将其放在海绵中。
- 将电极尖端的内侧浸入超声波凝胶中。
- 用少量的超声波凝胶盖住鱼端膜。
- 将鱼头放在电极之间，将正极放在鱼头的腹侧，负极放在背侧（图1C），同时仍将鱼的身体放在海绵中。这设定了在心室区域电化叶黄酮所需的电流方向。
- 轻轻地将电极精确地压在端脑上（图1C）。使用脚踏板管理电流。将电极固定到位，直到所有五个脉冲都完成。
6. 鱼类恢复
- 让鱼在先前准备好的连续加气罐中恢复，直到它醒来。利多卡因凝胶可以涂在头骨上，以减轻任何可能发展的痛苦。
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Representative Results
所述电穿孔方法允许将质粒DNA输送到脑细胞中，这些细胞表面位于斑马鱼端脑素和背端脑细胞层（图1A）。
如果电穿孔的结果为阳性，可以在其他阴极细胞中观察到标记的单阴白细胞（图2A，B中的红细胞）（图2A，B中为白色）。根据电穿孔过程的效率，可以标记更高（图2A）或更低（图2B）的阴叶细胞数量。然而，该协议产生的标记细胞数量比之前发布的20个要多，这在图3A和视频1中显而易见。值得一提的是，由于注射的质粒液体在半球之间的分布方式，标记细胞的最高密度往往主要出现在两个半球的内侧、心室侧（图3A）。在视频1中，斑马鱼端脑的一个半球以3D形式呈现，从侧面可以看到具有径向过程的脑细胞。细胞被共电化，并标有两个质粒，tdTomato-mem（红色荧光蛋白固定在细胞膜上）和H2B-YFP质粒（标记核）。应注意用黄色圆圈包围的两个原子核的细胞分裂。
不成功的电穿孔导致数量非常低或没有标记的阴极细胞。这一结果通常可以通过不准确的注射来解释，其中毛细管的尖端不穿透背端阴膜细胞层。在这种情况下，质粒溶液扩散在背端阴膜细胞层之上，而不是填充端脑心室。这导致阴叶细胞被单独标记 （图 3B）。旁白细胞（图 3B中的蓝色箭头）在形态上与细胞（图 3A中的黄色箭头）在形态上有所不同。它们的躯体更大，长方体，它们不具有径向的拉长过程。这一点从比较阴白细胞层的侧视图（图4A，B）中可见一斑。TdTomato - mem 标记细胞最有可能是细胞，它们位于阴叶胶层之上（图 4B ）。相反，在图4A中，向个体的细胞中引入了表达质粒的tdTomato-mem。因此，除了最初的标记之外，他们还要表示tdTomato-mem（在本例中，转基因gfap：GFP鱼线，这里见白色）。
该协议允许标记和随后跟踪斑马鱼端脑细胞在短期或长期3段时间内受伤后的行为。这是通过活的，体内成像来完成的，并有助于解决他们在再生和神经发生中的作用问题。
图1：电化斑马鱼端塞的冠状部分的图式表示。（A） 斑马鱼端塞的冠状部分方案，突出心室细胞的位置，这些细胞在心室表面衬里，并建造心室壁。多端脑层是连接两个半球和覆盖心室（ V ），位于两个细胞层之间：和下脑。黑色箭头和眼睛表示视图如图2和图 3所示。（B） 左边是一张从上面拍摄的斑马鱼头的照片，用一条白色的虚线突出端塞法伦的位置。玻璃毛细管与毛细管插入的目标部位一起以红色表示。右图为斑马鱼大脑的示意图，显示以红色表示质粒注射的位置。需要注意的是，玻璃毛细管不接触端脑，质粒被注射在端脑素正上方进入心室。T = 端脑，OT = 光学技术。（C） 左图为斑马鱼头（侧视图）的照片，右侧是头部（侧视图）的描绘，显示电极的位置，以瞄准端塞龙。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：显示有效电穿孔结果的显微图。从上面看，成年斑马鱼端脑中电化细胞数量较小或（B）的三维表示。电穿孔在Tg（gfap：GFP）鱼线中进行，在所有细胞中表达GFP荧光蛋白（以白色表示）。单个电化细胞被贴上pCS2-tdTomato-mem质粒标签。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：共聚焦显微图，描绘了成功和不成功电穿孔之间的区别。（A） BABB清除斑马鱼telencephon（REF）的三维共聚焦图像，具有大量pCS-tdtomato-mem电化脑细胞。应注意具有长、长过程（黄色箭头）的细胞的形态。可以观察到两个端脑半球，用黄色虚线突出显示。（B） pCS2-tdTomato-mem 质粒电穿孔不成功的共聚焦图像。大多数背端的阴叶细胞被贴上标签，很少有阴叶细胞表达tdTomato-mem质粒。应注意阴叶细胞（蓝色箭头）形态的明显差异。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：电镀和非电镀基电池的三维横向视图。（A） 三维横向表示电化阴极细胞，对Tg（gfap：GFP）和pCS2-tdTomato-mem（黄色箭头）均呈阳性。（B） 不成功电穿孔的三维横向表示。应注意pCS2-tdTomato-mem阳性细胞在Tg（gfap：GFP）叶面胶质层上方的位置。最有可能的背端下阴层细胞被电镀（蓝色箭头）。比例尺 = 30 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
视频1：斑马鱼端脑和电镀脑细胞的3D电影。视频显示斑马鱼的一个半球在3D。Ependymoglial细胞与两个质粒共电：tdTomato-mem（固定在细胞膜上的红色荧光蛋白）和H2B-YFP质粒（标记核）。单独标记的叶面胶质与径向过程，可以从一边观察到。黄色圆圈突出显示阴囊细胞，线粒图由H2B-YFP标记染色质可视化。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
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Discussion
这种电穿孔方案是一种可靠的体内方法，用于标记单个细胞。该协议可能需要进一步适应，以标记其他细胞类型，如神经元或寡核苷酸细胞。为了获得成功的标签，可以使用含有不同促进剂的质粒。鸡-β蛋白促进剂，eF1α，CMV和泛素促进剂以前曾被用来驱动不同转基因在ependyglia及其后代23的表达。然而，观察到了不同转基因表达的动力学，这应当加以考虑。例如，CMV启动子驱动的转基因表达非常快（表达式在24小时后可以看到），而eF1alpha需要更长的时间。除了标签，电穿孔协议可以作为一个快速和直接的基因编辑平台，使用Cre重组酶或CRISPR Cas9技术22。此外，在细胞类型特异性 Cre 线中使用翻盖 25 -含质粒及其电穿孔，可以作为一种方法的明确延伸，允许在后产生的后代中进行标记或基因编辑。穿孔。
此协议有几个关键步骤。首先，在注射步骤中，实验需要小心注射的质粒量等于每只鱼，这样标记的细胞数量保持相当相似。这可以通过控制玻璃毛细管开口的大小来实现，这意味着每个毛细管之间的切头应保持不变，或者应针对每个单独的毛细管进行校准。此外，由脚踏板调节的喷射持续时间对于每个单独的喷射应该相同。其次，用微刀在头骨上打一个洞的正确位置对于将质粒液体在整个端脑中适当分散至关重要。同样重要的是，通过毛细管尖端穿透背端下阴膜细胞层，如协议所述。此外，还必须产生的孔不要太大，以防止质粒混合物和脑脊液从端脑中泄漏。另一个关键步骤是施加的电流强度。请务必确保电穿孔装置尽可能精确地工作，以便施加电流的强度不会与屏幕上出现的电压产生太大偏差，而电压并不总是准确的。如果这些值不一致，有必要调整电穿孔装置上的电流强度，因为高于建议的54-57 V的电流可能会损害鱼类的生存。
与现场常用的质粒输送和细胞标记方法相比，电穿孔具有明显的优势。尽管上面提到的关键步骤，它很少发生，没有电化细胞可以观察到或背端阴垂细胞被错误地电化。一般来说，这种电穿孔协议的成功率是90%-95%，电穿孔后我们几乎没观察到TUNEL+电池。与脂液形成相反，例如，在电穿孔期间，不使用阳离子脂质体（例如，脂质增胺），因此完全避免与其使用有关的毒性。此前有报道称，利泊和电穿孔具有同等的效率率（每端脑20-50个细胞）27。然而，这种优化的协议通常产生100-200个细胞每个端脑。与病毒载体相比，生物安全不是电穿孔的问题。
此外，常用的AAV或慢病毒在斑马鱼脑中不能产生可检测的转基因表达17、28。最后，虽然Cre-lox系统现在常用于斑马鱼，但质粒电穿孔速度更快，因为它不需要鱼的繁殖和生长所需的长时间等待，并允许单个细胞贴标和追踪。然而，这种技术需要高技能的科学家成功地实现电穿孔和高生存率的实验动物（我们通常体验到+70%-80%的存活率）。这个速率也倾向于根据实验者的波动。学习这个程序需要练习，通常需要三次试验。但是，这取决于个人的手动灵巧性，在某些情况下可能需要更长的时间。
提出的电穿孔方案是一种快速、高效的电穿孔方法，用于电穿孔大量细胞，并提供必要的预防措施，以获得最佳效果。成年斑马鱼端脑的电穿孔对于可视化个体脑细胞和研究其在神经发生和再生过程中的作用至关重要。最近，通过电穿孔和StagR-Cas9技术进行基因编辑，同时破坏成年斑马鱼端脑的多个基因，取得了成功。这为广泛的基因操作开启了电穿孔的多种可能性和未来应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
特别感谢詹姆斯·科普蒂编辑手稿。我们还感谢德国研究基金会 （DFG） 向 JN 提供的资金，由 SFB 870 和 SPP"嗅觉综合分析"和 SPP 1738"非编码 RNA 在神经系统开发、可塑性和疾病中的新作用"，SPP1757在慕尼黑系统神经学集群（EXC 2145 SyNergy – ID 390857198）框架内的胶质异质性"和卓越战略。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
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