Summary
المعروضة هنا هي طريقة الكهربائي لتسليم الحمض النووي بلازميد وتسمية الخلايا ependymoglial في telencephalon حمار وحشي الكبار. هذا البروتوكول هو وسيلة سريعة وفعالة لتصور وتتبع الخلايا الأيبندية الفردية ويفتح إمكانيات جديدة لتطبيق الكهربائي على مجموعة واسعة من التلاعبات الوراثية.
Abstract
الكهربائي هو طريقة التغوط التي يتم فيها تطبيق حقل كهربائي على الخلايا لخلق المسام المؤقتة في غشاء الخلية وزيادة نفاذية، مما يسمح لجزيئات مختلفة ليتم إدخالها إلى الخلية. في هذه الورقة، يتم استخدام الكهربائي لإدخال بلازميدات إلى الخلايا الاستئصالية، والتي خط المنطقة البطينية من الدماغ حمار وحشي الكبار. جزء من هذه الخلايا يظهر خصائص الخلايا الجذعية ويولد الخلايا العصبية الجديدة في الدماغ حمار وحشي. لذلك، دراسة سلوكهم أمر ضروري لتحديد أدوارهم في تكوين الأعصاب وتجديدها. إدخال بلازميدات عن طريق الكهربائي يتيح وضع العلامات على المدى الطويل وتتبع خلية واحدة ependymoglial. وعلاوة على ذلك، يمكن تسليم البلازميدات مثل Cre recombinase أو Cas9 إلى خلايا ependymoglial واحدة، والتي تمكن من إعادة تركيب الجينات أو تحرير الجينات ويوفر فرصة فريدة لتقييم وظيفة الجينات المستقلة للخلية في السيطرة عليها، الطبيعية البيئه. وأخيراً، يتم استخدام هذا البروتوكول الكهربائي المفصل خطوة بخطوة للحصول على إدخال ناجح للبلازميدات في عدد كبير من الخلايا الاستئصالية واحدة.
Introduction
حمار وحشي هي نماذج حيوانية ممتازة لفحص تجديد الدماغ بعد إصابة جرح طعنة. بالمقارنة مع الثدييات، على سلم التطور، والأنواع الأقل تطورا مثل حمار وحشي تظهر عموما معدلات أعلى من تكوين الأعصاب التأسيسية والمناطق الأوسع من سكن الخلايا الجذعية العصبية الكبار، مما يؤدي إلى توليد مستمر من الخلايا العصبية الجديدة في جميع أنحاء معظم مناطق الدماغ في حياة الكبار. ويبدو أن هذه الميزة ترتبط مع قدرة تجديدية أعلى بكثير من حمار وحشي بالمقارنة مع الثدييات1، كما حمار وحشي لديها إمكانات ملحوظة لتوليد الخلايا العصبية الجديدة بكفاءة في معظم نماذج إصابات الدماغ درس2، 3,4,5,6,7,8. هنا، يتم دراسة telencephalon سمك الحمار الوحشي، لأنها منطقة الدماغ مع تكوين الأعصاب بارزة في مرحلة البلوغ. هذه المناطق من تكوين الأعصاب الكبار هي متجانسة للمناطق العصبية في الدماغ الثدييات الكبار9،10،11.
المناطق العصبية وفيرة في telencephalon حمار وحشي موجودة بسبب وجود glia شعاعي مثل الخلايا أو خلايا ependymoglia. الخلايا الاستئصالية Ependymoglial بمثابة الخلايا الجذعية العصبية الكبار المقيمين ومسؤولة عن توليد الخلايا العصبية الجديدة في كل من الدماغ سليمة وتجديد3،5. وقد أظهرت تجارب تتبع النسب أن ependymoglia البطينية تتفاعل مع الإصابة، ثم تنتشر وتوليد الخلايا العصبية الجديدة التي تهاجر إلى موقع الآفة5. بسبب الطبيعة المتتربدة من الدماغ حمار وحشي، الخلايا ependymoglial خط السطح البطيني وبناء الجدار البطيني البطيني. يتكون الجدار البطيني الحويصلي من طبقة الخلايا الأورسية(الشكل 1A). الأهم من ذلك، تجسد ependymoglia حمار وحشي خصائص كل من الثدييات الغليا شعاعي والخلايا ependymal. العمليات شعاعي طويلة هي سمة نموذجية من خلايا غليا شعاعي، في حين أن ملحقات الخلوية وتقاطعات ضيقة (فضلا عن مواقفها البطينية) هي ملامح نموذجية من الخلايا ependymal12،13،14. لذلك، يشار إلى هذه الخلايا باسم الخلايا الإيبنموجلية.
لمتابعة في سلوك الجسم الحي من الخلايا ependymoglial واحدة أثناء التجدد، فإنها تحتاج إلى أن تكون وصفت بشكل موثوق. وقد سبق وصف أساليب مختلفة من وضع العلامات في الخلايا الحية للميكروسكوب الفلورسنت، مثل الصحفيين الذاتية أو الأصباغ lipophilic15. وقد تتطلب هذه الأساليب، على النقيض من الكهرباء، فترات زمنية أطول، وكثيراً ما لا تتيح إمكانية وضع علامات على خلية واحدة أو تتبع دائم طويل الأجل. الكهربة، ومع ذلك (إلى جانب وضع العلامات خلية واحدة)، ويوفر إمكانية إدخال الحمض النووي الجديد في الخلية المضيفة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع غيرها من أساليب نقل الحمض النووي في الخلايا، وقد ثبت الكهربائي لتكون واحدة من أكثر الطرق كفاءة16،17،18،19.
يعرض هنا بروتوكول الكهربائي الذي تم صقله لغرض وضع العلامات على الخلايا ependymoglial واحدة في telencephalon حمار وحشي الكبار. يسمح هذا البروتوكول بوضع العلامات على الخلايا الأيبنموغلية واحدة من أجل متابعتها على مدى فترة طويلة الأجل20 أو للتعامل مع مسارات محددة بطريقة الخلية المستقلة21،22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول في ظل ظروف تربية موحدة، وأجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح من اولة الاتحاد الأوروبي وحكومة بافاريا العليا (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. إعداد خليط البلازميد للكهرباء
- تمييع بلازميد الاهتمام بالماء المعقم وإضافة حل سريع للمرقة الخضراء وصمة عار [1 ملغ /مل]. تأكد من أن التركيز النهائي للبلازميد هو 1 ميكروغرام/لتر.
- بمجرد إعداده، قم بخلط محلول البلازميد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات أو عن طريق التنصت على الأصابع. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الاستخدام.
ملاحظة: للكهرباء المشتركة لاثنين من البلازميدات في نفس الخلية، تأكد من أن تركيز كل بلازميد الفردية المستخدمة في الخليط هو على الأقل 0.8 نانوغرام / ميكرولتر مع نسبة الأضراس من 1:1 للحصول على كفاءة الكهرباء المشتركة 80٪-90٪.
2. الاستعدادات لإجراء الحقن والكهرباء
- إعداد الشعيرات الدموية الزجاجية (القطر الخارجي 1 ملم، القطر الداخلي 0.58 مم) اللازمة للحقن في جهاز سحب إبرة.
- من أجل حقن الكمية الصحيحة من بلازميد (انظر أعلاه)، وسحب الشعرية في درجة حرارة 68.5 درجة مئوية مع اثنين من الضوء واثنين من الأوزان الثقيلة (انظر جدول المواد لمواصفات الساحبة).
ملاحظة: في حالة استخدام سحب مختلفة، معايرة الشعرية لتقديم الحجم المناسب من مزيج الكهربائي. - تعيين جهاز الحقن يدويا إلى ضغط حقن من 200 هبأ (عن طريق تحويل مقبض بي) والضغط المستمر من 0 هبأ. تعيين وقت الحقن يدويا لوضع يدوي والسيطرة على الضغط مع دواسة القدم.
- قم بتعيين جهاز الكهرباء إلى "وضع LV" مع خمسة نبضات في 54-57 فولت (25 مللي ثانية لكل منها فواصل زمنية 1 ثانية). قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بالجهاز.
- إعداد خزان سمك واحد مع مياه السمك النظيفة، حيث سيتم إيقاظ الأسماك من التخدير بعد إجراء الكهربائي. تُنير المياه عن طريق إبقاء حجر الهواء الملحق بمضخة الهواء طوال فترة التعافي حتى تستيقظ الأسماك بالكامل.
- خذ اسفنجة المطبخ العادية وجعل قطع طولية في الاسفنجة لعقد الأسماك في أثناء عملية الحقن والكهرباء (انظر المنشور السابق3).
ملاحظة: وينبغي غسل اسفنجة المطبخ بانتظام أو تبادلها من أجل إزالة المواد الكيميائية السامة المحتملة. - وضع كمية صغيرة من الموجات فوق الصوتية متعددة الأغراض موصل للغاية هلام بجوار الإعداد حقن والكهربائي.
ملاحظة: وهذا يضمن الموصلية الكهربائية الكافية، وبالتالي، توزيع الخلايا الكهربائية في جميع أنحاء telencephalon كامل.
3. تخدير سمك الحمار الوحشي
- قبل التخدير، وإعداد محلول مخزون التخدير مع 0.2٪ MS222 في الماء المقطر وضبط درجة الحموضة إلى 7 مع تريز-حمض الهيدروكلوريك العازلة. تخفيف هذا المخزون 1:10 (أي إلى 0.02٪ MS222) باستخدام مياه السمك.
- التخدير الأسماك عن طريق الاحتفاظ بها في هذا الحل العمل حتى تتراجع حركة الجسم والخياشيم (عادة لبضع دقائق).
4. حقن محلول بلازميد
- ملء الشعرية الزجاج المعدة مع 10 ميكرولتر من محلول بلازميد باستخدام نصائح microloader. تجنب تشكيل فقاعات الهواء داخل الشعرية.
- اضغط على القائمة / تغيير الشعرية على جهاز الحقن. إدراج وتأمين الإبرة في حامل الإبرة.
- تحت مجهر مجسم مع التكبير من 3.2x أو 4X، وقطع فقط غيض من الشعرية باستخدام ملقط نهاية غرامة. تبديل جهاز الحقن من تغيير وضع الشعرية في وضع الحقن، ثم تطبيق الضغط مع دواسة القدم للتأكد من أن الحل بلازميد يعمل بسهولة من الإبرة ودون عائق.
- نقل الأسماك من خزان تربية إلى الحاوية (مربع من البلاستيك) مع محلول التخدير. انتظر لبضع دقائق حتى تهدأ حركة الخياشيم.
- ضع السمك في الاسفنجة المبللة مسبقاً مع الجانب الظهري الذي يواجه. تنفيذ جميع خطوات الحقن التالية تحت المجهر المجسم لضمان دقة الإجراء.
- باستخدام تشريح سكين صغير من الفولاذ المقاوم للصدأ مع 40 ملم حافة القطع وسمك 0.5 ملم، وخلق ثقب صغير في جمجمة الأسماك في الجانب الخلفي من telencephalon(الشكل 1B)،بجوار الحدود مع tectum البصرية.
ملاحظة: وينبغي تنفيذ هذه الخطوة بعناية منذ ثقب ينبغي أن تكون صغيرة جدا وسطحية، واختراق الجمجمة فقط، لتجنب تلف الدماغ. - إمالة الأسماك حسب الضرورة وتوجيه غيض من الشعرية الزجاجية نحو الجمجمة في الزاوية الصحيحة لتسهيل اختراق طرف الشعرية من خلال الحفرة.
- أدخل طرف الشعرية من خلال الثقب في الجمجمة بعناية حتى تصل إلى البطين الذيلاي (انظر الشكل 1B). وهذا يتطلب اختراق من خلال طبقة الخلايا الأوردية ependymal. يجب الحرص بشكل خاص على عدم إدراج الشعرية بعمق شديد لتجنب الاتصال مع أنسجة الدماغ. الحفاظ على الشعرية على وجه التحديد بين نصفي الكرة الأرضية، والبقاء داخل البطين فقط بعد ثقب طبقة ependymal الظهرية.
ملاحظة: وهذه خطوة حساسة جدا. يتم تحسين دقة هذا الإجراء باستخدام خطوط متحولة تصبغ مثل النحاسية24،مما يسمح أفضل التصور من موقف الشعرية الزجاج أثناء الحقن. - مع طرف الشعرية داخل البطين، حقن الحل بلازميد عن طريق تطبيق الضغط مع دواسة القدم لحوالي 10 ثانية، والذي يتوافق مع ما يقرب من 1 ميكرولتر من محلول بلازميد.
ملاحظة: إذا كان تغيير سحب إبرة، الشعيرات الدموية أو حاقن، ينبغي معايرة النظام من أجل تقديم دائما 1 ميكرولتر من محلول بلازميد. ويمكن إجراء المعايرة عن طريق قياس قطر قطرات البلازميد التي تُطرد إلى زيت معدني (مثل زيت البارافين) ثم حساب حجم القطرة. بعد 10 ثانية من الحقن، يجب أن يكون هناك ~ 1 ميكرولتر من سائل بلازميد طرد إلى الزيت المعدني. - تأكيد نجاح الخطوة السابقة من خلال مراقبة انتشار السائل في جميع أنحاء البطين.
5. الكهربائي
- إزالة الأسماك من حقن الإعداد في حين لا يزال عقد في الاسفنجة.
- تزج الجانب الداخلي من طرف الأقطاب الكهربائية في هلام الموجات فوق الصوتية.
- تغطية telencephalon الأسماك مع كمية صغيرة من هلام الموجات فوق الصوتية.
- وضع رأس السمك بين الأقطاب الكهربائية، ووضع القطب الإيجابي في الجانب البطني من رأس السمكة والقطب السلبي على الجانب الظهري(الشكل 1C)،في حين لا يزال عقد جسم السمكة في الاسفنجة. هذا يحدد اتجاه تدفق الحالية اللازمة لependymoglia الكهربائي المتمركزة في منطقة تحت البطين.
- اضغط على الأقطاب الكهربائية بلطف وعلى وجه التحديد ضد telencephalon(الشكل 1C). إدارة التيار مع دواسة القدم. عقد الأقطاب الكهربائية في مكان حتى يتم الانتهاء من جميع البقول الخمسة.
6. استعادة الأسماك
- دع السمك يتعافى في الخزان الذي تم إعداده من قبل، ومنهك باستمرار حتى يستيقظ. يمكن تطبيق هلام ليدوكائين على الجمجمة من أجل تخفيف أي ألم ربما وضعت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طريقة الكهربائي الموصوفة يسمح تسليم الحمض النووي بلازميد في الخلايا ependymoglial، والتي تقع بشكل سطحي في telencephalon حمار وحشي وتحت طبقة الخلايا الأوردية ependymal(الشكل 1A).
إذا كانت نتيجة الكهربائي إيجابية، وصفت الخلايا ependymoglial واحدة (الخلايا الحمراء في الشكل 2A، B)يمكن ملاحظتها بين الخلايا الأيبنديموجلية الأخرى (أبيض في الشكل 2A، B). اعتمادا على كفاءة عملية الكهربائي، قد يكون هناك عدد أعلى(الشكل 2A)أو أقل(الشكل 2B)من الخلايا الependymoglial. ومع ذلك، ينتج عن هذا البروتوكول عدد أكبر من الخلايا المسماة من20المنشورة سابقا ، وهو واضح في الشكل 3A والفيديو 1. ومن الجدير بالذكر أن أعلى كثافة من الخلايا المسماة تميل إلى الظهور في الغالب في الجانب الداخلي البطيني لكلا نصفي الكرة الأرضية(الشكل 3A)،وذلك بسبب الطريقة التي يوزع بها السائل البلازميد المحقون بين نصفي الكرة الأرضية. في الفيديو 1، يتم تقديم نصف الكرة الأرضية واحد من telencephalon حمار وحشي في 3D ، ويمكن رؤية الخلايا ependymoglial مع عمليات شعاعي من الجانب. الخلايا هي الكهروية المشتركة ووصفت مع اثنين من بلازميدات، tdTomato-ميم (بروتين الفلورسنت الأحمر الراسية في غشاء الخلية) وH2B-YFP plasmid (وضع العلامات النووية). وتجدر الإشارة إلى تقسيم الخلايا لنوتين محاطتين بدوائر صفراء.
ينتج عن الكهرباء غير الناجحة عدد منخفض جداً أو لا تسمى الخلايا ependymoglial. ويمكن تفسير هذه النتيجة عموما عن طريق الحقن غير دقيقة، والتي غيض من الشعرية لا تخترق طبقة الخلايا الانبوية الظهرية. في هذه الحالة، ينتشر محلول بلازميد فوق طبقة الخلايا الاستئصالية الظهرية بدلاً من ملء البطين الخلوي. وهذا يؤدي إلى الخلايا ependymal فقط يجري المسمى(الشكل 3B). تختلف الخلايا الأوردية (الأسهم الزرقاء في الشكل 3B)من الناحية الشكلية عن الخلايا الإيبندية (السهم الأصفر في الشكل 3A). سوما أكبر ومستطيلة، وأنها لا تمتلك شعاعي، عمليات ممدود. ويتضح ذلك من مقارنة عرض جانبي لطبقة الخلايا الـ ependymoglial(الشكل 4A, B). TdTomato-mem الخلايا المسماة هي على الأرجح الخلايا ependymal، والتي تقع فوق طبقة من ependymoglia(الشكل 4B). في المقابل، في الشكل 4A، يتم إدخال tdTomato-mem التعبير عن بلازميد إلى الخلايا الاستئصالية الفردية. وهكذا، فإنها تعبر عن tdTomato-mem بالإضافة إلى وضع العلامات الأولية (في هذه الحالة، gfap المعدلة وراثيا: GFP خط السمك، ينظر هنا باللون الأبيض).
ويمكّن هذا البروتوكول من وضع العلامات وما يليها من سلوك الخلايا الإموغلية في الدماغ الوحشي بعد الإصابة على مدى فترة قصيرةأو طويلة الأجل مدتها3 سنوات. ويتم ذلك من خلال العيش، في التصوير الحي ويساعد على معالجة مسألة أدوارهم في التجدد والتكوين العصبي.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للجزء الإكليلي من الدماغ الوحشي الذي تم قطعه. (أ)مخطط قسم إكليلي من الدماغ الوحشي، وتسليط الضوء على موقف الخلايا الاستئصالية، والتي هي بطانة سطح البطين وبناء الجدار البطيني البطيني البطيني. الطبقة الأوردية ependymal هو سد نصفي الكرة الأرضية وتغطي البطين (V)، وتقع بين طبقتين الخلية: ependymoglial وependymal. السهم الأسود وتمثيل العين تشير إلى عرض مبينة في الشكلين 2 و الشكل 3. (ب)على اليسار، صورة رأس حمار وحشي مأخوذة من فوق، وتسليط الضوء على موقف telencephalon مع خط متقطع أبيض. يتم تصوير الشعرية الزجاجية باللون الأحمر، جنبا إلى جنب مع الموقع المستهدف للإدراج الشعرية. في الصورة على اليمين هو مخطط من الدماغ حمار وحشي تبين موقف حقن بلازميد باللون الأحمر. وتجدر الإشارة إلى أن الشعرية الزجاجية لا تلمس الدماغ وأن البلازميد يتم حقنه فوق الدماغ في البطين مباشرة. T = telencephalon، OT = tectum البصرية. (ج)يصور على اليسار صورة رأس حمار وحشي (عرض جانبي)، وعلى اليمين هو تصوير للرأس (وجهة نظر جانبية) تبين موقف الأقطاب الكهربائية من أجل استهداف telencephalon. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الميكروغرافيا التي تبين النتائج الفعالة للكهرباء. تمثيل ثلاثي الأبعاد من(أ)أكبر أو(ب)عدد أصغر من الخلايا الإيبنديمولية الكهربائية في الدماغ حمار وحشي الكبار، كما ينظر إليها من فوق. تم إجراء الكهربائي فيTg (gfap:GFP)خط السمك التعبير عن البروتين الفلورسنت GFP (يصور باللون الأبيض) في جميع الخلايا ependymoglial. وصفت الخلايا الكهربائية الفردية مع pCS2-tdTomato-mem بلازميد3. قضبان مقياس = 50 درجة.
الشكل 3: الميكروغرافيا البؤرية التي تصور الفرق بين الكهربة الناجحة وغير الناجحة. (أ)صورة ثلاثية الأبعاد للدماغ الوحشي (REF) مع عدد كبير من الخلايا الأيبنديموغلية الكهربائية pCS-tdTomato-mem. وينبغي ملاحظة مورفولوجيا الخلايا الإلسطية مع عمليات طويلة وممدود (الأسهم الصفراء). ويمكن ملاحظة كلا نصفي الكرة الأرضية، اللذين تم إبرازهما بخطوط متقطعة صفراء. (ب)صورة محورية للكهرباء غير الناجحة من pCS2-tdTomato-mem بلازميد. يتم وضع العلامات على الخلايا الاستئصالية الظهرية في الغالب، والقليل من الخلايا الاستئصالية تعبر عن tdTomato-mem plasmid. وينبغي ملاحظة الفرق الواضح في مورفولوجيا الخلايا الإيبندية (الأسهم الزرقاء). قضبان مقياس = 50 درجة.
الشكل 4: وجهات النظر الجانبية ثلاثية الجوانب للخلايا الإيبندموغلية الكهروية وغير الكهروية. (A)التمثيل الجانبي ثلاثي الأبعاد الخلايا الإيبنديموغلية، إيجابية لكل منTg (gfap:GFP)وpCS2-tdTomato-mem (السهم الأصفر). (B)التمثيل الجانبي 3D من الكهربائي غير ناجحة. وتجدر الإشارة إلى موقع الخلايا الإيجابية pCS2-tdTomato-mem فوق Tg(gfap:GFP)طبقة ependymoglia. على الأرجح كانت خلايا الطبقة الأوردية ependymal الكهربائي (السهم الأزرق). قضبان مقياس = 30 درجة.
فيديو 1: فيلم 3D من telencephalon حمار وحشي والخلايا الإيبنديمولية الكهربائي. فيديو يظهر نصف الكرة الأرضية واحد من telencephalon سمك الحمار الوحشي في 3D. الخلايا الاستئصالية هي الكهروية المشتركة مع اثنين من البلازميدات: tdTomato-mem (بروتين الفلورسنت الأحمر الراسية في غشاء الخلية) وH2B-YFP plasmid (وضع العلامات النووية). وصفت بشكل فردي ependymoglia مع عمليات شعاعي التي يمكن ملاحظتها من جانبا. الدوائر الصفراء تسليط الضوء على الخلية ependymoglial مع الرقم mitotic تصورها H2B-YFP المسمى الكروماتين. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول الكهربائي هو موثوق بها في طريقة الجسم الحي من وضع العلامات على الخلايا الأيبنموجلية الفردية. قد يحتاج البروتوكول إلى مزيد من التكيف لتسمية أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا العصبية أو oligodendrocytes. ولتحقيق وضع العلامات الناجحة، يمكن استخدام البلازميدات التي تحتوي على مروّجين مختلفين. الدجاج بيتا أكتين المروج، eF1alpha، CMV والمروج ubiquitin وقد استخدمت سابقا لدفع التعبير عن الجينات المختلفة في ependymoglia وذريتهم23. ومع ذلك، لوحظت حركية مختلفة للتعبير عبر الجينات التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. على سبيل المثال، CMV المروج مدفوعة التعبير transgene سريع جدا (يمكن أن ينظر إلى التعبير بعد 24 ساعة)، في حين eF1alpha يستغرق وقتا أطول. وبصرف النظر عن وضع العلامات، يمكن استخدام بروتوكول الكهربائي كمنصة سريعة ومباشرة لتحرير الجينات مع استخدام تقنيات Cre recombinase أو CRISPR Cas922. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الكاسيت الانعكاسي25- المحتوي على البلازميدات والكهرباء في خطوط Cre الخاصة بالنوع الخلوي قد يكون بمثابة امتداد واضح لطريقة تسمح بوضع العلامات أو تحرير الجينات في السلالة الاستئصالية التي يتم توليدها بعد الكهربائي.
يحتوي هذا البروتوكول على عدة خطوات هامة. أولا، خلال خطوة الحقن، يجب أن يكون التجريبي ة حذرا من أن كمية البلازميد المحقونة متساوية لكل سمكة على حدة، بحيث يظل عدد الخلايا الموسومة متشابها ً نسبياً. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق التحكم في حجم فتحة الشعرية الزجاجية، وهذا يعني أن قطع كل طرف ينبغي أن تكون ثابتة بين الشعيرات الدموية المختلفة أو ينبغي إجراء المعايرة لكل الشعرية الفردية. بالإضافة إلى ذلك, مدة الحقن, تنظمها دواسة القدم, ينبغي أن تكون هي نفسها لكل حقن الفردية. ثانيا، الوضع الصحيح لثقب في الجمجمة مصنوعة من سكين صغير أمر بالغ الأهمية لتشتت السليم من السائل بلازميد في جميع أنحاء telencephalon. من المهم بنفس القدر اختراق طبقة الخلايا الدبية مع طرف الشعرية، كما هو مذكور في البروتوكول. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري أيضا أن الثقب الذي تم إنشاؤه ليس كبيرا جدا لمنع خليط بلازميد والسائل النخاعي من التسرب من الدماغ. خطوة حاسمة أخرى هي قوة التيار الكهربائي المطبق. من المهم التأكد من أن جهاز الكهربائي يعمل بأكبر قدر ممكن من الدقة، بحيث لا تحيد قوة التيار المطبق كثيرا عن الجهد الذي يظهر على الشاشة، والتي ليست دائما دقيقة. إذا كانت هذه القيم غير متسقة، فمن الضروري ضبط قوة التيار على جهاز الكهربائي، لأن التيار تدار أعلى من 54-57 V الموصى بها قد يعرض للخطر بقاء الأسماك.
وبالمقارنة مع الأساليب الأخرى لتسليم البلازميد ووضع العلامات على الخلايا التي يشيع استخدامها في هذا المجال، فإن الإلكتروبوريشن له مزايا واضحة. على الرغم من الخطوات الحرجة المذكورة أعلاه، فإنه يحدث نادرا جدا أنه لا يمكن ملاحظة الخلايا الكهربائية أو أن الخلايا الانبوية الظهرية يتم عن طريق الخطأ الكهربائي. عموما، فإن معدل نجاح هذا البروتوكول الكهربائي هو 90٪ -95٪ ونحن نلاحظ تقريبا أي خلايا TUNEL + بعد الكهربائي. على النقيض من lipofection على سبيل المثال، أثناء الكهرباء، لا تستخدم liposomes الموجبة (على سبيل المثال، lipofectamine) وبالتالي يتم تجنب السمية المتصلة باستخدامه تماما26. وقد أفيد في وقت سابق أن lipofection والكهربائي لديها معدلات كفاءة متساوية (20-50 خلية لكل telencephalon)27. ومع ذلك، ينتج هذا البروتوكول الأمثل بشكل عام 100-200 خلية لكل telencephalon. وبالمقارنة مع النواقل الفيروسية، فإن السلامة الأحيائية ليست مشكلة تتعلق بالكهرباء.
وبالإضافة إلى ذلك، عادة ما تستخدم AAVs أو الفيروسات اللينة تفشل في إنتاج التعبير القابل للكشف من الجينات في الدماغ حمار وحشي17،28. وأخيرا، على الرغم من أن نظام Cre-lox يستخدم عادة في الوقت الحاضر في سمك الحمار الوحشي، فإن البلازميد الكهربائي أسرع لأنه لا يتطلب فترات انتظار طويلة ضرورية لتربية الأسماك وزراعتها ويسمح بوضع العلامات الفردية على الخلايا وتعقبها. ومع ذلك، تتطلب هذه التقنية علماء ذوي مهارات عالية لتحقيق الكهرباء الناجحة ومعدلات البقاء على قيد الحياة عالية من الحيوانات التجريبية (نحن عادة ما تواجه معدلات البقاء على قيد الحياة من ~ 70٪ -80٪). هذا المعدل يميل أيضا إلى التقلب اعتمادا على المجرب. يتطلب تعلم الإجراء ممارسة وعادة ما يستغرق ثلاث تجارب. ومع ذلك، هذا يعتمد على البراعة اليدوية للفرد وقد يستغرق وقتاً أطول في بعض الحالات.
بروتوكول الكهربائي المقدمة هي طريقة سريعة وفعالة للغاية لالكهربائي ة عدد كبير من الخلايا ependymoglial مع الاحتياطات اللازمة للحصول على النتائج المثلى. الكهربائي من telencephalon حمار وحشي الكبار أمر بالغ الأهمية لتصور الخلايا الاستئصالية الفردية ودراسة أدوارها في تكوين الأعصاب وعمليات التجديد. في الآونة الأخيرة، تم تحقيق النجاح في تعطيل في وقت واحد من الجينات متعددة من telencephalon حمار وحشي الكبار من خلال تحرير الجينات عن طريق الكهربائي وتقنيات StagR-Cas922. وهذا يفتح العديد من الاحتمالات والتطبيقات المستقبلية للكهرباء لمجموعة واسعة من التلاعبات الوراثية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
شكر خاص لجيمس قبطي لتحرير المخطوطة. كما نعرب عن امتناننا للتمويل المقدم إلى JN من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) من قبل SFB 870 وSPP "التحليل التكاملي للOlfaction" و SPP 1738 "الأدوار الناشئة من RNAs غير الترميز في تطوير الجهاز العصبي واللدونة والمرض"، SPP1757 " عدم تجانس جليال"، واستراتيجية التميز في إطار مجموعة ميونيخ لأنظمة علم الأعصاب (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
