Summary
Presentato qui è un metodo di elettroporazione per la consegna di DNA plasmide e l'etichettatura delle cellule ependymoglial nel telecefalo di pesce zebra adulto. Questo protocollo è un metodo rapido ed efficiente per visualizzare e tracciare singole cellule ependymoglial e apre nuove possibilità di applicare l'elettroporazione a un'ampia gamma di manipolazioni genetiche.
Abstract
L'elettroporazione è un metodo di trasfezione in cui un campo elettrico viene applicato alle cellule per creare pori temporanei in una membrana cellulare e aumentarne la permeabilità, consentendo così l'introduzione di diverse molecole nella cellula. In questo documento, l'elettroporazione viene utilizzata per introdurre il plasmidia alle cellule ependymoglial, che allineano la zona ventricolare del telencephalon del pesce zebra adulto. Una frazione di queste cellule mostra le proprietà delle cellule staminali e genera nuovi neuroni nel cervello del pesce zebra; Pertanto, studiare il loro comportamento è essenziale per determinare i loro ruoli nella neurogenesi e rigenerazione. L'introduzione di plasmidi tramite elettroporazione consente l'etichettatura e il tracciamento a lungo termine di una singola cellula ependymoglial. Inoltre, plasmidi come Cre ricombinase o Cas9 possono essere consegnati a singole cellule ependymoglial, il che consente la ricombinazione genica o l'editing genico e fornisce un'opportunità unica per valutare la funzione genica autonoma della cellula in un l'ambiente. Infine, questo protocollo dettagliato di elettroporazione passo-passo viene utilizzato per ottenere l'introduzione di successo di plasmidi in un gran numero di singole cellule ependymoglial.
Introduction
I pesci zebra sono eccellenti modelli animali per esaminare la rigenerazione cerebrale dopo una lesione da taglio. Rispetto ai mammiferi, sulla scala evolutiva, le specie meno evolute come il pesce zebra mostrano generalmente tassi più elevati di neurogenesi costitutiva e aree più ampie di residenza delle cellule staminali neurali adulte, portando a una generazione costante di nuovi neuroni in tutto la maggior parte delle aree cerebrali nella vita adulta. Questa caratteristica sembra correlare con una capacità rigenerativa significativamente più elevata del pesce zebra rispetto ai mammiferi1, poiché i pesci zebra hanno un notevole potenziale per generare in modo efficiente nuovi neuroni nella maggior parte dei modelli di lesioni cerebrali studiati2, 3,4,5,6,7,8. Qui, il telecefalo del pesce zebra è studiato, poiché è una zona del cervello con neurogenesi prominente in età adulta. Queste zone di neurogenesi adulta sono omologhe alle zone neurogeniche nel cervello dei mammiferi adulti9,10,11.
Abbondanti aree neurogeniche nel telencephalon del pesce zebra sono presenti a causa dell'esistenza di glia radiali come cellule o cellule ependymoglia. Le cellule ependymogliali agiscono come cellule staminali neurali adulte residenti e sono responsabili della generazione di nuovi neuroni sia nel cervello intatto che in quello rigenerante3,5. Esperimenti di tracciamento del lignaggio hanno dimostrato che l'ependymoglia ventricolare reagisce alle lesioni, quindi prolifera e genera nuovi neuroblasti che migrano al sito di lesione5. A causa della natura eversadela del telecefalo del pesce zebra, le cellule ependymogliali allineano la superficie ventricolare e costruiscono la parete ventricolare ventrale. La parete ventricolare dorsale è formata da uno strato di cellule ependymal dorsale (Figura 1A). È importante sottolineare che il pesce zebra ependymoglia incarna le caratteristiche della glia radiale dei mammiferi e delle cellule ependymal. I lunghi processi radiali sono una caratteristica tipica delle celle radiali glia, mentre le estensioni cellulari e le giunzioni strette (così come le loro posizioni ventricolari) sono caratteristiche tipiche delle cellule ependymal12,13,14. Pertanto, queste cellule sono indicate come cellule ependymoglial.
Per seguire il comportamento in vivo delle singole cellule ependymoglial durante la rigenerazione, devono essere etichettate in modo affidabile. Sono stati descritti in precedenza vari metodi di etichettatura cellulare in vivo per la microscopia fluorescente, come i giornalisti endogeni o i coloranti lipofili15. Questi metodi, a differenza dell'elettroporazione, possono richiedere periodi di tempo più lunghi e spesso non offrono la possibilità di etichettatura a cella singola o di tracciamento permanente a lungo termine. L'elettroporazione, tuttavia (oltre all'etichettatura a singola cellula), offre la possibilità di introdurre nuovo DNA nella cellula ospite. Inoltre, rispetto ad altri metodi di trasferimento del DNA nelle cellule, l'elettroporazione è stata dimostrata essere uno dei metodi più efficienti16,17,18,19.
Presentato qui è un protocollo di elettroporazione che è stato perfezionato allo scopo di etichettare singole cellule ependymoglial nel telecefalo di zebra per adulti. Questo protocollo consente l'etichettatura di singole cellule ependymoglial per seguirle per un periodo20 a lungo termine o per manipolare percorsi specifici in modo cellulare-autonomo21,22.
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Protocol
Tutti gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati tenuti in condizioni di allevamento standard, e gli esperimenti sono stati effettuati secondo le linee guida e i regolamenti di gestione dell'UE e del governo della Baviera superiore (Az 55.2-1-54-2532-0916).
1. Preparazione della miscela di plasmide per l'elettroporazione
- Diluire il plasmide di interesse per l'acqua sterile e aggiungere veloce soluzione di scorta di macchie verdi [1 mg/mL]. Assicurarsi che la concentrazione finale del plasmipro sia di 1 g/l. Aggiungere la macchia ad una concentrazione non superiore al 3%, poiché il suo unico scopo è colorare la soluzione e visualizzare l'iniezione ventricolare.
- Una volta preparata, mescolare la soluzione plasmide pipetting su e giù più volte o toccando il dito. Conservare a temperatura ambiente (RT) fino all'utilizzo.
NOT: Per la coelettroporrazione di due plasmidi nella stessa cellula, assicurarsi che la concentrazione di ogni singolo plasmide utilizzato nella miscela sia di almeno 0,8 ng/L con un rapporto molare di 1:1 per ottenere un'efficienza di coelettrolazione 80%–90%.
2. Preparativi per la procedura di iniezione ed elettroporazione
- Preparare i capillari di vetro (diametro esterno 1 mm, diametro interno 0,58 mm) necessari per l'iniezione nell'apparato di trazione dell'ago.
- Al fine di iniettare la giusta quantità di plasmide (vedi sopra), tirare il capillare ad una temperatura di 68,5 gradi centigradi con due pesi leggeri e due pesanti (vedere Tabella dei materiali per le specifiche dell'emittente).
NOT: Nel caso in cui venga utilizzato un tiratore diverso, calibrare il capillare per fornire il volume appropriato della miscela di elettroporazione. - Impostare manualmente il dispositivo di iniezione su una pressione di iniezione di 200 hPa (ruotando la manopola Pi) e una pressione costante di 0 hPa. Impostare manualmente il tempo di iniezione in modalità manuale e controllare la pressione con il pedale del piede.
- Impostare il dispositivo di elettroporazione su "modalità LV" con cinque impulsi a 54-57 V (25 ms ciascuno con intervalli di 1 s). Collegare gli elettrodi al dispositivo.
- Preparare un acqua di pesce con acqua di pesce pulita, dove il pesce sarà risvegliato dall'anestesia dopo la procedura di elettroporazione. Aerare l'acqua mantenendo la pietra d'aria attaccata alla pompa dell'aria per l'intero periodo di recupero fino a quando il pesce è completamente risvegliato.
- Prendere una normale spugna da cucina e fare un taglio longitudinale nella spugna per tenere i pesci durante la procedura di iniezione ed elettroporazione (vedi precedente pubblicazione3).
NOT: La spugna da cucina deve essere regolarmente lavata o sostituita al fine di rimuovere potenziali sostanze chimiche tossiche. - Posizionare una piccola quantità di gel ad ultrasuoni multiuso altamente conduttivo accanto alla configurazione di iniezione ed elettroporazione.
NOT: Ciò garantirà un'adeguata conduttività elettrica e, di conseguenza, la distribuzione delle cellule elettroporate in tutto il telecefalo.
3. Anestesia di pesce zebra
- Prima dell'anestesizzazione, preparare una soluzione di riserva di anestesia con 0,2% MS222 in acqua distillata e regolare il pH a 7 con buffer Tris-HCl. Diluire questo stock 1:10 (cioè a 0,02% MS222) utilizzando acqua di pesce.
- Anestesizzare i pesci tenendoli in questa soluzione di lavoro fino a quando il movimento del corpo e delle branchie non si placa (tipicamente per un paio di minuti).
4. Iniezione di soluzione Plasmid
- Riempire il capillare di vetro preparato con 10 gradi l di soluzione plasmide utilizzando punte di microloader. Evitare la formazione di bolle d'aria all'interno del capillare.
- Premere Menu/Cambia Capillare sul dispositivo di iniezione. Inserire e fissare l'ago nel supporto dell'ago.
- Sotto uno stereoscopio con un ingrandimento di 3.2x o 4x, tagliare solo la punta del capillare utilizzando pinze fine-end. Cambia il dispositivo di iniezione dalla modalità Cambia Capillary in modalità Iniettare, quindi applica la pressione con un pedale per assicurarti che la soluzione plasmide esca facilmente dall'ago e senza ostacoli.
- Trasferire il pesce dalla vasca di allevamento al contenitore (scatola di plastica) con soluzione anestetica. Attendere qualche minuto fino a quando il movimento delle branchie si placa.
- Posizionare il pesce nella spugna pre-bagnata con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Eseguire tutte le seguenti fasi di iniezione sotto lo stereomicroscopio per garantire l'accuratezza della procedura.
- Utilizzando un microcoltello dissezionante in acciaio inossidabile con un tagliente di 40 mm e uno spessore di 0,5 mm, creare un piccolo foro nel cranio del pesce sul lato posteriore del telencephalon (Figura 1B), proprio accanto al bordo con tectum ottico.
NOT: Questo passaggio deve essere eseguito con attenzione poiché il foro dovrebbe essere molto piccolo e superficiale, penetrando esclusivamente nel cranio, per evitare danni cerebrali. - Inclinare il pesce in base alle esigenze e orientare la punta del vetro capillare verso il cranio nell'angolo corretto per facilitare la penetrazione della punta capillare attraverso il foro.
- Inserire la punta del capillare attraverso il foro nel cranio con attenzione fino a raggiungere il ventricolo telencefalico (vedere Figura 1B). Ciò richiederà penetrazione attraverso lo strato cellulare ependymal dorsale. Prestare particolare attenzione a non inserire il capillare troppo profondamente per evitare il contatto con il tessuto cerebrale. Mantenere il capillare esattamente tra gli emisferi, rimanendo all'interno del ventricolo subito dopo aver perforato lo strato ependilmale dorsale.
NOT: Questo è un passo molto delicato. L'accuratezza di questa procedura è migliorata utilizzando linee mutanti di pigmentazione come brassy24, consentendo una migliore visualizzazione della posizione capillare del vetro durante l'iniezione. - Con la punta capillare all'interno del ventricolo, iniettare la soluzione plasmide applicando pressione con il pedale per circa 10 s, che corrisponde a circa 1 -L di soluzione plasmide.
NOT: Se si cambia l'ape puller, i capillari o l'iniettore, il sistema deve essere calibrato in modo da fornire sempre 1 l'impianto di soluzione plasmide. La calibrazione può essere eseguita misurando il diametro della goccia plasmide espulsa in un olio minerale (ad esempio, l'olio di paraffina) e successivamente calcolando il volume della goccia. Dopo 10 s di iniezione, ci dovrebbe essere 1 l di liquido plasmide espulso nell'olio minerale. - Confermare il successo del passo precedente osservando la diffusione del liquido in tutto il ventricolo.
5. Elettroporazione
- Rimuovere il pesce dal set-up iniezione mentre ancora tenendolo nella spugna.
- Immergere il lato interno della punta degli elettrodi nel gel ad ultrasuoni.
- Coprire il telecefalo di pesce con una piccola quantità di gel ad ultrasuoni.
- Posizionare la testa di pesce tra gli elettrodi, posizionando l'elettrodo positivo sul lato ventrale della testa del pesce e l'elettrodo negativo sul lato dorsale (Figura 1C), pur tenendo il corpo del pesce nella spugna. Questo imposta la direzione del flusso della corrente necessaria per elettropolirare ependymoglia posizionata in zona subventricolare.
- Premere gli elettrodi delicatamente e con precisione contro il telencephalon (Figura 1C). Amministrare la corrente con il pedale. Tenere gli elettrodi in posizione fino a quando tutti e cinque gli impulsi sono finiti.
6. Recupero del pesce
- Lascia che il pesce recuperi nel serbatoio precedentemente preparato e continuamente aerato fino a quando non si sveglia. Gel lidocaina potrebbe essere applicato sul cranio al fine di alleviare qualsiasi dolore eventualmente sviluppato.
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Representative Results
Il metodo di elettroporazione descritto consente la consegna di DNA plasmide in cellule ependymogliali, che si trovano superficialmente nel telecefalo del pesce zebra e appena sotto lo strato cellulare ependymal dorsale (Figura 1A).
Se il risultato dell'elettroporazione è positivo, è possibile osservare le singole celle ependymoglial (cellule rosse nella figura 2A,B) tra le altre celle ependymoglial (bianco nella figura 2A,B). A seconda dell'efficienza del processo di elettroporazione, può essere etichettato un numero superiore (Figura 2A) o inferiore (Figura 2B) di cellule ependymogliali. Tuttavia, questo protocollo produce un numero più elevato di celle etichettate rispetto a20pubblicate in precedenza, il che è evidente nella Figura 3A e nel Video 1. Vale la pena ricordare che la più alta densità di cellule etichettate tende ad emergere per lo più sul lato interno e ventricolare di entrambi gli emisferi (Figura 3A), a causa del modo in cui il liquido plasmide iniettato si distribuisce tra gli emisferi. Nel Video 1,un emisfero del telecefalo del pesce zebra è presentato in 3D, e le cellule ependymoglial con processi radiali possono essere viste di lato. Le cellule sono coelettromrate ed etichettate con due plasmidi, tdTomato-mem (proteina fluorescente rossa ancorata alla membrana cellulare) e plasmide H2B-YFP (etichettatura nuclei). La divisione cellulare di due nuclei circondati da cerchi gialli dovrebbe essere notata.
L'elettroporazione non riuscita si traduce in un numero molto basso o in nessuna cella ependymoglial etichettata. Questo risultato può essere generalmente spiegato da un'iniezione imprecisa, in cui la punta del capillare non penetra nello strato cellulare ependymal dorsale. In questo caso, la soluzione plasmide si estende sopra lo strato cellulare efaratico dorsale invece di riempire il ventricolo telencefalico. Questo porta a cellule ependymal esclusivamente etichettate (Figura 3B). Le celle ependymal dorsali (frecce blu nella figura 3B) differiscono morfologicamente dalle celle ependymoglial (freccia gialla nella figura 3A). Il loro soma è più grande e cuboide, e non possiedono processi radiali e allungati. Ciò è evidente dal confronto di una vista laterale dello strato di cellule ependymoglial (Figura 4A,B). Le cellule etichettate TdTomato-mem sono probabilmente cellule ependymal, che si trovano sopra lo strato di ependymoglia (Figura 4B). Al contrario, nella Figura 4A, un tdTomato-mem che esprime plasmide viene introdotto alle singole cellule ependymoglial. Così, esprimono tdTomato-mem in aggiunta alla loro etichettatura iniziale (in questo caso, linea di pesce gfap:GFP transgenica, visto qui in bianco).
Questo protocollo consente l'etichettatura e il successivo seguito del comportamento delle cellule ependymoglial nel telecefalo del pesce zebra dopo lesioni per unbreve-21 o a lungo termine3 periodo di tempo. Questo si ottiene attraverso l'imaging dal vivo, in vivo e aiuta ad affrontare la questione del loro ruolo nella rigenerazione e neurogenesi.
Figura 1: Rappresentazione schematica della sezione coronale del telencephalon del pesce zebra eversito. (A) Schema di una sezione coronale di pesce zebra telencephalon, evidenziando la posizione delle cellule ependymogliali, che sono rivestimento superficie ventricolare e la costruzione della parete ventricolare ventrale. Strato ependymal dorsale è ponte tra i due emisferi e copre il ventricolo (V), situato tra due strati cellulari: ependymoglial ed ependymal. Freccia nera e la rappresentazione della vista occhio indicano vista sono mostrati nelle figure 2 e Figura 3. (B) Sulla sinistra, una fotografia della testa di pesce zebra presa dall'alto, evidenziando la posizione del telencephalon con una linea tratteggiata bianca. Un capillare di vetro è raffigurato in rosso, insieme al sito di destinazione per l'inserimento capillare. Nella foto a destra è uno schema del cervello di pesce zebra che mostra la posizione di iniezione di plasmide in rosso. Va notato che il capillare di vetro non tocca il telecefalo e che il plasmide viene iniettato appena sopra il telenfarone nel ventricolo. T - telencephalon, OT - tectum ottico. (C) Raffigurato a sinistra è una fotografia della testa di pesce zebra (vista laterale), e sulla destra è una rappresentazione della testa (vista laterale) che mostra la posizione degli elettrodi al fine di indirizzare il telecefalo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Micrografie che mostrano risultati efficaci dell'elettroporazione. Rappresentazione tridimensionale di un (A) più grande o (B) numero minore di cellule elettroporate ependymoglial nel telecefalo di pesce zebra adulto, visto dall'alto. L'elettroporazione è stata effettuata nella linea di pesce Tg (gfap:GFP) che esprime la proteina fluorescente GFP (rappresentata in bianco) in tutte le cellule ependymoglial. Le singole cellule elettroporate sono etichettate con pLAsmide pCS2-tdTomato-mem3. Barre di scala - 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Micrografie confocali che raffigurano la differenza tra l'elettroporazione riuscita e l'elettroporazione non riuscita. (A) Immagine confocale tridimensionale del telecefalo di pesce zebra BABB (REF) con un gran numero di cellule ependymogliali elettroluse con pCS-tdTomato-mem. La morfologia delle cellule ependymoglial con lunghi processi allungati (frecce gialle) deve essere notato. Entrambi gli emisferi telencefalici, evidenziati con linee tratteggiate gialle, possono essere osservati. (B) Immagine confocale dell'elettroporazione non riuscita del pCS2-tdTomato-mem plasmide. Per lo più le cellule ependymal dorsali sono etichettate, e poche cellule ependymiogliale esprimere plasmide tdTomato-mem. La chiara differenza nella morfologia delle cellule ependymal (frecce blu) dovrebbe essere notata. Barre di scala - 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: viste laterali 3D di cellule ependymogliali elettroporate e non elettroporate. (A) Rappresentazione laterale tridimensionale cellule ependymoglial, positive sia per Tg(gfap:GFP) che per pCS2-tdTomato-mem (freccia gialla). (B) Rappresentazione laterale 3D dell'elettroporazione non riuscita. La posizione delle celle positive pCS2-tdTomato-mem sopra lo strato di ependymoglia Tg(gfap:GFP)deve essere notata. Molto probabilmente le cellule dello strato ependymal dorsale sono state elettroporate (freccia blu). Barre di scala : 30 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Film 3D di telecephalon di pesce zebra e cellule ependymogliali elettroporate. Il video mostra un emisfero del telecefalo del pesce zebra in 3D. Le cellule ependymoglial i cellule sono coelettropolate con due plasmidi: tdTomato-mem (proteina fluorescente rossa ancorata alla membrana cellulare) e plasmide H2B-YFP (etichettatura nuclei). Ependymoglia etichettata individualmente con processi radiali che possono essere osservati da parte. I cerchi gialli evidenziano la cella ependymoglial con figura mitotica visualizzata da H2B-YFP etichettata cromatina. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
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Discussion
Questo protocollo di elettroporazione è un metodo affidabile in vivo per etichettare le singole cellule ependymoglial. Il protocollo potrebbe essere necessario un ulteriore adattamento per etichettare altri tipi di cellule come neuroni o oligodendrociti. Per ottenere un'etichettatura di successo, è possibile utilizzare plasmidi contenenti diversi promotori. Pollo-beta actin promotore, eF1alpha, CMV e promotore di ubiquitina sono stati precedentemente utilizzati per guidare l'espressione di diversi transgeni in ependymoglia e la loro progenie23. Tuttavia, è stata osservata una cinetica diversa dell'espressione transgenica che dovrebbe essere presa in considerazione. Ad esempio, l'espressione del transgene guidata dal promotore CMV è molto veloce (l'espressione potrebbe essere vista dopo 24 h), mentre eF1alpha richiede più tempo. Oltre all'etichettatura, il protocollo di elettroporazione può essere utilizzato come piattaforma veloce e lineare di editing genico con l'uso di tecniche Cre ricombinase o CRISPR Cas922. Inoltre, l'uso di plasmidi contenentiflip-cassette 25e la loro elettroporazione nelle linee Cre specifiche del tipo di cellula può servire come chiara estensione di un metodo che consente l'etichettatura o l'editing genetico nella progenie ependymoglial generata dopo Elettroporazione.
Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. In primo luogo, durante la fase di iniezione, lo sperimentale deve fare attenzione che la quantità di plasmid iniettata sia uguale per ogni singolo pesce, in modo che il numero di cellule etichettate rimanga comparabilmente simile. Questo può essere ottenuto controllando le dimensioni dell'apertura capillare di vetro, il che significa che il taglio di ogni punta dovrebbe essere costante tra diversi capillari o la calibrazione deve essere eseguita per ogni singolo capillare. Inoltre, la durata dell'iniezione, regolata da un pedale del piede, dovrebbe essere la stessa per ogni singola iniezione. In secondo luogo, la corretta posizione di un foro nel cranio realizzato con il micro-coltello è cruciale per la corretta dispersione del liquido plasmide in tutto il telecefalo. È altrettanto importante penetrare lo strato cellulare ependymal dorsale con la punta capillare, come indicato nel protocollo. Inoltre, è anche essenziale che il foro creato non sia troppo grande per evitare che la miscela plasmide e il liquido cerebrospinale fuoriesca dal telecefalo. Un altro passo critico è la forza della corrente elettrica applicata. È importante assicurarsi che il dispositivo di elettroporazione funzioni nel modo più preciso possibile, in modo che la forza della corrente applicata non si discosti molto dalla tensione che appare sullo schermo, che non è sempre accurata. Se questi valori non sono coerenti, è necessario regolare la forza della corrente sul dispositivo di elettroporazione, poiché una corrente somministrata superiore al 54-57 V raccomandato può compromettere la sopravvivenza dei pesci.
Rispetto agli altri metodi per la consegna di plasmide e l'etichettatura cellulare comunemente utilizzati sul campo, l'elettroporazione ha evidenti vantaggi. Nonostante i passaggi critici di cui sopra, accade molto raramente che non si possano osservare cellule elettroporate o che le cellule ependymal dorsali siano erroneamente elettroporate. In generale, il tasso di successo di questo protocollo di elettroporazione è del 90%-95% e osserviamo quasi nessuna cella TUNEL dopo l'elettroporazione. A differenza della lipofezione, ad esempio, durante l'elettroporazione, i liposomi cationici (ad esempio, lipofectamine) non vengono utilizzati e quindi la tossicità collegata al suo utilizzo è completamente evitata26. È stato precedentemente riportato che la lipofezione e l'elettroporazione hanno tassi di efficienza uguali (20-50 cellule per telencephalon)27. Tuttavia, questo protocollo ottimizzato produce generalmente 100-200 cellule per telencephalon. Rispetto ai vettori virali, la biosicurezza non è un problema con l'elettroporazione.
Inoltre, AAV o lentivirus comunemente usati non riescono a produrre espressione rilevabile di transgeni nel cervello del pesce zebra17,28. Infine, anche se il sistema Cre-lox è oggi comunemente usato nel pesce zebra, l'elettroporazione plasmide è più veloce in quanto non richiede lunghi tempi di attesa necessari per la coltivazione e la coltivazione dei pesci e consente l'etichettatura e la tracciatura delle singole cellule. Tuttavia, una tale tecnica richiede che scienziati altamente qualificati raggiungano l'elettroporazione di successo e alti tassi di sopravvivenza degli animali sperimentali (in genere sperimentiamo tassi di sopravvivenza del 70%-80%). Questo tasso tende anche a fluttuare a seconda dello sperimentatore. L'apprendimento della procedura richiede pratica e in genere richiede tre prove. Tuttavia, questo dipende dalla destrezza manuale dell'individuo e può richiedere più tempo in alcuni casi.
Il protocollo di elettroporazione presentato è un metodo veloce e altamente efficiente per elettroporare un gran numero di cellule ependymoglial con le precauzioni necessarie per ottenere risultati ottimali. L'elettroporazione del telecephalon del pesce zebra adulto è fondamentale per visualizzare le singole cellule ependymogliali e studiarne il ruolo nei processi di neurogenesi e rigenerazione. Recentemente, il successo è stato raggiunto nella rottura simultanea di più geni del telecefalo del pesce zebra adulto attraverso l'editing genico attraverso l'elettroporazione e le tecniche di StagR-Cas922. Ciò apre molte possibilità e future applicazioni di elettroporazione per un'ampia gamma di manipolazioni genetiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Un ringraziamento speciale a James Copti per la modifica del manoscritto. Ringraziamo anche i finanziamenti a JN della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) da parte dell'SFB 870 e dell'SPP "Integrative Analysis of Olfaction" e SPP 1738 "Ruoli emergenti di RNA non codificanti nello sviluppo di sistemi nervosi, plasticità e malattie", SPP1757 " L'eterogeneità gliale", e la strategia di eccellenza nell'ambito del Cluster di Monaco per la Neurologia dei Sistemi (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
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