Summary
É apresentado aqui um método do Electroporation para a entrega do ADN do plasmídeo e a rotulagem da pilha ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo é um método rápido e eficiente para visualizar e traçar células ependymogliais individuais e abre novas possibilidades para aplicar a eletroporação a uma ampla gama de manipulações genéticas.
Abstract
O electroporation é um método do transfection em que um campo elétrico é aplicado às pilhas para criar pores temporários em uma membrana de pilha e para aumentar sua permeabilidade, desse modo permitindo que as moléculas diferentes sejam introduzidas à pilha. Neste papel, o electroporation é usado para introduzir plasmídeos às pilhas ependymoglial, que alinham a zona ventricular do telencephalon adulto do zebrafish. Uma fração dessas células mostra Propriedades de células-tronco e gera novos neurônios no cérebro zebrafish; Portanto, estudar seu comportamento é essencial para determinar seus papéis na neurogênese e regeneração. A introdução de plasmídeos através do Electroporation permite a rotulagem e o seguimento a longo prazo de uma única pilha ependymoglial. Além disso, os plasmímids tais como o recombinase do CRE ou o Cas9 podem ser entregados às únicas pilhas ependymoglial, que permite a recombinação do gene ou a edição do gene e fornece uma oportunidade original de avaliar a função autônoma do gene da pilha em um controlado, natural Ambiente. Finalmente, este protocolo detalhado, passo a passo do Electroporation é usado para obter a introdução bem sucedida de plasmídeos em um grande número de únicas pilhas ependymoglial.
Introduction
Zebrafish são excelentes modelos animais para examinar a regeneração cerebral após uma ferida de ferimento de facada. Em comparação com os mamíferos, na escada evolutiva, espécies menos evoluídas como o zebrafish geralmente apresentam taxas mais elevadas de neurogênese constitutiva e áreas mais amplas de residência neural adulta de células-tronco, levando à geração constante de novos neurônios ao longo a maioria das áreas cerebrais na vida adulta. Esta característica parece correlacionar com significativamente maior capacidade regenerativa de zebrafish em comparação com os mamíferos1, como zebrafish têm notável potencial para gerar eficientemente novos neurônios na maioria dos modelos de lesão cerebral estudados2, 3,4,5,6,7,8. Aqui, o telencéfalo zebrafish é estudado, uma vez que é uma área cerebral com neurogênese proeminente na idade adulta. Estas zonas da neurogênese adulta são homólogo às zonas neurogênica no cérebro mamífero adulto9,10,11.
As áreas neurogênica abundantes no telencéfalo do zebrafish estão atuais devido à existência do glia radial como pilhas ou pilhas do ependymoglia. As células ependymogliais atuam como células-tronco neurais adultas residentes e são responsáveis pela geração de novos neurônios no cérebro intacto e regenerador3,5. Experimentos de rastreamento de linhagem mostraram que a ependymoglia ventricular reage à lesão, então proliferam e geram novos neuroblastos que migram para o local da lesão5. Devido à natureza evertido do telencephalon do zebrafish, as pilhas de ependymoglial alinham a superfície ventricular e constroem a parede ventricular ventral. A parede ventricular dorsal é formada por uma camada de células ependímicas dorsais (Figura 1a). Importante, o zebrafish ependymoglia incorpora as características tanto da glia radial de mamíferos quanto das células ependímicas. Os processos radiais longos são uma característica típica das células da glia radial, enquanto as extensões celulares e as junções apertadas (bem como suas posições ventriculares) são características típicas das células ependímicas12,13,14. Conseqüentemente, estas pilhas são referidas como pilhas ependymoglial.
Para seguir o comportamento in vivo de células ependymogliais únicas durante a regeneração, eles precisam ser rotulados de forma confiável. Os vários métodos da rotulagem in vivo da pilha para a microscopia fluorescente foram descritos previamente, tais como repórteres endógenos ou tinturas lipofílico15. Estes métodos, em contraste com o electroporation, podem exigir uns períodos de tempo mais longos e frequentemente não oferecem a possibilidade da única rotulagem da pilha ou do traçado a longo prazo permanente. Electroporation, entretanto (além da única rotulagem da pilha), oferece a possibilidade de introduzir o ADN novo na pilha de anfitrião. Além disso, comparado a outros métodos de transferência de DNA para as células, a eletroporação demonstrou ser um dos métodos mais eficientes16,17,18,19.
É apresentado aqui um protocolo do Electroporation que seja refinado com a finalidade de etiquetar únicas pilhas ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo permite a rotulagem de pilhas ependymoglial únicas a fim segui-los durante um período de longo prazo20 ou para manipular caminhos específicos em uma maneira pilha-autônoma21,22.
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Protocol
Todos os animais utilizados neste protocolo foram mantidos condições de manejo padrão, e experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos de manuseio da UE e do governo da Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. preparação da mistura plasmídeo para electroporação
- Diluir o plasmídeo de interesse em água estéril e adicionar solução de estoque de mancha verde rápido [1 mg/mL]. Certifique-se de que a concentração final do plasmídeo é ~ 1 μg/μL. Adicione a mancha em uma concentração de não mais de 3%, porque seu único objetivo é colorir a solução e visualizar a injeção ventricular.
- Uma vez preparado, misture a solução de plasmídeo pipetando para cima e para baixo várias vezes ou tocando com o dedo. Armazene à temperatura ambiente (RT) até o uso.
Nota: Para o co-Electroporation de dois plasmídeos na mesma pilha, assegure-se de que a concentração de cada plasmídeo individual usado na mistura seja pelo menos 0,8 ng/μl com uma relação do molar de 1:1 para obter a eficiência do co-Electroporation de 80%-de 90%.
2. preparações para procedimento de injecção e electroporação
- Prepare os capilares de vidro (diâmetro externo 1 mm, diâmetro interno 0,58 mm) necessários para a injeção no aparelho de tração da agulha.
- A fim de injetar a quantidade correta de plasmídeo (ver acima), puxe o capilar a uma temperatura de 68,5 ° c com dois pesos leves e dois pesados (ver tabela de materiais para as especificações do extrator).
Nota: No caso de um extrator diferente é usado, calibrar o capilar para entregar o volume adequado de mistura de electroporação. - Defina manualmente o dispositivo de injeção para uma pressão de injeção de 200 hPa (girando o botão PI) e a pressão constante de 0 hPa. Ajuste manualmente o tempo de injeção para o modo manual e controle a pressão com o pedal do pé.
- Ajuste o dispositivo do Electroporation ao "modo LV" com cinco pulsos em 54 – 57 V (25 MS cada um com 1 s intervalos). Ligue os eléctrodos ao dispositivo.
- Prepare um tanque de peixes com água de peixe limpa, onde o peixe será despertado da anestesia após o procedimento de eletroporação. Aerate a água mantendo a pedra do ar unida à bomba de ar para o período inteiro da recuperação até que o peixe esteja despertado inteiramente.
- Tome uma esponja de cozinha regular e faça um corte longitudinal na esponja para prender peixes durante o procedimento da injeção e do Electroporation (veja a publicação precedente3).
Nota: A esponja da cozinha deve regularmente ser lavada ou trocado a fim remover produtos químicos tóxicos potenciais. - Coloc uma pequena quantidade de gel multi-purpose altamente condutor do ultra-som ao lado da instalação da injeção e do Electroporation.
Nota: Isso garantirá a condutividade elétrica adequada e, consequentemente, a distribuição de células eletroporadas em todo o telencon.
3. anestesia de zebrafish
- Antes da anestesiarização, prepare uma solução de anestesia com 0,2% MS222 em água destilada e ajuste o pH para 7 com tampão Tris-HCl. Diluir este estoque 1:10 (ou seja, para 0, 2% MS222) usando água de peixe.
- Anestesie os peixes mantendo-os nesta solução de trabalho até que o movimento do corpo e das guelras diminui (tipicamente por alguns minutos).
4. injeção de solução de plasmídeo
- Encha o capilar de vidro preparado com 10 μL de solução de plasmídeo usando pontas do microloader. Evite a formação de bolhas de ar dentro do capilar.
- Prima menu/alterar capilar no dispositivo de injecção. Insira e fixe a agulha no suporte da agulha.
- um estereomicroscópio com uma ampliação de 3,2 x ou 4x, corte apenas a ponta do capilar usando pinça Fine-end. Mude o dispositivo da injeção do modo capilar da mudança no modo da injetora , a seguir aplique a pressão com um pedal do pé para assegurar-se de que a solução do plasmídeo esteja funcionando facilmente fora da agulha e sem obstáculo.
- Transfira o peixe do tanque de pecuária para o recipiente (caixa plástica) com solução anestésica. Aguarde alguns minutos até o movimento das guelras Subsides.
- Coloque os peixes na esponja pré-molhada com o lado dorsal virado para cima. Execute todas as seguintes etapas da injeção o estereomicroscópio para assegurar a exatidão do procedimento.
- Usando uma microfaca de dissecação de aço inoxidável com 40 mm de aresta de corte e 0,5 mm de espessura, crie um pequeno furo no crânio de peixe no lado posterior do telencídeo (Figura 1b), ao lado da borda com Tectum óptico.
Nota: Esta etapa deve ser realizada com cuidado uma vez que o furo deve ser muito pequeno e superficial, penetrando unicamente o crânio, para evitar danos cerebrais. - Incline o peixe conforme necessário e Oriente a ponta do capilar de vidro em direção ao crânio no ângulo correto para facilitar a penetração da ponta capilar através do orifício.
- Insira a ponta do capilar através do orifício no crânio com cuidado até atingir o ventrículo telencefálico (ver Figura 1b). Isto exigirá a penetração através da camada de pilha ependymal dorsal. Tenha especialmente cuidado para não inserir o capilar muito profundamente para evitar o contato com o tecido cerebral. Mantenha o capilar precisamente entre os hemisférios, permanecendo dentro do ventrículo logo após perfurar a camada ependymal dorsal.
Nota: Este é um passo muito delicado. A exatidão deste procedimento é melhorada usando linhas do mutante da pigmentação tais como brassy24, permitindo a melhor visualização da posição capilar de vidro durante a injeção. - Com a ponta capilar dentro do ventrículo, injete a solução de plasmídeo aplicando pressão com o pedal por cerca de 10 s, o que corresponde a aproximadamente 1 μL de solução de plasmídeo.
Nota: Se mudar o extrator da agulha, os capilares ou o injector, o sistema deve ser calibrado a fim entregar sempre 1 μL da solução do plasmídeo. A calibração pode ser realizada medindo-se o diâmetro da gota de plasmídeo expelido em óleo mineral (por exemplo, óleo de parafina) e, posteriormente, calculando o volume da gotículo. Após 10 s de injecção, deve haver ~ 1 μL de líquido plasmídeo expelido para o óleo mineral. - Confirme o sucesso da etapa precedente observando a propagação do líquido durante todo o ventrículo.
5. electroporação
- Retire o peixe do conjunto de injeção enquanto ainda o segura na esponja.
- Mergulhe o lado interno da ponta dos eletrodos no gel de ultra-som.
- Cubra o telencon de peixes com uma pequena quantidade de gel de ultra-som.
- Posicione a cabeça de peixe entre os eletrodos, colocando o eletrodo positivo no lado ventral da cabeça do peixe e o eletrodo negativo no lado dorsal (Figura 1C), enquanto ainda mantém o corpo do peixe na esponja. Isto ajusta o sentido do fluxo da corrente necessária para electroporate o ependymoglia posicionado na zona zona.
- Pressione os eletrodos suavemente e precisamente contra o telencótido (Figura 1C). Administrar a corrente com o pedal do pé. Segure os eletrodos no lugar até que todos os cinco pulsos estão acabados.
6. recuperação dos peixes
- Deixe o peixe recuperar-se no tanque previamente preparado, continuamente aerado até que acorde. O gel do Lidocaine podia ser aplicado no crânio a fim aliviar toda a dor possivelmente desenvolvida.
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Representative Results
O método de eletroporação descrito permite a entrega do DNA plasmídeo em células ependimogliais, localizadas superficialmente no telencédigo zebrafish e logo abaixo da camada de células ependímicas dorsais (Figura 1a).
Se o resultado da eletroporação for positivo, rotulados células ependymogliais únicas (células vermelhas na Figura 2a, b) podem ser observadas entre outras células ependimogliais (brancas na Figura 2a, b). Dependendo da eficiência do processo de eletroporação, pode-se etiquetado um número mais elevado (Figura 2a) ou inferior (Figura 2b) de células ependymogliais. No entanto, este protocolo produz maior número de células rotuladas do que20anteriormente publicados, o que é aparente na Figura 3a e vídeo 1. Vale ressaltar que a maior densidade de células rotuladas tende a emergir principalmente no lado interno, ventricular de ambos os hemisférios (Figura 3a), devido à forma como o líquido plasmídeo injetado distribui entre os hemisférios. No vídeo 1, um hemisfério do telencéfalo do zebrafish é apresentado em 3D, e as pilhas ependymoglial com os processos radiais podem ser vistas do lado. As células são coeletroporadas e marcadas com dois plasmídeo, tdTomato-mem (proteína fluorescente vermelha ancorada na membrana celular) e plasmídico H2B-YFP (núcleos de rotulagem). A divisão da pilha de dois núcleos cercados por círculos amarelos deve ser anotada.
O electroporation mal sucedido conduz ao número muito baixo ou a nenhumas pilhas ependymoglial etiquetadas. Este resultado pode ser explicado geralmente pela injeção imprecisa, em que a ponta do capilar não penetra a camada de pilha ependymal dorsal. Neste caso, a solução do plasmídeo espalha acima da camada de pilha ependymal dorsal em vez de encher o ventrículo inibidor. Isto conduz às pilhas ependymal que estão sendo etiquetadas unicamente (Figura 3B). As células ependímicas dorsais (setas azuis na Figura 3B) diferem morfologicamente das células ependymogliais (seta amarela na Figura 3a). Sua soma é maior e cubóide, e eles não possuem processos radiais, alongados. Isso é evidente comparando-se uma visão lateral da camada de células ependymogliais (figura 4a, B). TdTomato-mem células rotuladas são mais prováveis células ependymal, que estão localizadas acima da camada de ependymoglia (Figura 4B). Ao contrário, na figura 4a, um tdTomato-mem que expressa o plasmídeo é introduzido às pilhas ependymoglial individuais. Assim, eles expressam tdTomato-Mem, além de sua rotulagem inicial (neste caso, GFAP transgênica: linha de peixes GFP , visto aqui em branco).
Este protocolo permite a rotulagem e subsequente seguimento do comportamento das células ependimogliais no telencédigo de zebrafish após lesão ao longo de um curto-21 ou longo prazo3 período de tempo. Isto é conseguido através de imagens ao vivo, in vivo e ajuda a abordar a questão de seus papéis na regeneração e neurogênese.
Figura 1: representação esquemática da secção coronal do telencótido zebrafish evertido. (A) esquema de uma seção coronal do telencédigo de zebrafish, destacando a posição das células ependymogliais, que estão alinhando a superfície ventricular e construindo a parede ventricular ventral. A camada de ependymal dorsal está unindo os dois hemisférios e cobrindo o ventrículo (V), localizado entre duas camadas de células: ependymoglial e ependymal. A seta preta e a representação do olho indicam que a vista é mostrada nas figuras 2 e Figura 3. (B) à esquerda, uma fotografia da cabeça de zebrafish tirada de cima, destacando a posição do telencótido com uma linha tracejada branca. Um capilar de vidro é representado em vermelho, juntamente com o local de destino para a inserção capilar. Na foto à direita é um esquema de cérebro zebrafish mostrando a posição de injeção de plasmídeo em vermelho. Deve-se notar que o capilar de vidro não toca o telencótido e que o plasmídeo é injetado logo acima do telencótido no ventrículo. T = telencómato, OT = Tectum óptico. (C) representado à esquerda é uma fotografia da cabeça de zebrafish (vista lateral), e à direita é uma representação da cabeça (vista lateral) mostrando a posição dos eletrodos, a fim de direcionar o telencídeo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: micrografias mostrando resultados efetivos de eletroporação. Representação tridimensional de a (a) maior ou (B) menor número de células ependimogliais eletroporadas no adulto zebrafish telencephalon, como visto de cima. O electroporation foi feito na linha dos peixes do TG (GFAP: GFP) que expressa a proteína fluorescente de GFP (descrita no branco) em todas as pilhas ependymoglial. As pilhas em individuais são etiquetadas com pCS2-tdtomato-mem plasmídeo3. Barras de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: micrografias confocais representando a diferença entre a eletroporação bem-sucedida e malsucedida. (A) imagem confocal tridimensional de telencéfalos de zebrafish Babb-cancelados (ref) com um grande número pilhas ependymoglial em de pCS-tdtomato-mem. A morfologia das pilhas ependymoglial com processos longos, alongados (setas amarelas) deve ser anotada. Ambos os hemisférios telencefálicos, destacados com linhas tracejadas amarelas, podem ser observados. (B) imagem confocal do Electroporation mal sucedido do plasmid do PCS2-tdTomato-mem. Na maior parte as pilhas ependymal dorsais são etiquetadas, e poucas pilhas ependymoglial expressam o Plasmid de tdTomato-mem. A diferença clara na morfologia de pilhas ependymal (setas azuis) deve ser anotada. Barras de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: visões 3D laterais de células ependymogliais eletroporadas e não eletroporadas. (A) Arepresentação lateral tridimensional em pilhas ependymoglial, positivas para TG (GFAP: GFP) e pCS2-tdtomato-mem (seta amarela). (B) representação 3D lateral de eletroporação mal sucedida. A posição de pCS2-tdTomato-mem pilhas positivas acima do TG (GFAP: GFP) a camada do ependymoglia deve ser anotada. As pilhas de camada ependymal dorsais mais prováveis foram em (seta azul). Barras de escala = 30 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: filme 3D de zebrafish telencéfalo e células ependymoglial em. Vídeo mostra um hemisfério do zebrafish telencéfalo em 3D. As células ependymogliais são coeletroporadas com dois plasmídeo: tdTomato-mem (proteína fluorescente vermelha ancorada na membrana celular) e plasmídico H2B-YFP (núcleos de rotulagem). Ependymoglia individualmente rotulado com processos radiais que podem ser observados de lado. Círculos amarelos destacam célula ependymoglial com figura mitótica visualizada por H2B-YFP rotulada cromatina. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
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Discussion
Este protocolo do Electroporation é um método in vivo de confiança de etiquetar pilhas ependymoglial individuais. O protocolo pode precisar de uma adaptação adicional para rotular outros tipos de células, como neurônios ou oligodendrócitos. Para conseguir a rotulagem bem sucedida, os plasmídeos que contêm promotores diferentes podem ser usados. O promotor da galinha-beta actina, o eF1alpha, o CMV e o promotor do ubiquitin foram usados previamente para conduzir a expressão de transgenes diferentes no ependymoglia e em seu progênie23. Entretanto, observou-se uma cinética diferente de expressão transgênica que deve ser levada para a conta. Por exemplo, a expressão transgênica impulsionada pelo promotor CMV é muito rápida (a expressão pode ser vista após 24 h), enquanto eF1alpha demora mais tempo. Aparte da rotulagem, o protocolo do Electroporation pode ser usado como uma plataforma rápida e direta da edição do gene com o uso de recombinase de CRE ou de técnicas de CRISPR Cas922. Além disso, o uso de plasmínios contendo25-Cassette e sua eletroporação em linhas CRE específicas do tipo celular pode servir como uma extensão clara de um método que permite a rotulagem ou a edição de genes na progêia ependymoglial gerada após Electroporation.
Este protocolo tem várias etapas críticas. Primeiro, durante a etapa de injeção, o experimento precisa ter cuidado para que a quantidade de plasmídeo injetado seja igual para cada peixe individual, de tal forma que o número de células rotuladas permaneça comparativamente semelhante. Isto pode ser conseguido controlando o tamanho da abertura capilar de vidro, significando que o corte de cada ponta deve ser constante entre capilares diferentes ou a calibração deve ser executada para cada capilar individual. Adicionalmente, a duração da injeção, regulada por um pedal do pé, deve ser a mesma para cada injeção individual. Em segundo lugar, a posição adequada de um furo no crânio feito com a microfaca é crucial para a dispersão adequada do líquido plasmídeo em todo o telencótido. É igualmente importante penetrar a camada de células ependymal dorsal com a ponta capilar, conforme indicado no protocolo. Além disso, é igualmente essencial que o furo criado não seja demasiado grande impedir que a mistura do plasmídeo e o líquido cerebrospinal escapem fora do telencephalon. Outro passo crítico é a força da corrente elétrica aplicada. É importante certificar-se de que o dispositivo do Electroporation está operando tão precisamente como possível, tais que a força da corrente aplicada não desviar muito da tensão que aparece na tela, que não é sempre exata. Se estes valores não são consistentes, é necessário ajustar a força da corrente no dispositivo do Electroporation, desde que uma corrente administrada mais altamente do que o recomendado 54-57 V pode comprometer a sobrevivência dos peixes.
Comparado aos outros métodos para uma entrega do plasmídeo e a rotulagem da pilha usada geralmente no campo, o electroporation tem vantagens óbvias. Apesar das etapas críticas mencionadas acima, acontece muito raramente que nenhumas pilhas em podem ser observadas ou que as pilhas ependymal dorsais estão equivocadamente em. Geralmente, a taxa de sucesso deste protocolo do Electroporation é 90%-95% e nós observamos quase nenhumas pilhas de TUNEL + após o electroporation. Em contraste com o lipofecção por exemplo, durante o electroporation, os lipossomas catiônicos (por exemplo, Lipofectamine) não são usados e assim a toxicidade conectada com seu uso é evitada completamente26. Foi relatado previamente que o lipofecção e o electroporation têm taxas iguais da eficiência (20-50 pilhas por o telencephalon)27. No entanto, este protocolo otimizado geralmente produz 100-200 células por telencómetro. Em comparação com vetores virais, a biossegurança não é um problema com a eletroporação.
Além disso, os AAVs comumente usados ou Lentivirus não conseguem produzir expressão detectável de transgenes no cérebro de zebrafish17,28. Finalmente, embora o sistema CRE-LOX é hoje em dia comumente usado em zebrafish, Electroporation plasmídeo é mais rápido, uma vez que não requer longos tempos de espera necessários para a criação de peixes e crescimento e permite a rotulagem de células individuais e rastreamento. No entanto, tal técnica requer cientistas altamente qualificados para alcançar o sucesso de eletroporação e altas taxas de sobrevivência de animais experimentais (que normalmente experimentam taxas de sobrevivência de ~ 70%-80%). Esta taxa também tende a flutuar dependendo do experimentador. Aprender o procedimento requer prática e normalmente leva três tentativas. No entanto, isso é dependente da destreza manual do indivíduo e pode demorar mais tempo em alguns casos.
O protocolo de eletroporação apresentado é um método rápido, altamente eficiente para electroporating um grande número de pilhas ependymoglial com as precauções necessárias para obter resultados óptimos. O electroporation do telencéfalo adulto do zebrafish é crucial para visualizar pilhas ependymoglial individuais e estudar seus papéis em processos da neurogênese e da regeneração. Recentemente, o sucesso foi conseguido na ruptura simultânea de genes múltiplos do telencéfalo zebrafish adulto com a edição do gene através das técnicas do Electroporation e do stagr-Cas922. Isto abre muitas possibilidades e aplicações futuras do Electroporation para uma escala larga de manipulações genéticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecimentos especiais a James Copti para edição do manuscrito. Nós também reconhecemos com gratidão o financiamento para JN da Fundação alemã de pesquisa (DFG) pela SFB 870 e SPP "análise Integrativa de olfaction" e SPP 1738 "papéis emergentes de RNAs não codificantes no desenvolvimento do sistema nervoso, plasticidade & doença", SPP1757 " Heterogeneidade glial ", e estratégia de excelência no âmbito do cluster de Munique para Neurologia de sistemas (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
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