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Cancer Research

कैंसर के लिए एक अधिक शारीरिक प्रणाली के रूप में एक 3 डी Spheroid मॉडल-एसोसिएटेड Fibroblasts भेदभाव और विट्रो अध्ययन में आक्रमण

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/60122
Automatic Translation
1,2, 1
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक ट्यूमर थोक की तरह वातावरण में कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) के भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक 3 डी स्थापित करना है, जिसे विभिन्न विश्लेषण प्रणालियों में संबोधित किया जा सकता है, जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस, ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण और जीवन कोशिका इमेजिंग.

Abstract

एक इन विट्रो अध्ययन के लिए आदर्श मॉडल को परिभाषित करना आवश्यक है, मुख्य रूप से यदि कोशिकाओं के भेदभाव जैसे शारीरिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करना आवश्यक है। ट्यूमर स्ट्रोमा में, मेजबान फाइब्रोब्लास्ट्स कैंसर कोशिकाओं द्वारा अंतर करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं। इस प्रकार, वे एक phenotype है कि ट्यूमर microenvironment के लिए योगदान देता है और ट्यूमर प्रगति का समर्थन करता है प्राप्त. का उपयोग करके, हमने इन विट्रो मॉडल प्रणाली में इस प्रकार के 3D की स्थापना की है, जिसमें हमने इस विभेदन प्रक्रिया में लेमिनिन-332 की भूमिका और इसके ग्राही integrin का विश्लेषण किया है। यह गोलभॉइड मॉडल प्रणाली न केवल ट्यूमर microenvironment की स्थिति को अधिक सटीक तरीके से पुन: उत्पन्न करती है, बल्कि यह एक बहुत बहुमुखी मॉडल है क्योंकि यह अलग-अलग डाउनस्ट्रीम अध्ययन की अनुमति देता है, जैसे कि अंतर और extracellular दोनों के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला मार्करों, साथ ही जमा extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन. इसके अलावा, QPCR द्वारा प्रतिलेखनीय विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री और सेलुलर आक्रमण इस मॉडल के साथ अध्ययन किया जा सकता है. यहाँ, हम एक गोलाभ मॉडल के एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए CAFs की भूमिका का आकलन करने के लिए 'integrin ]3 और उसके बहिर्मुख रूप से जमा ligand, laminin-332, भेदभाव में और अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं के आक्रमण का समर्थन करने में.

Introduction

ट्यूमर microenvironment एक बहुत ही जटिल आला और ट्यूमर कोशिकाओं के रखरखाव और प्रगति के लिए अत्यंत महत्वपूर्णहै 1. यह न केवल कैंसर कोशिकाओं द्वारा बल्कि स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट्स द्वारा भी बनता है। ट्यूमर कोशिकाएं एक स्ट्रोमा से घिरी होती हैं जो विशिष्ट होती है और सामान्य ऊतकों2के स्ट्रोमा से अलग होती है . Laminin-332 एक extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन बाह्य रूप से विभिन्न ट्यूमर के stroma में व्यक्त की है, इस तरह के अग्नाशय एडेनोकार्सीनोमा3के रूप में. इसके अलावा, ईसीएम की जैव रासायनिक संरचना और इसके जैवभौतिक गुण, जैसे कठोरता और तनाव, ट्यूमर थोक4के भीतर बदल जाते हैं। इस ट्यूमर stroma, या "प्रतिक्रियाशील stroma", पड़ोसी कैंसर की कोशिकाओं के लिए फाइब्रोब्लास्ट के एक अनुकूलन के कारण होता है और अन्य बहुत महत्वपूर्ण खिलाड़ियों है कि ट्यूमर प्रगति के लिए एक अनुकूल और सहायक वातावरण विकसित की भर्ती के द्वारा. स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट्स के भेदभाव का परिणाम कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) में होता है। इन कोशिकाओं की पहचान विभिन्न मार्करों जैसे कि जेड-स्मूथ मांसपेशी एक्टिन (जेडएसएमए)5 या न्यूरल/ग्लिल प्रतिजन 2 (एनजी2)6का उपयोग करके की जा सकती है।

सीएएफ के साथ ट्यूमर microenvironment (TME) recapitulate करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सबसे उपयुक्त का चयन करने के लिए मुश्किल है। इस तरह के एक मॉडल प्रणाली के लिए एक लागत कुशल और reproduible तरीके से TME के शारीरिक मापदंडों की नकल करने की विधि पर विचार किया जाना चाहिए. TME के भीतर, विभिन्न प्रक्रियाओं, जैसे प्रसार, भेदभाव, प्रवास और विभिन्न सेल प्रकार के आक्रमण होते हैं. इन सेलुलर प्रक्रियाओं अलग अलग तरीकों के साथ व्यक्तिगत रूप से किया जा सकता है. हालांकि, प्रयोगात्मक स्थितियों ट्यूमर stroma ECM के साथ सेलुलर बातचीत पर विचार करना चाहिए, सब्सट्रेटम की कठोरता CAF भेदभाव प्रक्रिया को प्रभावित करती है के बाद से. आर.जी. वेल्स ने सेल व्यवहार पर मैट्रिक्स कठोरता के प्रभाव पर टिप्पणी की और इस बात पर प्रकाश डाला कि इन विट्रो सुसंस्कृत कोशिकाओं में साइटोस्केलेटल संगठन और विभेदन स्थिति कलापूर्ण हो सकतीहै 7. विभिन्न उद्दीपकों में सीएएफ विभेदन में शामिल प्रतीत होता है , जिसमें यांत्रिक तनाव5,7शामिल है . इससे बचने के लिए, 2 डी नरम substrates भेदभाव अध्ययन के लिए संभव दृष्टिकोण हो सकता है, के रूप में वे कड़ी संस्कृति पकवान प्लास्टिक की समस्या को दरकिनार. एक नरम 2 डी सतह, जिस पर फाइब्रोब्लास्ट्स उगाया जा सकता है, कोलेजन-I लेपित पॉलीऐक्रिलमाइड जैल हो सकता है, जिससे जेल कठोरता को पॉलीऐक्रिलमाइड और जेल क्रॉस-लिंकर की एकाग्रता द्वारा हेरफेर किया जा सकता है। जेडएसएमए समृद्ध तनाव फाइबर के आसंजन और गठन को जेल कठोरता8के साथ फाइब्रोब्लास्ट्स में बढ़ाया जाता है। इन परिणामों को इन विट्रो भेदभाव मॉडल में अधिक शारीरिक के लिए नरम सब्सट्रेट पाड़ के महत्व पर जोर दिया. हालांकि, हमारे हाथों में प्रयोगात्मक reproducibility और इन जैल की इमेजिंग चुनौतीपूर्ण थे. इन कमियों को दूर करने के लिए, हम भेदभाव और आक्रमण अध्ययन के लिए एक 3 डी गोलभदाई मॉडल के लिए 2 डी नरम सब्सट्रेट प्रणाली बदल दिया है। इस मॉडल को और अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक है और, एक इन विट्रो organoid के समान, विवो सेल सेल बातचीत में recapitulates, ECM उत्पादन और जमाव, साथ ही सेल व्यवहार9.

स्प्रॉइड तब बनते हैं जब कोशिकाओं में पालन करने के लिए सब्सट्रेट की कमी होती है। जब कोशिकाओं को एक चिपकने वाला सतह के बिना छोड़ दिया जाता है, तो वे एक अधिक या कम गोलाकार संरचना बनाने के लिए कुल। यदि गोलभों को एक प्रकार के कोशिका से बना दिया जाता है, तो उन्हें होमोस्फेरॉइड्स कहा जाता है; यदि दो या दो से अधिक विभिन्न कोशिका प्रकारों से बना है तो वे विषमस्फीत बनाते हैं।

गोलभक् ति तैयारी के लिए विभिन्न विधियों में, हम प्रोटोकॉल गैर-अनुकूल गोल नीचे 96-वेल प्लेटों का उपयोग करते हैं। यह लागत के संबंध में बहुत प्रभावी है. यहाँ, हम फाइब्रोब्लास्ट्स के दोनों homofheroids का उत्पादन, सीएएफ या CAFs integrin की कमी $ 3 subunit भेदभाव प्रक्रिया की जांच करने के लिए और caFs या integrin के heteospheroids 3 KO CAFs और अग्नाशय ी डक्ट कार्सिनोमा कोशिकाओं (AsPC-I और PANC-I) आक्रमण का अध्ययन करने के लिए आसपास के मैट्रिक्स में.

इन अध्ययनों के लिए उद्देश्य मानव अग्नाशय कार्सिनोमा बायोप्सी से अलग प्राथमिक CAFs का उपयोग करने के लिए किया गया था. हालांकि, कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए बायोप्सी दुर्लभ हैं और इस कारण से, इन अध्ययनों में प्रयुक्त सीएएफ को एचईटीईटर युक्त मसूरीवायरस का उपयोग करके अमर कर दिया गया है। वे iCAFs कहा जाता है, और उनके सामान्य समकक्षों, प्राथमिक मानव अग्नाशय फाइब्रोब्लास्ट्स, iNFs कहा जाता है. मानव अग्नाशय फाइब्रोब्लास्ट्स और अग्नाशयी नलिका कार्सिनोमा कोशिकाओं, AsPC-I और PANC-I, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग सीएएफ विभेदन प्रक्रिया में लेमिनिन-332-इंटेग्रिन इंटरैक्शन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया था। इस बातचीत और उसके कार्य की विशिष्टता को साबित करने के लिए, अवरोधक यौगिकों का उपयोग किया गया: BM2, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जो integrin साइट को ब्लॉक करता है लेमिन-332 $3 श्रृंखला10,या lebein 1, एक साँप व्युत्पन्न जहर यौगिक है कि ब्लॉक लेमिन-बाइंडिंग इनेग्रिन्स ] 3 ]1, ]6 ]1 और ]7]11,12.

आक्रमण परख के लिए, कोशिकाओं cDNA एन्कोडिंग या तो mCherry (iCAFs और integrin ] 3 KO iCAFs) या GFP (AsPC-I और PANC-I) के साथ lentivirus युक्त ट्रांसड्यूसर के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था heterospheroids में विभिन्न प्रकार के भेद करने के लिए. कोशिकाओं के transduction उन्हें अमर करने के लिए और / या उन्हें फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल करने के लिए (मचेरी और GFP) अभिव्यक्ति एक पिछले अध्ययन में वर्णित है13,कि अधिक जानकारी के लिए परामर्श किया जाना चाहिए.

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Protocol

1. सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन के विभिन्न टीजीएफ-जेड 1 बाधा यौगिकों का उपयोग करके फाइब्रोब्लास्ट/सीएएफ भेदभाव के लिए एक इन विट्रो मॉडल के रूप में 3 डी स्फीरॉइड

  1. मिक्स 1 हिस्सा 6 mg/mL methylcellulose समाधान और सेल संस्कृति मीडिया के 3 भागों, एमईएम गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन /
  2. नए सिरे से thawed अमरीकृत सामान्य फाइब्रोब्लास्ट्स (iNFs), अमर CAF (iCAFs) या integrin [3] 1 KO iCAF (25 तक पारित) गोलोइड गठन समाधान में. यदि एक 96 अच्छी तरह से प्लेट तैयार, गोलोइड गठन समाधान की एक अतिरिक्त तैयार, 10 एमएल और 75,000 कोशिकाओं को जोड़ने, ध्यान में रखते हुए कि प्रत्येक गोलाभ 750 कोशिकाओं द्वारा बना है, और है कि 100 डिग्री सेल्सियस थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से प्रति वितरित कर रहे हैं.
  3. यदि cytokines या integrin inhibitors अध्ययन में शामिल हैं, सेल निलंबन के लिए इन यौगिकों को जोड़ने के लिए, उन्हें उनके गठन के दौरान गोलोइड में एम्बेड करने के लिए. ध्यान दें कि iNFs के साथ प्रेरित कर रहे हैं 10 NG/mL TGF-जेड 1 के क्रम में भेदभाव को गति प्रदान करने के लिए. जहां उपयुक्त हो, टीजीएफ-जेड 1 के साथ अवरोधक यौगिकों को जोड़ें, जैसे 20 डिग्री/एमएल बीएम2 या लेबीन 1 के 10 डिग्री ग्राम/एमएल।
  4. एक ही रास्ते में सीएएफ homospheroids तैयार है, लेकिन TGF के बिना - $ 1 उत्तेजना, क्योंकि वे पहले से ही विभेदित कर रहे हैं. किसी यौगिक के योग के बिना integrin $ 3 KO CAF homospheroids तैयार करें।
  5. प्रत्येक कुएं में घोल का 100 डिग्री सेल्सियस जोड़कर गोल तल 96 बहु-वेल प्लेट पर गोल तल पर गोलभक् त गठन विलयन को वितरित करें। हर बार गोलभड़ समाधान कुओं में वितरित किया जाता है, ऊपर और नीचे, कई बार pipeting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण.
  6. 24 ज के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट रखें ताकि प्रत्येक कुएं में एक गोलभॉइड का निर्माण हो सके।
  7. के बारे में 24 ज के बाद गोलोइड लीजिए और उन्हें विभिन्न बहाव प्रयोजनों के लिए उपयोग करें: इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला, वास्तविक समय (आरटी) क्यू-पीसीआर और प्रवाह साइटोमेट्री। अंतर- और extracellular एंटीजन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए, गोलाभ के भीतर ईसीएम प्रोटीन के जमाव सहित, इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला का उपयोग करें। एकल कोशिकाओं में अगोलीय के विघटन के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा झिल्ली-एंकर रिसेप्टर की मात्रा निर्धारित करें। जीन सक्रियण और ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का पता लगाने के लिए, गोलभॉइड कोशिकाओं से अलग एमआरएनए के आरटी क्यू-पीसीआर का उपयोग करें।

2. गोलाभों का इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला

  1. लगभग 24 ज के बाद का विश्लेषण करने के लिए प्रायोगिक स्थिति या प्रति प्रोटीन प्रति 1.5 एमएल अभिक्रिया ट्यूब में कागोली लीजिए। उदाहरण के लिए, iNFs के गोलोइड एक नियंत्रण iNFs, जो इलाज नहीं किया गया से अलग एक ट्यूब में TGF-जेड 1 के साथ प्रेरित जगह है. बहुत मजबूत कतरनी बलों के कारण गोलिभों के टूटने से बचने के लिए, छिद्र को विस्तार करने के लिए पिपेट टिप के अंत में कटौती करें। प्रतिकृति की अनुमति देने और धोने के चरणों के दौरान संभावित नुकसान को ध्यान में रखने के लिए, एक प्रतिक्रिया ट्यूब में कम से कम 5-10 गोलभों को शामिल करें।
  2. 1000 x ग्रामपर लगभग 30-60 एस के लिए एक बेंच शीर्ष सेंट्रीफ्यूज के साथ गोलाभ को केंद्रित करें . ध्यान से गोलीमार गोलोइड परेशान किए बिना, पाइपिंग द्वारा मिथाइलसेलुलोस युक्त सुपरनेंट को हटा दें।
  3. 1x पीबीएस के 50 डिग्री एल के साथ धो लें। अपकेंद्रण चरण दोहराएँ और ध्यान से पाइपिंग द्वारा पीबीएस निकालें, जैसा कि 2.2 में वर्णित है।
  4. दागदार होने के लिए प्रोटीन पर निर्भर करता है, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 50 डिग्री सेल्सियस के साथ ठीक करें (एसएमए, एनजी 2 और इंटेग्रिन [3]1) या 10 मिनट के लिए मेथनॉल के 50 डिग्री सेल्सियस के साथ (लेमिन-332 subunits के लिए)।
  5. चरण 2-2-2-3 में समझाया गया है के रूप में धोने के कदम को दोहराएँ.
  6. कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% Triton-X के साथ कोशिकाओं permebilize.
  7. चरण 2-2-2.3 तीन बार में समझाया गया है के रूप में धोने के कदम को दोहराएँ.
  8. गैर विशिष्ट प्रोटीन बातचीत साइटों को ब्लॉक करने के लिए आरटी में 1 एच के लिए 5% एफबीएस और 2% बीएसए युक्त पीबीएस में गोलोइड इनक्यूबेट करें।
  9. पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी के 30 डिग्री सेल्सियस, 2.5% एफबीएस और 1% बीएसए के साथ गोलोइड को रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: 5 ग्राम/एमएल पर एंटी-एसएमए साइ-3 संयुग्मी और एंटी-एनजी 2; बीएम 2 एंटी-लेमिन $3, 6F12 विरोधी laminin $3 और विरोधी laminin $2 2g/
  10. चरण 2-2-2.3 तीन बार में समझाया गया है के रूप में धोने के कदम को दोहराएँ.
  11. पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी के 30 $L, 2.5% FBS और 90 मिनट के लिए आरटी में 1% बीएसए के साथ गोलोइड इनक्यूबेट करें। निम्नलिखित माध्यमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल किया गया: Alexa 488 विरोधी rabbit और विरोधी माउस (5 g/
  12. चरण 2-2-2.3 तीन बार में समझाया गया है के रूप में धोने के कदम को दोहराएँ.
  13. कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए DAPI धुंधला समाधान के 30 $L के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  14. चरण 2-2-2-3 में समझाया गया है के रूप में धोने के कदम को दोहराएँ.
  15. एक गिलास स्लाइड पर गोलोइड प्लेस प्लेस, पीबीएस की एक बूंद में, एक गिलास पाश्चर पाइप्ट का उपयोग कर रखें।
  16. 10x के आवर्धन का उपयोग कर एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा गोलोभ छवि। एक z-स्टैक (15-20 स्टैक विमानों) के विभिन्न ऑप्टिकल विमानों पर गोलाभ के विभिन्न ऑप्टिकल पार अनुभाग ले लो. माइक्रोस्कोप में लेजर सेटिंग्स स्थापित करने के लिए, ब्याज के प्रतिजन या केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग एक गोलाभभ के लिए नकारात्मक कोशिकाओं से बना एक गोलक का उपयोग करें। तुलना की जाएगी जो सभी नमूनों के लिए एक ही सेटिंग्स का पुन: उपयोग करें।
  17. पहले प्रकाशित के रूप में ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ सूक्ष्म छवियों का विश्लेषण14. इन चरणों को पूरक चित्र 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। पृष्ठभूमि के रूप में, ब्याज की एक सेल मुक्त क्षेत्र (आरओआई) के एकीकृत संकेत घनत्व निर्धारित करते हैं। कुल सही सेल फ्लोरोसेंट (TCCF) के रूप में गणना:
    Equation 1
  18. कुल सही फ्लोरोसेंट (TCF) spheroids के रूप में TCCF गोलिकाइड के क्षेत्र और ढेर की संख्या के लिए सामान्यीकृत निर्धारित करें।
    Equation 2

3. होमोस्फेरॉइड्स की आरटी क्यू-पीसीआर

  1. आरटी-क्यूपीसीआर करने के लिए, 50 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में कम से कम 288 गोलभों (तीन 96-वेल प्लेट्स के अनुरूप) एकत्र करें। 1,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और पेलेटेड गोलाभ को परेशान किए बिना पाइपिंग द्वारा मिथाइलसेलुलोस युक्त सुपरनेंट को ध्यान से हटा दें।
  2. 1x पीबीएस के 1 एमएल से धो लें और एक 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में गोलभड़ियों को स्थानांतरित करें। 1000 x ग्रामपर लगभग 30-60 एस के लिए एक बेंच शीर्ष सेंट्रीफ्यूज के साथ गोलाभ को केंद्रित करें . ध्यान से pipeting द्वारा पीबीएस निकालें, गोलीदार गोलोइड परेशान किए बिना.
  3. 4 मिलीग्राम/एमएल कोलैजाइन बी के 250 डिग्री सेल्सियस के साथ गोलभों को अलग करें, 50 डिग्री ग्राम/एमएल DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl2 PBS में 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 30-45 मिनट के लिए धीरे-धीरे भंवरिंग और स्पंदन के साथ रुक-रुक कर कुछ सेकंड के लिए हर 5 मिनट।
  4. चरण 3.2 में समझाया गया है के रूप में धोने के कदम को दोहराएँ.
  5. निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार, एक वाणिज्यिक आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके विघटित गोलभों की कोशिकाओं से कुल आरएनए को अलग करें।
  6. रिवर्स एक वाणिज्यिक किट के साथ cDNA में अलग MRNA टाइप, निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार.
  7. वास्तविक समय पीसीआर द्वारा प्रतिकृति में प्रतिलेखन के स्तर को क्वांटिफी करें। प्राइमर का उपयोग किया गया था: [-SMA: Fw 5]-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3], रेव 5" ACAGAGTATTTTGCGCTCCGAA-3]15; Laminin [3 श्रृंखला: Fw 5]-GCTCAGGTGTTTGTGGTTGA-3], रेव 5]-TGTCTGCATGCCAATAGC-3]16; लेमिन [3 श्रृंखला: Fw 5]-GGCAGATGATGGCGAGAGA-3] Rev 5]-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3]17; Laminin [2 श्रृंखला: Fw 5]-GATGGCATTCGCGAGAAG-3] रेव 5]-TCGAGACTAGAGAACCTGG-3] 16; NG2: Fw 5[-CTGCAGGTATGTCGGTCA-3] रेव 5]-TTGGTTGCTGACTATG-3]18; integrin $3 subunit: Fw 5'-AGGGATTCAGGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATTACAT-3'19; TOP-1: Fw 5[-CCAGACGGACCGCGGAAAC-3] रेव 5]-GTCCAGGCTCTTTGAA-3]20|
  8. एक अंतर्जात संदर्भ जीन के Ct-मान के लिए Ct मान को सही करें जैसे कि समीकरण का उपयोग करके TOP-1: 2- [Ct] . [Ct ] [Ct (लक्ष्य नमूना) - [Ct (संदर्भ नमूना) और [Ct] Ct ] Ct के लक्ष्य जीन या संदर्भ जीन - TOP-I.

4. प्रवाह साइटोमेट्री पूर्णांक का विश्लेषण

  1. प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, 50 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में कम से कम 288 गोलभड़ (तीन 96-वेल प्लेट्स के अनुरूप) एकत्र करें। 1,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और ध्यान से पाइपिंग द्वारा मिथाइलसेलुलोस युक्त सुपरनेंट को हटा दें।
  2. 1x पीबीएस के 1 एमएल से धो लें और एक 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में गोलभड़ियों को स्थानांतरित करें। अपकेंद्रण चरण दोहराएँ और पाइपिंग द्वारा पीबीएस को सावधानीपूर्वक निकालें।
  3. चरण 3-3 में वर्णित स्रूपकोभों को अलग करें।
  4. चरण 4.2 में समझाया गया है के रूप में धोने के कदम को दोहराएँ.
  5. गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करने के लिए और Fc$-रिसेप्टर्स (CD16, CD32, और CD64) के लिए पहचान-संबंधित एंटीबॉडी के बंधन को रोकने के लिए, 2% घोड़े सीरम युक्त पीबीएस के 100 $L में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (या किसी अन्य पशु प्रजाति का सीरम, एंटीबॉडी नहीं होगा प्रयोग में इस्तेमाल किया) और 0.1% बीएसए के लिए 20 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस रोटेशन के साथ.
  6. अंतःकोशिक मार्कर को धुंधला करने के मामले में, चरण 2-2-2.5 के अंतर्गत वर्णित कक्षों को ठीक/
  7. पीबीएस के 100 डिग्री एल में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जिसमें 2% हॉर्स सीरम और 0.1% बीएसए को रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए शामिल किया गया है। प्राथमिक एंटीबॉडी को 10 ग्राम/एमएल से पतला करें।
  8. पीबीएस के 100 $L + 0.1% बीएसए के साथ तीन बार धो लें, बीच में 1,000 x g पर शीर्ष बेंच सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूगेशन चरणों के साथ।
  9. पीबीएस के 100 डिग्री एल में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जिसमें 2% हॉर्स सीरम और 0.1% बीएसए को रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए शामिल किया गया है। 10 ग्राम/एमएल के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
  10. चरण 4.7 में समझाया गया है के रूप में धोने के कदम को दोहराएँ।
  11. एक प्रवाह cytometer में 2.0 x 104 दाग कोशिकाओं का विश्लेषण करें. FSC-एसएससी डॉट साजिश के माध्यम से एकल लाइव कोशिकाओं के लिए गेट और चयनित फ्लोरोफोर के लिए उपयुक्त चैनल पर गेटेड कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट का विश्लेषण।

5. आक्रमण परख heterospheroids का उपयोग कर

  1. हेटेरोस्फोरॉइड्स के लिए गोलभण् ड निर्माण विलयन तैयार की, जिसमें विभिन्न कोशिका प्रकार और संगत माध्यम होते हैं, जैसा कि सारणी 1में संक्षेप किया गया है। कोशिकाओं को पहले या तो mCherry या GFP अभिव्यक्ति के लिए वेक्टर युक्त lentivirus के साथ ट्रांसड्यूसर किया गया था.
  2. प्लेट के प्रत्येक कुएं में गोलोइड गठन समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस भरें और प्रत्येक कुएं में एक गोलभॉइड का निर्माण करने की अनुमति देने के लिए 24 ज के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  3. एक 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में चूहे पूंछ कोलेजन I के 2 मिलीग्राम/एमएल, वाणिज्यिक जेलिंग मैट्रिक्स का 30% और लैमिन-332 के 2.5 ग्राम/एमएल युक्त जिलेटिन मैट्रिक्स मिश्रण के 60 डिग्री एल तैयार करें। जेड-स्लाइड एंजियोजेनेसिस चैम्बर के 3 कुओं में 15 डिग्री सेल्सियस तेजी से वितरित करें। प्रत्येक अच्छी तरह से पहले से ही जेल युक्त में एक गोलभभकां.
  4. यदि आवश्यक हो, तेजी से माइक्रोस्कोप के तहत एक पाइपेट के साथ अच्छी तरह से के केंद्र के लिए गोलोइड के स्थान को समायोजित.
  5. अगले हेटेरोस्फोरॉइड्स के लिए चरण 5-2-5.3 दोहराएँ और होमोस्फोरॉइड्स के लिए फिर से दोहराएँ।
  6. 1 ज के लिए इनक्यूबेटर में जैल को एकजुट करने के लिए इनक्यूबेट करें और, फिर, सेल संस्कृति माध्यम के साथ जैल को धीरे से ओवरले करें।
  7. लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा गोलभॉइड्स को छवि करें। एक z-स्टैक के विभिन्न ऑप्टिकल विमानों पर और आक्रमण के विभिन्न समय बिंदुओं पर गोलोइड के विभिन्न ऑप्टिकल पार अनुभाग ले लो (उदा., 0 ज, 24 ज, 48 ज और 72 ज).
  8. कैंसर कोशिकाओं पर हमला करने की संख्या की गणना करके छवियों का विश्लेषण करें। कोशिकाओं पर हमला उन लोगों कि गोलाभ छोड़ दिया है और आक्रामक क्षेत्र में प्रवेश कर रहे हैं. आक्रामक क्षेत्र बाहरी और आंतरिक परिधि के बीच अंगूठी क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है furthest पर हमला सेल द्वारा और आक्रमण प्रयोगों की शुरुआत में गोलाभ की गोलिद सीमा द्वारा, क्रमशः, पूरक चित्रा 2 में उल्लिखित के रूप में .

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Representative Results

इस प्रयोगात्मक डिजाइन के परिणाम मार्टिन्स Cavaco एट अल में प्रकाशित कर रहे हैं13, जो निष्कर्ष है कि इन प्रयोगों से तैयार किए गए पर आगे पढ़ने के लिए सिफारिश की है.

चित्र 1, एक इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्फीरॉइड की एक प्रतिनिधि छवि, अमरीकृत सामान्य फाइब्रोब्लास्ट और अमर CAFs दोनों के integrin के इम्यूनोस्टेनिंग से पता चलता है (चित्र 1A), साथ ही इम्यूनोफ्लोरेसेंट परिमाणीकरण (चित्र 1ख) और ुपीसीआर द्वारा अंकांक3 उपइकाई जीन के प्रतिलेखनीय स्तर (चित्र 1ब्) . परिणामों का यह पैनल दर्शाता है कि सामान्य समकक्ष की तुलना में iCAFs में integrin $3 को विनियमित किया जाता है। यह साबित कर दिया कि integrin ]3 ] 1 अग्नाशय फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव के लिए एक मार्कर माना जा सकता है. यह भी प्रवाह साइटोमेट्री अध्ययन13द्वारा प्रदर्शित किया गया था .

Figure 1
चित्र 1. integrin की अभिव्यक्ति $ 3 subunit iNFs और iCAFs द्वारा. integrin - 3 subunit iCAFs द्वारा विनियमित है, अग्नाशय CAFs के लिए एक भेदभाव मार्कर के रूप में अपनी क्षमता को दर्शाती है. (ए) आईसीएएफ के समस्थितिकों की तुलना में सामान्य अग्नाशयी फाइब्रोब्लास्ट्स (आईएनएफएस) के समउपरूपों का इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधलान विभेदित कोशिकाओं में समानिग्ध उपइकाई के संकेत को दर्शाता है। (बी) स्फीरॉइड में कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट संकेत को ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए 3D स्फीरॉइड के $-स्टैक छवियों के साथ मात्रा निर्धारित किया गया था। इसका मतलब है कि तीन स्वतंत्र प्रयोगों के SEM दिखाए जाते हैं और टी-परीक्षण (*, p और lt; 0.1) की तुलना में हैं। (ग) विसंबद्ध गोलभों से प्राप्त कोशिकाओं का प्रत्यायोजनकेशीय उपइकाई के प्रतिलेखनीय स्तरों के लिए विश्लेषण किया गया था। इसका अर्थ है - दो स्वतंत्र प्रयोगों से होने वाले परिवर्तनों के रूप में $Ct-मानों का SEM ते-परीक्षण द्वारा दर्शाया जाता है और उसकी तुलना की जाती है। यद्यपि 0-1 के महत्व स्तर तक नहीं पहुंच रहा है, फिर भी iNFs की तुलना में iCAFs में integrin $3-एन्कोडिंग MRNA का प्रतिलेखन स्तर अधिक होता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हेटेरोस्फरॉइड्स
कोशिकाओं के प्रकार (25 तक पारित) कक्षों की संख्या मध्यम (1 भाग मेथिलसेलुलोस +...)
mCherry-iCAFs + GFP-AsPC-I 400 सीएएफ + 400 अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं 1,5 भागों सेल एमईएम के साथ 10% FBS और 1% कलम /
mCherry-$3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I
mCherry-iCAFs + GFP-PANC-I 1,5 भागों सेल एमईएम के साथ 10% FBS और 1% कलम /
mCherry-$3KO-iCAFs + GFP-PANC-I
होमोस्फरॉइड्स
सेल प्रकार (25 तक पारित) कक्षों की संख्या मध्यम (1 भाग मेथिलसेलुलोस +...)
एमचेरी-आईसीएएफ 400 कोशिकाओं 3 भागों एमईएम FBS के 10% और 1% कलम /
mCherry-$3KO-iCAFs
जीएफपी-एपीसी-I FBS के 10% और 1% कलम के साथ 3 भागों RPMI /
जीएफपी-पैन-I FBS के 10% और 1% कलम के साथ 3 भागों DMEM /

तालिका 1. विषम-तथा समरूपीय की कोशिका संघटन। विषम-तथा समचतुर्बंधों तथा संगत माध्यम को एकत्र करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या, जिसका उपयोग स्वाभ निर्माण समाधान के लिए किया जाना चाहिए, को निम्न तालिका में संक्षेपित किया जाता है।

पूरक चित्र 1. स्फीरोइड में ब्याज की एक प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला के परिमाणीकरण के लिए अनुक्रमिक कदम, ImageJ का उपयोग कर. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2. आक्रमण परख में कैंसर कोशिकाओं पर हमला करने की संख्या की मात्रा निर्धारण के लिए अनुक्रमिक कदम, ImageJ का उपयोग कर. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सीएएफ भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त विकसित करना एक चुनौतीपूर्ण कार्य है। विभिन्न दृष्टिकोणों को रोजगार के बाद, हम निष्कर्ष निकाला है कि एक 3 डी गोलाभ मॉडल अधिक व्यावहारिक, शारीरिक और नैदानिक रूप से प्रासंगिक मॉडल है, जिसमें अमर CAFs के साथ अग्नाशय कार्सिनोमा कोशिकाओं के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन किया जा सकता है. इस मॉडल फाइब्रोब्लास्ट्स के सहज भेदभाव को रोका, इस तरह के सेल संस्कृति प्लास्टिक की कठोरता के रूप में artefactual तनाव के कारण, कम से कम अल्पकालिक संस्कृति की स्थिति में (अप करने के लिए 48 ज). हालांकि इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गोलाकार की सटीक कठोरता मापा नहीं गया था, Ito एट अल. मानव नाभि शिरा endothelial कोशिकाओं और mesenchymal स्टेम सेल विषमसंहरॉइड एक रोबोट एकीकृत microfluidic चिप22का उपयोग कर की कठोरता का मूल्यांकन किया. हेटेरोस्फरॉइड्स की औसत कठोरता-इंडेक्स को विधानसभा के 1 और 3 दिनों के बाद मापा गया था। स्फीरॉइडों का आकार भिन्न था, एमएससी उनकी एकत्रीकरण क्षमता में वृद्धि प्रतीत होती थी, जिसके परिणामस्वरूप समय के साथ आकार में कमी आई (135.5 डिग्री से 99.8 उउ)21,22. परिणामस्वरूप, स्फीरॉइड की कठोरता भी 5.0 x 10-3 से बढ़कर 7.5 x 10-3 पा22हो गई। हालांकि, सीएएफ और AsPC-I की विषमप्ररूपी आबादी से बना गोलभों की कठोरता में फाइब्रोब्लास्ट/सीएएफ की एकल आबादी से बने होमोस्फीरॉइड के लोगों से अलग यांत्रिक गुण और कठोरता मूल्य हो सकते हैं। यह अभी भी अज्ञात है और क्या Ito एट अल22द्वारा वर्णित किया गया था से अलग हो सकता है . कठोरता भी राशि और सेल का उत्पादन किया और जमा ECM के पार लिंक पर निर्भर करता है, गोलभय के भीतर विभिन्न सेल सेल बातचीत पर, गोलोइड के भीतर कोशिकाओं की संख्या पर या संस्कृति की अवधि पर.

किसी भी अन्य मॉडल की तरह, प्रयोगात्मक डिजाइन कुछ चर है कि इस तरह के गोलोइड बनाने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के रूप में अनुकूलन की जरूरत शामिल है, उपचार और सूक्ष्म इमेजिंग के समय अंक. वर्णित प्रायोगिक डिजाइन को एक स्फीरोइड आकार के उद्देश्य से अनुकूलित किया गया था, जिसका पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के प्रसार में कम से कम प्रभाव होगा, क्योंकि बड़े पैमाने पर परिवहन सीमाओं9के कारण प्रसार सीमा है। उदाहरण के लिए, 150-200 उ से अधिक आकार के स्फीरॉइडों में ऑक्सीजन का परिवहन काफी प्रभावित होता है तथा साथ ही300 उ 9,18से अधिक समुच्चय में ग्लूकोज तथा लैक्टेट का विसरा दतका हुआ होता है। 400-500 उ से बड़े व्यास वाले स्फूर्तियुक्त एक संकेंद्री स्तरित संरचना प्रस्तुत करते हैं जिसमें एक नेक्रोटिक कोर होता है जो शांत कोशिकाओं की एक व्यवहार्य परत और प्रसारकोशिकाओं की बाहरी रिम9,24से घिरा होता है . यौगिकों के सीमित प्रसार से बचने के लिए, और दुर्गम स्फीरॉइड कोर की समस्या को खत्म करने के लिए, कोशिकाओं को स्फीरॉइड गठन से पहले टीजीएफ-जेड 1, बीएम 2 और लेबीन-1 के साथ इलाज किया गया, जब कोशिकाओं को अलग-अलग स्फीरॉइड गठन समाधान में निलंबित कर दिया जाता है। इसके अलावा, गोलाभ में अधिकांश कोशिकाओं को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की उपलब्धता की अनुमति देने के लिए और एक नेक्रोटिक कोर के गठन को रोकने के लिए, गोलोइड प्रति कोशिकाओं की संख्या को 750-1000 कोशिकाओं तक कम कर दिया गया था, जो 140-200 डिग्री मीटर के व्यास के साथ गोलभड़ियों का निर्माण करते हैं।

यह अच्छी तरह से गोलोइड गठन समाधान में विभिन्न सेल प्रकार मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है, तो गोलोइड कोशिकाओं की लगभग एक ही संख्या से बना रहे हैं, गोलोइड के बीच महत्वपूर्ण आकार के अंतर से बचने. फिर भी, कभी-कभी कुछ गोलभों को दूसरे से थोड़ा बड़ा किया जा सकता है और इसके परिणामस्वरूप सूक्ष्मदर्शी में प्राप्त किए गए अधिक-स्टैक हो सकते हैं। कुछ गोलाकार भी पूरी तरह से गोलाकार रूप से विचलित हो सकते हैं, लेकिन यह भी ध्यान में रखा जाता है जब गोलाभ का ROI वर्णन किया जाता है। आकार और आकार के इन मतभेदों को सामान्यीकृत परिमाणीकरण मानों में माना जाता है जैसा कि अगले पैराग्राफ में समझाया गया है। स्फीरॉइड के आकार के बारे में एक अन्य महत्वपूर्ण कारक कोशिका प्रकार है। उदाहरण के लिए, फाइब्रोब्लास्ट और CAFs लगभग गोलाकार रूप के साथ गोलभॉइड बनाते हैं, जबकि AsPC-I और PANC-I कोशिकाएं कोशिकाओं का अधिक फैलाने वाले समुच्चय का निर्माण करती हैं।

गोलाभ को इमेजिंग के लिए, निश्चित गोलोइड के क्रायोसेक्शन का भी उपयोग किया जा सकता है, हालांकि सेल प्रकार और इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल के आधार पर, फ़ीरॉइड की अखंडता के साथ अनुभाग पर समझौता किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, अपनी 3 डी संरचना में पूरे स्फीरॉइड का धुंधला, एक सरल विकल्प साबित हुआ। एक 3 डी संरचना के रूप में गोलोइड के सूक्ष्म जेड stacked चित्रों को प्राप्त करने के औसत पर लेता है 5-15 मिनट गोलाभ.

वे 3 डी संरचनाओं के विमानों का प्रतिनिधित्व के रूप में गोलोइड की छवियों में इम्यूनोफ्लोरेसेंट संकेतों की मात्रा निर्धारित करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं। प्रयोग की जाने वाली विधि पहले से वर्णित एक पर आधारित थी, जहां लेखकों ने एक कक्ष14के लिए गोलभ को अतिरिक्त और माना जाता था। इस तरह, फ्लोरोसेंट संकेत समीकरण 1का उपयोग कर सही है।

पृष्ठभूमि के रूप में, ब्याज की एक सेल मुक्त क्षेत्र के एकीकृत संकेत घनत्व (आरओआई) निर्धारित किया गया था. मापा एकीकृत संकेत घनत्व चयनित ROI के भीतर पिक्सल की तीव्रता मूल्यों का योग है. चूंकि गोलाभभों 3 डी संरचनाओं रहे हैं, विभिन्न ढेर से confocal छवियों का अधिग्रहण कर रहे हैं. ऐसी छवियों को संसाधित करने के लिए एक व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक ढेर में फ्लोरोसेंट संकेत उपाय या एक $ प्रक्षेपण में सभी ढेर के योग का उपयोग कर सकते हैं. सभी परिमाणीकरण ImageJ का उपयोग कर किया जा सकता है. स्फीरोइड का कुल सही फ्लोरोसेंट (टीसीएफ) समीकरण 2का उपयोग करते हुए, गोलोइड के क्षेत्र और ढेर की संख्या पर विचार करते हुए, सामान्यीकृत टीसीएफ के रूप में निर्धारित किया जाता है। यह गोलोभों के अलग-अलग आकारों और गोलाकार आकार में विसंगति के लिए जिम्मेदार है। इस विधि का उपयोग करके अश्रूपीय दाग का विश्लेषण करने से प्रति अफलाभ 5 मिनट तक का समय लग सकता है।

इसी प्रकार, आस-पास के स्ट्रोमल मैट्रिक्स में गोलाभ से कोशिकाओं के आक्रमण का विभिन्न एल्गोरिदम द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। एक सीधा तरीका पहले Nowicki एट अल, जिसमें आक्रामक कैंसर कोशिकाओं23गिना गया द्वारा वर्णित किया गया था. आक्रमण नहीं करते हैं कि लोगों से आक्रामक कोशिकाओं भेदभाव करने के लिए, यह कोशिकाओं गोलाभ संरचना छोड़ दिया है करने के लिए माना जाता है, जिसके पार एक स्थानिक सीमा स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, प्रारंभिक बिंदु प्रारंभिक समय बिंदु (समय 0) पर अधिग्रहीत spheroid छवियों की परिधि से मेल खाती है जो सीमा है, जब spheroids जेल में एम्बेडेड थे. सेल है कि जेल पर आक्रमण दूर एक इनवेसिव सेल तक पहुँच सकते हैं अधिकतम दूरी माना जाता है, और इस प्रकार, यह आक्रमण क्षेत्र के बाहरी रिम को परिभाषित करता है. इस विधि आक्रामक कैंसर कोशिकाओं है कि हमलावर क्षेत्र में मौजूद हैं मायने रखता है, ImageJ से गिनती उपकरण का उपयोग कर, और समय पर गोलाभ के लिए इसी ROI 0 h ROI प्रबंधक को जोड़ा जाता है और फिर एक ही सटीक spheroid की छवि को स्थानांतरित 48 का अधिग्रहण ज या 72 घंटे बाद. इस कारण से, यह महत्वपूर्ण है कि गोलाकार अधिग्रहण के विभिन्न समय के दौरान, संभव के रूप में विमानों के केंद्र के करीब रहता है। कोशिकाओं की संख्या की गणना 5 मिनट प्रति गोलिता तक ले जा सकते हैं.

एक अन्य महत्वपूर्ण विचार विषमस्फिरॉइड में विभिन्न कोशिका प्रकारों में अंतर करना है। यह लाइव सेल फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके किया जा सकता है, जो समस्या पैदा हो सकती है जब सेल प्रकार में उच्च सेल विभाजन दर होती है या यदि प्रयोग लंबे समय तक किया जाना है। अधिक मजबूत और विश्वसनीय तरीका दो अलग अलग आबादी भेद करने के लिए इस तरह के mCherry और GFP के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त सेल लाइनों को विकसित करने के लिए है. अभिव्यक्ति वैक्टर की डिलीवरी lentivirus का उपयोग कर के लिए किया जा सकता है, जो इन प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति में परिणाम.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं। यह सामग्री केवल लेखक के विचारों को दर्शाता है और यूरोपीय संघ किसी भी उपयोग है कि उसमें निहित जानकारी से बनाया जा सकता है के लिए उत्तरदायी नहीं है.

Acknowledgments

हम BM2 और lebein-1 की तैयारी में बारबरा Schedding की मदद स्वीकार करते हैं. हम गोलाभ परख में अपनी विशेषज्ञता साझा करने के लिए $gnes नोएल स्वीकार करते हैं. हम S2 शर्तों के तहत lentiviral transfection से निपटने में उनकी मदद के लिए सोनिया Schelhaas और माइकल Sch$fers धन्यवाद. हम अग्नाशय के कैंसर के ऊतकों से CAFs तैयार करने में सबीन वॉन R$den की सहायता स्वीकार करते हैं.

इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान को यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम FP7/2007-2013/ के पीपुल्स प्रोग्राम (मैरी क्यूरी एक्शन्स) से आरईए अनुदान समझौते एन जेड (316610) से जेएई को वित्त पोषण प्राप्त हुआ है। इसके अलावा, जे.ए.ई. और ए.सी.एम.सी. को सेल-इन-मोशन क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस (EXC 1003-CiM) के भीतर ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। इस परियोजना को विल्हेम सैंडर स्टिफटंग (अनुदान: 2016.113.1 से जे.ए.ई.) द्वारा भी समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) SIGMA-ALDRICH D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
Acetone SIGMA-ALDRICH 32201
Albumin Fraction V - BSA AppliChem A1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse Invitrogen A11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit Invitrogen A11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) Santa Cruz sc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 Millipore AB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) SIGMA-ALDRICH C6198
AsPC-1 cell line ATCC Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifuge Fisher Scientific 50-589-620 Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2) Fluka 21074
Centrifuge Thermo Scientific Multifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mL Corning 430290
Collagenase B Roche 11088831001
Collagen-I, rat tail Gibco A10483-01
Confocal microscope Zeiss LSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L) Lonza BE12-604F
Dnase I Roche 10104159001
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCaliburTM
Gelifying matrix ThermoFisher Scientific A1413202 Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotype DAKO X 0907
Horse Serum SIGMA-ALDRICH 12449-C
Human Primary Pancreatic Fibroblasts PELOBiotech PB-H-6201
Incubator Heraeus B6060
Laminin-332 Biolamina LN332
MEM SIGMA-ALDRICH M4655
Microplate, 96 wells, U-bottom Greiner Bio-One 650101
Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Mouse IgG, isotype SIGMA-ALDRICH I8765
Multi axle rotating mixer CAT RM5 80V
PANC-I ATCC Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
Paraformaldehyde Riedel-de Haën 16005
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
QuantiTect Reverse Transcription Kit Qiagen 205310
Rat IgG, isotype Invitrogen 10700
Reaction tubes, 1.5 mL Greiner Bio-One 616201
Real-time PCR cycler Qiagen Rotor-Gene Q
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074
RPMI Lonza BE12-702F Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100 SIGMA-ALDRICH X100RS
Vórtex Scientific Industries Vortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoated Ibidi 81501

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References

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

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कैंसर अनुसंधान अंक 150 गोलभड़ सीएएफ 3 डी मॉडल भेदभाव इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला क्यूपीसीआर प्रवाह साइटोमेट्री आक्रमण extracellular मैट्रिक्स जेल
कैंसर के लिए एक अधिक शारीरिक प्रणाली के रूप में एक 3 डी Spheroid मॉडल-एसोसिएटेड Fibroblasts भेदभाव और विट्रो अध्ययन में आक्रमण
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Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (150), e60122, doi:10.3791/60122 (2019).

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