Summary
Målet med detta protokoll är att etablera en 3D in vitro-modell för att studera differentiering av cancerassocierade fibroblaster (CAFs) i en tumör bulk-liknande miljö, som kan åtgärdas i olika analyssystem, såsom immunofluorescens, transkriptionella analys och livs cell avbildning.
Abstract
Att definiera den ideala modellen för en in vitro-studie är viktigt, främst om man studerar fysiologiska processer såsom differentiering av celler. I tumören stroma, värd fibroblaster stimuleras av cancerceller att differentiera. Sålunda, de förvärvar en fenotyp som bidrar till tumören mikromiljö och stöder tumör progression. Genom att använda sfäroid-modellen har vi inrättat ett sådant 3D in vitro-modellsystem, där vi analyserade rollen som laminin-332 och dess receptorintegrin α3β1 i denna differentierings process. Detta sfäroid modellsystem inte bara återger tumören mikromiljö villkor på ett mer exakt sätt, men också är en mycket mångsidig modell eftersom det tillåter olika nedströms studier, såsom Immunofluorescerande färgning av både intra-och extracellulära markörer, samt deponerade extracellulära matrix proteiner. Dessutom kan transkriptionella analyser av qPCR, flödescytometri och cellulär invasion studeras med denna modell. Här beskriver vi ett protokoll av en sfäroid modell för att bedöma rollen av Cafs integrin α3β1 och dess ectopically deponeras ligand, laminin-332, i differentiering och stödja invasionen av cancer i bukspottskörteln celler.
Introduction
Tumören mikromiljö är en mycket komplex nisch och oerhört viktigt för underhåll och progression av tumörcellerna1. Det bildas inte bara av cancerceller utan också av stromacellstumörer fibroblaster. Tumörcellerna är omgivna av en stroma som är specifik och skiljer sig från stroma av normala vävnader2. Laminin-332 är en extracellulär matrix protein ectopically uttrycks i stroma av olika tumörer, såsom i bukspottskörteln adenocarcinom3. Dessutom, den biokemiska sammansättningen av ECM och även dess biofysiska egenskaper, såsom stelhet och spänningar, förändring inom tumören bulk4. Denna tumör stroma, eller "reaktiv stroma", orsakas av en anpassning av fibroblaster till angränsande cancerceller och genom rekrytering av andra mycket viktiga aktörer som utvecklar en gynnsam och stödjande miljö för tumör progression. Differentieringen av stromacellstumörer fibroblaster resulterar i cancerassocierade fibroblaster (CAF). Dessa celler kan identifieras med hjälp av olika markörer såsom α-glatt mus kula tal aktin (αsma)5 eller neural/Glial antigen 2 (NG2)6.
Den mest lämpade in vitro -modellen för att recapitulate tumören mikromiljö (TME) med Cafs är svårt att välja. Metoden för att efterlikna de fysiologiska parametrarna för TME på ett kostnadseffektivt och reproducerbart sätt måste övervägas för ett sådant modellsystem. Inom TME förekommer olika processer, såsom spridning, differentiering, migration och invasion av de olika celltyperna. Dessa cellulära processer kan utföras individuellt med olika metoder. Emellertid, experimentella förhållanden måste överväga cellulära interaktioner med tumören stroma ECM, eftersom styvheten i underlaget påverkar CAF differentierings processen. R.G. Wells kommenterade effekterna av mat ris stelhet på cellens beteende och betonade att cytoskelett organisation och differentiering status observerats i in vitro odlade celler kan vara artefakto7. Olika stimuli verkar vara inblandade i CAF differentiering, inklusive mekanisk spänning5,7. För att undvika detta kan 2D mjuka substrat vara möjliga metoder för differentiering studier, eftersom de kringgår problemet med den stela kulturen skålen plast. En mjuk 2D-yta, som fibroblaster kan odlas, kan vara kollagen-I belagda polyakrylamidgeler, varvid gel stelhet kan manipuleras genom koncentrationen av polyakrylamid och gel Cross-Linker. Vidhäftning och bildandet av αSMA-rika stress fibrer förstärks i fibroblaster tillsammans med gel styvhet8. Dessa resultat betonar vikten av mjuka substrat ställningar för mer fysiologiska in vitro-differentieringsmodeller. Men i våra händer var experimentell reproducerbarhet och avbildning av dessa geler utmanande. För att övervinna dessa brister, bytte vi 2D mjuka substrat system för en 3D sfäroid modell för differentiering och invasion studier. Denna modell är mer kliniskt relevant och liknar en in vitro-Organoid, recapitulates in vivo cell-cell interaktioner, ECM produktion och deposition, samt cell Behavior9.
Spheroids bildas när celler saknar ett substrat att hålla sig till. När cellerna lämnas utan en limyta, de aggregat för att bilda en mer eller mindre sfärisk struktur. Om sfäoiderna består av en typ av cell, de kallas homospheroids; om de består av två eller flera olika celltyper de bildar heterospheroids.
Bland de olika metoderna för sfäroid beredning, utför vi protokollet med icke-adherent rund botten 96-bra tallrikar. Det är mycket effektivt med hänsyn till kostnaderna. Här producerar vi både homospheroids av fibroblaster, CAF eller Cafs saknar integrin α3 subenhet att undersöka differentierings processen och heterospheroids av Cafs eller integrin α3 Ko Cafs och bukspottskörteln kanal cancerceller (ASPC-i och Panc-i) för att studera invasionen i den omgivande matrisen.
Syftet med dessa studier var att använda primära CAFs isolerade från mänskliga pankreascancer biopsier. Emellertid, biopsier att få cellerna är knappa och av denna anledning, CAFs används i dessa studier har förevigat med hjälp av lentivirus som innehåller HTERT. De kallas iCAFs, och deras normala motsvarigheter, primära mänskliga bukspottskörteln fibroblaster, kallas iNFs. Den mänskliga bukspottskörteln fibroblaster och bukspottskörteln kanal cancerceller, AsPC-I och PANC-I, är kommersiellt tillgängliga.
Detta protokoll användes för att studera effekten av laminin-332-integrin interaktion i CAF differentiering process. För att bevisa specificitet av denna interaktion och dess funktion, inhibitorföreningar användes: BM2, en monoklonal antikropp som blockerar integrin bindningsstället laminin-332 α3 Chain10, eller lebein 1, en ormgift härledd förening som blockerar lamininbindande integriner α3β1, α6β1 och α7β111,12.
För invasionen analysen, celler hade omvandlas med lentivirus som innehåller cDNA kodning antingen mCherry (iCAFs och integrin α3 KO iCAFs) eller GFP (AsPC-i och PANC-I) för att skilja de olika celltyper i heterospheroids. Transduktion av cellerna för att föreviga dem och/eller att märka dem med fluorescerande protein (mCherry och GFP) uttryck beskrivs i en tidigare studie13, som bör konsulteras för ytterligare information.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.3D spheroids som en in vitro-modell för fibroblast/CAF differentiering med olika TGF-β1 hämmande föreningar av cell-Matrix interaktion
- Blanda 1 del av 6 mg/ml metylcellulosa lösning och 3 delar av cellkultur media, MEM kompletteras med 1% av Värmeinaktiverade foster bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin att få sfäroid formation lösning.
- Omsuspendera nyligen upptinade förevigat normala fibroblaster (INFS), förevigade CAF (icafs) eller integrin α3β1 Ko icaf (passage upp till 25) i sfäroid formation lösning. Om förbereder 1 96 väl plattan, förbereda ett överskott av sfäroid formation lösning, 10 ml och tillsätt 75 000 celler, med tanke på att varje sfäroid består av 750 celler, och att 100 μl fördelas per varje brunn av plattan.
- Om cytokiner eller integrin hämmare ingår i studien, tillsätt dessa föreningar till cellsuspensionen, för att bädda in dem i spheroids under deras bildande. Observera att iNFs stimuleras med 10 ng/mL TGF-β1 för att utlösa differentiering. I förekommande fall, tillsätt inhibitoren föreningar tillsammans med TGF-β1, som 20 μg/mL BM2 eller 10 μg/mL lebein 1.
- Förbered CAF homospheroids på samma sätt men utan TGF-β1 stimulus, eftersom de redan är differentierade. Förbered integrin α3 KO CAF homospheroids utan tillsats av någon förening.
- Fördela sfäroid formation lösning på en rund botten 96 multi-well plattan genom att lägga till 100 μl av lösningen i varje brunn. Varje gång sfäroid-lösningen fördelas i brunnarna, blanda väl genom att Pipettera upp och ner, flera gånger.
- Placera plattan i cellkulturen inkubator för 24 h att låta en sfäroid bildas i varje brunn.
- Samla spheroids efter ca 24 h och använda dem för olika nedströms ändamål: Immunofluorescerande färgning, realtid (RT) q-PCR och flödescytometri. För att detektera uttryck av intra-och extracellulära antigener, inklusive avsättning av ECM-proteiner inom sfäroid, Använd immunofluorescensfärgning. Efter sönderfall av spheroids i enskilda celler, kvantifiera membran-förankrade receptor av flödescytometri. För att detektera genaktivering och transkriptionella förändringar, Använd RT q-PCR av mRNA isolerat från sfäroid celler.
2. Immunofluorescerande färgning av spheroids
- Samla spheroids efter ca 24 h i en 1,5 mL reaktionsröret per försöks tillstånd eller per protein som ska analyseras. Till exempel, placera spheroids av iNFs stimuleras med TGF-β1 i ett rör som skiljer sig från kontroll iNFs, som inte behandlades. För att undvika bristning av spheroids på grund av alltför starka skjuvkrafter, skär änden av pipettspetsen för att förstora öppningen. Inkludera minst 5-10 spheroider i ett reaktionsrör, för att tillåta replikat och ta hänsyn till eventuella förluster under tvätt stegen.
- Centrifugera spheroids med en bänkskiva centrifug för ca 30-60 s vid 1 000 x g. Ta försiktigt bort den metylcellulosahaltiga supernatanten genom att Pipettera, utan att störa pelleterade spheroids.
- Tvätta med 50 μL 1x PBS. Upprepa centrifugeringssteget och ta försiktigt bort PBS genom pipettering, enligt beskrivningen i 2,2.
- Beroende på proteinet som ska färgas, fixera med 50 μL av 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 20 minuter vid rumstemperatur (för αSMA, NG2 och integrin α3β1) eller med 50 μL metanol i 10 min vid-20 ° c (för laminin-332 subenheter).
- Upprepa tvättsteget enligt beskrivningen i steg 2.2-2.3.
- Permeabilize cellerna med 0,1% Triton-X i PBS för 4 min vid rumstemperatur.
- Upprepa tvättsteget enligt beskrivningen i steg 2.2-2.3 tre gånger.
- Inkubera spheroids i PBS som innehåller 5% FBS och 2% BSA, för 1 h vid RT för att blockera icke-specifika protein interaktions platser.
- Inkubera spheroiderna med 30 μL primär antikroppar i PBS, 2,5% FBS och 1% BSA vid 4 ° c över natten. Följande primära antikroppar användes: anti-αSMA CY-3 konjugerad och anti-NG2 vid 5 μg/mL; BM2 anti-laminin α3, 6F12 anti-laminin β3 och anti-laminin γ 2 20 μg/mL.
- Upprepa tvättsteget enligt beskrivningen i steg 2.2-2.3 tre gånger.
- Inkubera spheroiderna med 30 μL sekundära antikroppar i PBS, 2,5% FBS och 1% BSA vid RT för 90 min. Följande sekundära antikroppar som användes var: Alexa 488 anti-kanin och anti-mus (5 μg/mL).
- Upprepa tvättsteget enligt beskrivningen i steg 2.2-2.3 tre gånger.
- Inkubera cellerna med 30 μL DAPI-Färgnings lösning i 4 minuter vid rumstemperatur.
- Upprepa tvättsteget enligt beskrivningen i steg 2.2-2.3.
- Placera sfäoiderna på en glas rutschbana, i en droppe PBS, med hjälp av ett glas Pasteur pipet.
- Avbilda spheroiderna med fluorescensmikroskopi i ett Laser skannings Mikroskop med en förstoring på 10X. Ta olika optiska tvärsnitt av sfäroid på olika optiska plan av en z-stack (15-20 stack flygplan). För att fastställa laser inställningarna i mikroskopet, Använd en sfäroid består av celler negativa för antigen av intresse eller en sfäroid färgade endast med den sekundära antikroppen. Återanvända samma inställningar för alla prover som ska jämföras.
- Analysera mikroskopiska bilder med ImageJ programvara som publicerats tidigare14. Stegen sammanfattas i kompletterande figur 1. Som bakgrund, bestämma den integrerade signal tätheten av en cell-fri intresse region (ROI). Beräkna den totala korrigerade cellen fluorescens (TCCF) som:
- Bestäm den totala korrigerade fluorescensen (TCF) av spheroids som TCCF normaliserade till området för sfäroid och antalet stackar.
3. RT q-PCR för homospheroids
- För att utföra RT-qPCR, samla minst 288 spheroids (motsvarande 3 96-väl plattor) i en 50 mL reaktionsröret. Centrifugera i 5 min vid 1 000 x g och ta försiktigt bort den metylcellulosahaltiga supernatanten genom att Pipettera utan att störa pelleterade spheroids.
- Tvätta med 1 mL 1x PBS och överför spheroiderna till ett 1,5 mL reaktionsrör. Centrifugera spheroids med en bänkskiva centrifug för ca 30-60 s vid 1 000 x g. Ta försiktigt bort PBS genom pipettering, utan att störa pelleterade spheroids.
- Separera spheroids med 250 μl av 4 mg/ml kollagenas B, 50 μg/ml DNase i, 2% BSA, 1 mm CaCl2 i PBS vid 37 ° c i ca 30-45 min genom att försiktigt vortexa och pulserande intermittent i några sekunder var 5 min.
- Upprepa tvättsteget enligt beskrivningen i steg 3,2.
- Isolera det totala RNA från cellerna i desinated spheroids med hjälp av en kommersiell RNA-isolering kit, enligt tillverkarens anvisningar.
- Omvänd transkribera den isolerade mRNA till cDNA med en kommersiell sats, enligt tillverkarens anvisningar.
- Kvantifiera transkriptionsnivåer i replikat med realtids PCR. De primers som används var: α-SMA: FW 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ′, rev 5 ′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 ′15; Laminin α3 kedja: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′16; Laminin β3 kedja: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; Laminin γ2 kedja: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′18; integrin α3 subunit: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '19; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.
- Korrigera CT-värdena för CT-värdet för en endogen referens gen såsom TOP-1 med ekvationen: 2-δδct. ΔΔCt = ΔCt (mål prov) – ΔCt (referensprov) och ΔCt = CT av målgen eller referens gen – TOP-I.
4. flödescytometri analys av integrin Expression
- För flödescytometrisk analys, samla minst 288 spheroids (motsvarande 3 96-väl plattor) i ett 50 mL reaktionsrör. Centrifugera i 5 min vid 1 000 x g och ta försiktigt bort den metylcellulosahaltiga supernatanten genom pipettering.
- Tvätta med 1 mL 1x PBS och överför spheroiderna till ett 1,5 mL reaktionsrör. Upprepa centrifugeringssteget och ta försiktigt bort PBS genom pipettering.
- Dissociera sfäoiderna enligt beskrivningen i steg 3,3.
- Upprepa tvättsteget enligt beskrivningen i steg 4,2.
- För att blockera icke-specifika bindningsställen och för att förhindra bindning av detekterings relevanta antikroppar mot Fcγ-receptorer (CD16, CD32 och CD64), inkubera cellerna i 100 μL PBS innehållande 2% häst serum (eller serum från en annan djurart, vars antikroppar inte kommer att används i experimentet) och 0,1% BSA i 20 minuter vid 4 ° c med rotation.
- Vid färgning av intracellulära markörer, Fix/permeabilize cellerna enligt beskrivningen i steg 2.2-2.5.
- Inkubera cellerna med de primära antikropparna i 100 μL PBS innehållande 2% häst serum och 0,1% BSA i 30 min vid 4 ° c med rotation. Späd den primära antikroppen till 10 μg/mL.
- Tvätta med 100 μL PBS + 0,1% BSA tre gånger, med centrifugering steg i toppen bänk centrifug vid 1 000 x g däremellan.
- Inkubera cellerna med de sekundära antikropparna i 100 μL PBS innehållande 2% häst serum och 0,1% BSA i 30 min vid 4 ° c med rotation. Späd sekundär antikropp till 10 μg/mL.
- Upprepa tvättsteget enligt beskrivningen i steg 4,7.
- Analysera 2,0 x 104 färgade celler i en flödescytometer. Grind för enstaka levande celler via FSC-SSC dot Plot och analysera fluorescensen av gated celler på den kanal som lämpar sig för den valda fluorophore.
5. invasions analys med heterospheroids
- Förbered sfäroid formation lösning för heterospheroids, som innehåller de olika celltyper och motsvarande medier, som sammanfattas i tabell 1. Cellerna hade tidigare varit sensorik med lentivirus innehållande vektorer för antingen mcherry eller GFP uttryck.
- Fyll 100 μl av sfäroid formation lösning i varje brunn av plattan och inkubera plattan i cellkulturen inkubator för 24 h att tillåta en sfäroid bildas i varje brunn.
- Förbered 60 μL gelatinös mat ris blandning innehållande 2 mg/mL råtta svans kollagen I, 30% av kommersiell gelifying Matrix och 2,5 μg/mL av laminin-332 i ett 1,5 mL reaktionsrör. Fördela snabbt 15 μL i 3 brunnar i μ-Slide angiogeneshämmaren. Bädda in en sfäroid i varje brunn som redan innehåller gelen.
- Om det behövs, snabbt justera placeringen av sfäroid till mitten av brunnen med en pipett under mikroskopet.
- Upprepa steg 5.2-5.3 för nästa heterospheroids och upprepa igen för homospheroids.
- Inkubera geler i inkubatorn för 1 h för att stelna och, sedan, försiktigt överlagra geler med cellodlingsmedium.
- Avbilda spheroiderna med fluorescensmikroskopi i ett Laser skannings Mikroskop. Ta olika optiska tvärsnitt av sfäroid på olika optiska plan av en z-stack och vid olika tidpunkter av invasion (t. ex., 0 h, 24 h, 48 h och 72 h).
- Analysera bilderna genom att räkna antalet invaderande cancerceller. Invaderande celler är de som har lämnat sfäroid och in i det invasiva området. Det invasiva området definieras som ring området mellan de yttre och inre perimetrar som ges av den mest avlägsna invaderade cellen och genom sfäroid gränsen för sfäroid i början av invasionen experiment, respektive, som beskrivs i kompletterande figur 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten av denna experimentella design publiceras i Martins Cavaco et al.13, som rekommenderas för vidare läsning om de slutsatser som dragits från dessa experiment.
Figur 1, en representativ bild av en immunofluorescenspheroid, visar immunofärgning av integrin α3 subenhet av både förevigade normala fibroblaster och förevigade Cafs (figur 1a), samt immunofluorescens kvantifiering (figur 1b) och transkriptionella nivåer av subenhetgenen integrin α3 genom qPCR (figur 1c). Denna panel av resultat visar att integrin α3 är uppreglerad i iCAFs, jämfört med den normala motsvarigheten. Detta visade att integrin α3β1 kan betraktas som en markör för fibroblaster differentiering av bukspottskörteln. Detta visades också genom flödescytometristudier13.
Figur 1. Uttryck för integrin α3 subenhet av INFS och icafs. Den integrin α3 subenhet är uppreglerad av icafs, återspeglar dess potential som en differentiering markör för bukspottskörteln Cafs. (A) Immunofluorescerande färgning av homospheroider av normal bukspottskörteln fibroblaster (INFS) jämfört med homospheroids av icaf visar en ökad signal av integrin α3 subenhet i de differentierade cellerna. (B) fluorescenssignalen för cellerna i sfäroid kvantifierades med Z-stack-bilder av 3D-sfäroid, med hjälp av imagej-programvaran. : ± SEM av tre oberoende experiment visas och jämförs med t-test (*, p < 0,1). Cde celler som erhållits från de separerade spheroiderna analyserades för deras transkriptionella nivåer av integrin α3 subunit. Medelvärden ± SEM av ΔΔCt-värden som viknings förändringar från två oberoende experiment visas och jämförs med t-test. Även om inte nå signifikansnivå av 0,1, den transkriptionella nivåer av integrin α3-kodning mRNA är högre i iCAFs än i iNFs. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Heterospheroids | ||
| Celltyp (passage upp till 25) | Antal celler | Medium (1 del metylcellulosa +...) |
| mCherry-iCAFs + GFP-AsPC-jag | 400 CAF + 400 cancerceller i bukspottskörteln | 1,5 delar cell MEM med 10% av FBS och 1% penna/STREP + 1,5 delar av RPMI med 10% av FBS och 1% penna/STREP |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I | ||
| mCherry-iCAFs + GFP-PANC-I | 1,5 delar cell MEM med 10% av FBS och 1% penna/STREP + 1,5 delar av DMEM med 10% av FBS och 1% penna/STREP | |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-PANC-I | ||
| Homospheroids | ||
| Cell typ (passage upp till 25) | Antal celler | Medium (1 del metylcellulosa +...) |
| mCherry-iCAFs | 400 celler | 3 delar MEM kompletterat med 10% av FBS och 1% penna/STREP |
| mCherry-α3KO-iCAFs | ||
| GFP-AsPC-I | 3 delar RPMI med 10% av FBS och 1% penna/STREP | |
| GFP-PANC-I | 3 delar DMEM med 10% av FBS och 1% penna/STREP | |
Tabell 1. Cell sammansättningen av hetero-och homospheroids. Antalet celler som behövs för att montera hetero-och homospheroids samt motsvarande medium som bör användas för sfäroid formation lösning sammanfattas i följande tabell.
Kompletterande figur 1. Sekventiella steg för kvantifiering av den Immunofluorescerande färgning av ett protein av intresse för spheroider, med ImageJ. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande figur 2. Sekventiella steg för kvantifiering av antalet invaderande cancerceller i invasions analysen, med ImageJ. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att utveckla en lämplig in vitro-modell för att studera CAF differentiering är en utmanande uppgift. Efter att ha anställts olika metoder, drog vi slutsatsen att en 3D sfäroid modell är den mer praktiska, fysiologiska och kliniskt relevanta modellen, där samspelet mellan pankreascancer celler med förevigade Cafs kan studeras. Denna modell förhindrade spontan differentiering av fibroblaster, på grund av artesakliga stressfaktorer såsom stelhet i cellkulturen plast, åtminstone i kortsiktiga odlingsförhållanden (upp till 48 h). Även om den exakta styvheten av sfäroid som används i dessa studier inte mättes, Ito et al. utvärderade styvheten hos mänskliga navel ven endotelceller och mesenkymala stamceller heterospheroids med hjälp av en robot integrerat mikroflödessystem chip22. Den genomsnittliga styvheten-index för heterospheroids mättes 1 och 3 dagar efter monteringen. Storleken på spheroids var annorlunda, MSC verkade öka sin aggregering kapacitet, vilket resulterade i en minskning i storlek över tiden (från 135,5 μm till 99,8 μm)21,22. Följaktligen ökade styvheten i sfäroid också från 5,0 x 10-3 till 7,5 x 10-3 pa22. Men styvheten i spheroids består av en heterotypic population av CAFs och AsPC-jag kan ha mekaniska egenskaper och styvhet värden skiljer sig från de av homospheroids gjorda av en enda population av fibroblaster/CAFs. Detta är fortfarande okänt och kan skilja från det som beskrevs av Ito et al22. Styvheten beror också på mängden och tvärbindningen av cell-producerade och deponerade ECM, på de olika cell-cell interaktioner inom sfäroid, på antalet celler inom sfäroid eller på varaktigheten av kulturen.
Liksom alla andra modeller, den experimentella utformningen innebär vissa variabler som behöver optimering såsom antalet celler som behövs för att bilda spheroids, tidpunkter för behandling och mikroskopisk avbildning. Den beskrivna experimentella designen optimerades med målet att ha en sfäroid storlek, vilket skulle ha minimal påverkan på spridningen av näringsämnen och syre, eftersom det finns en spridnings gräns på grund av masstransport begränsningar9. Till exempel, transport av syre i spheroids med en storlek större än 150-200 μm påverkas signifikant, liksom spridningen av glukos och laktat, i aggregat större än 300 μm9,18. Sfäoiderna med diametrar större än 400-500 μm uppvisar vanligtvis en koncentriskt skiktad struktur bestående av en nekrotisk kärna omgiven av ett livskraftigt skikt av quiescent celler och en yttre kant av prolifererande celler9,24. För att undvika den begränsade spridningen av föreningar, och för att eliminera problemet med de otillgängliga sfäroid kärna, celler behandlades med TGF-β1, BM2 och lebein-1 före sfäroid bildas, när cellerna är individuellt suspenderade i sfäroid formation lösning. Dessutom, för att möjliggöra tillgången på syre och näringsämnen till de flesta av cellerna i sfäroid och för att förhindra bildandet av en nekrotisk kärna, antalet celler per sfäroid reducerades till 750-1000 celler, som bildar spheroids med en diameter på 140-200 μm.
Det är viktigt att grundligt blanda olika celltyper i sfäroid formation lösning, så spheroids består av ungefär samma antal celler, undvika betydande skillnader i storlek mellan sfäroid. Ändå kan ibland vissa spheroids vara något större än den andra och som kommer att resultera i fler Z-stackar förvärvas i mikroskopet. Vissa spheroids kan också avvika från den perfekt sfäriska formen, men detta tas också i beaktande när avkastningen av sfäroid är avgränsad. Dessa skillnader i storlek och form redovisas i normaliserade kvantifieringsvärden som förklaras i nästa stycke. En annan viktig faktor när det gäller formen på sfäroid är celltypen. Till exempel, fibroblaster och CAFs form spheroids med en nästan sfärisk form, medan AsPC-I och PANC-I celler bildar en mer skingra aggregering av celler.
För avbildning av spheroids, kryosektioner av fasta spheroids kan också användas, men integriteten av sfäroid kan äventyras vid snittning, beroende på celltyp och immunofärgning protokoll. Alternativt, färgning av hela sfäroid i sin 3D-struktur, visade sig vara ett enklare alternativ. Förvärva mikroskopiska Z-staplade bilder av sfäroid som en 3D-struktur tar i genomsnitt 5-15 min per sfäroid.
De Immunofluorescerande signalerna i bilder av spheroids är svåra att kvantifiera eftersom de representerar plan av 3D-strukturer. Den metod som användes baserades på en tidigare beskrivna, där författarna extrapolerade och ansåg att sfäroid var en cell14. På så sätt korrigeras fluorescenssignalen med hjälp av ekvation 1.
Som bakgrund bestämdes den integrerade signal tätheten för en cell fri intresse region (ROI). Den uppmätta integrerade signaldensiteten är summan av intensitetsvärdena för pixlarna inom den valda avkastningen. Eftersom spheroids är 3D-strukturer förvärvas konfokala bilder från olika staplar. För att bearbeta sådana bilder kan man mäta den fluorescerande signalen i varje stapel individuellt eller använda summan av alla staplar i en Z-projektion. Alla kvantifieringar kan utföras med ImageJ. Den totala korrigerade fluorescensen (TCF) av spheroids bestäms som den normaliserade tccf, med tanke på området sfäroid och antalet staplar, med hjälp av ekvation 2. Detta står för de varierande storlekarna av sfäriska och avvikelsen i den runda formen. Analysera den Immunofluorescerande färgning av sfäroid med denna metod kan ta upp till 5 min per spheroid.
Likaså kan invasion av celler från spheroids i den omgivande stromacellmatrisen analyseras med olika algoritmer. En enkel metod beskrevs tidigare av Nowicki et al, där de invasiva cancercellerna räknades som23. För att diskriminera de invasiva cellerna från de som inte invaderar, är det viktigt att fastställa en rumslig gräns bortom vilken cellerna anses ha lämnat sfäroid struktur. Därför är utgångspunkten den gräns som motsvarar den omkrets av sfäroid bilder som förvärvats vid den första tidpunkten (tid 0), när spheroids var inbäddade i gelen. Den cell som invaderar gelen längst anses vara den maximala avståndet en invasiv cell kan nå, och därmed definierar den yttre kanten av invasionen regionen. Denna metod räknar de invasiva cancerceller som finns i det invaderande området, med hjälp av räkningsverktyget från imagej, och avkastningen som motsvarar sfäroid vid tidpunkten 0 h läggs till ROI Manager och sedan transponeras till bilden av samma exakta sfäroid förvärvade 48 h eller 72 h senare. Av denna anledning, det är viktigt att sfäroid förblir så nära mitten av planen som möjligt, under olika tider av förvärvet. Räkna antalet celler kan ta upp till 5 min per sfäroid.
En annan viktig faktor är att skilja de olika celltyperna i heterospheroid. Detta kan utföras med levande celler fluorescerande färgämnen, vilket kan vara problematiskt när Celltypen har en hög cell Division hastighet eller om experimentet ska utföras under lång tid. Det mer robusta och pålitliga sättet att särskilja de två olika populationerna är att utveckla cellinjer som uttrycker fluorescerande proteiner som mCherry och GFP. Leveransen av uttrycket vektorer kan utföras med hjälp av lentivirus, vilket resulterar i stabila uttryck av dessa proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Detta material återspeglar endast författarens åsikter och Europeiska unionen är inte ansvarig för någon användning som kan göras av den information som finns där.
Acknowledgments
Vi erkänner Barbara Schedding hjälp med att förbereda BM2 och lebein-1. Vi erkänner Àgnes Noel för att dela sin expertis i sfäroid analyser. Vi tackar Sonja Schelhaas och Michael Schäfers för deras hjälp med att hantera lentiviral transfektion under S2 villkor. Vi erkänner Sabine von Rüdens assistent i förbereda CAFs från cancer i bukspottskörteln vävnad.
Den forskning som leder till dessa resultat har fått bidrag från People-programmet (Marie Curie Actions) i Europeiska unionens sjunde ramprogram FP7/2007-2013/enligt REA-överenskommelsen n ◦ (316610) till J.A.E. Dessutom stöddes J.A.E. och A.C.M.C. finansiellt av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inom The cells-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003-CiM). Detta projekt stöddes också av Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 till J.A.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
- Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
- Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
- Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
- Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
- Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
- Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
- Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
- Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
- Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
- Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
- Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
- Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
- Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
- Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).
