Summary
Bu protokolün amacı, immünofluorescence, transkripsiyon gibi farklı analiz sistemlerinde ele alınabilir bir tümör toplu benzeri ortamda, kanserle ilişkili fibroblastların (CAFs) farklılaşmasını incelemek için bir 3D in vitro modeli kurmaktır analiz ve yaşam hücresi görüntüleme.
Abstract
Bir in vitro çalışma için ideal modelin tanımlanması, esas olarak hücrelerin farklılaşması gibi fizyolojik süreçler okurken esastır. Tümör stroma, ev sahibi fibroblastlar ayırt etmek için kanser hücreleri tarafından uyarılır. Böylece, tümör mikroortamına katkıda bulunan ve tümör ilerlemesini destekleyen bir fenotip elde ederler. Küroid modelini kullanarak, biz laminin-332 ve bu farklılaşma sürecinde α3β1 onun reseptör integral rolünü analiz hangi bir 3D in vitro model sistemi, kurdık. Bu küroid model sistemi sadece tümör mikroçevre koşullarını daha doğru bir şekilde üretmez, aynı zamanda çok yönlü bir modeldir, çünkü hem intra hem de ekstrüler olarak immünofluorescent boyama gibi farklı akış çalışmaları sağlar işaretleri, hem de yatırılmış ekstrellüler matris proteinleri. Dahası, qPCR tarafından transkripsiyonel analizler, akış sitometri ve hücresel invazyonu bu modelde incelenebilir. Burada, biz cafs ' ıntegrin α3β1 ve onun ektopik yatırılmış ligand, laminin-332, farklılaşma ve pankreas kanseri hücrelerinin istilasını destekleyen rolünü değerlendirmek için bir küroid model bir protokol açıklanmaktadır.
Introduction
Tümör mikroortamı çok karmaşık bir niş ve tümör hücrelerinin bakım ve ilerlemesi için son derece önemlidir1. Sadece kanser hücreleri tarafından değil, aynı zamanda stromal fibroblastlar tarafından da oluşur. Tümör hücreleri, normal dokuların stroma2özel ve farklı bir stroma ile çevrilidir. Laminin-332, pankreas adenokarsinoma3gibi farklı tümörlerin stroma içinde ekstrasellüler matris proteini ektopically ifade edilir. Dahası, ECM 'nin biyokimyasal bileşimi ve aynı zamanda rijitlik ve gerginlik gibi Biyofizik özellikleri, tümör dökme4içinde değişir. Bu tümör stroma veya "reaktif stroma", fibroblastların komşu kanser hücrelerine adaptasyon ve tümör ilerlemesi için olumlu ve destekleyici bir ortam geliştiren diğer çok önemli oyuncuların işe alınması ile kaynaklanır. Stromal fibroblastların farklılaşması kansere ilişkili fibroblastlar (CAF) ile sonuçlanır. Bu hücreler α-pürüzsüz Kas aksini (αSMA)5 veya neural/glial antijen 2 (NG2)6gibi farklı işaretçiler kullanılarak tanımlanabilir.
En uygun in vitro modeli ile tümörün MIKROORTAMıNı (TME) cafs ile reapitlemek için seçmek zordur. TME 'nin fizyolojik parametrelerini uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir şekilde taklit etme yöntemi, böyle bir model sistemi için dikkate alınmalıdır. TME içinde proliferasyon, farklılaşma, göç ve farklı hücre türlerinin istilası gibi farklı süreçler ortaya çıkar. Bu hücresel süreçler farklı yöntemlerle bireysel olarak gerçekleştirilebilir. Ancak, deneysel koşulların tümör stroma ECM ile hücresel etkileşimleri dikkate almanız gerekir, çünkü substratum sertlik CAF farklılaşma sürecini etkiler. RG Wells matris sertlik hücre davranışına etkisi üzerine yorumladı ve siterografi organizasyonu ve in vitro kültürlü hücrelerde gözlenen farklılaşma durumunun artifaktüel olabilir vurgulanır7. Farklı uyaranlara, mekanik gerginlik5,7dahil CAF farklılaşma dahil gibi görünüyor. Bu önlemek için, 2D yumuşak substratlar farklılaşma çalışmaları için olası yaklaşımlar olabilir, onlar sert kültür çanak plastik sorununu atlatmak gibi. Yumuşak bir 2B yüzey, hangi fibroblastlar yetiştirilen olabilir, olabilir kollajen-I kaplamalı Poliakrilamid jelleri, böylece jel sertliği polimakrilid konsantrasyonu ve jel çapraz bağlayıcı tarafından manipüle edilebilir. ΑSMA zengin stres liflerinin yapışma ve oluşumu, jel sertliği8ile birlikte fibroblastlar içinde geliştirilmiştir. Bu sonuçlar, daha fazla fizyolojik in vitro farklılaşma modelleri için yumuşak substrat iskeleleri önemini vurgulmaktadır. Ancak, bizim elimizde bu jellerin deneysel yeniden üretilebilirliği ve görüntülenmesi zordur. Bu eksikliklerin üstesinden gelmek için, ayrım ve invazyon çalışmaları için 2B yumuşak substrat sistemini bir 3D küre modeli olarak değiştirdik. Bu model daha klinik olarak ilgilidir ve bir in vitro organoid benzer, in vivo hücre-hücre etkileşimleri, ECM üretim ve biriktirme, yanı sıra hücre davranışı9reapitler.
Hücreleri uygun bir substrat eksikliği olduğunda kürler oluşur. Hücreler yapışkan bir yüzey olmadan bırakılırken, daha fazla veya daha az küresel bir yapı oluşturacak şekilde toplar. Eğer kürler bir hücre türünden oluşuyorsa, bunlar homospheroidler olarak adlandırılır; iki veya daha fazla farklı hücre türlerinden oluşan, heterospheroids oluşturur.
Küroid hazırlama için farklı yöntemler arasında, biz olmayan-yapışlı yuvarlak alt 96-kuyu plakaları kullanarak protokol gerçekleştirin. Maliyetlere göre çok etkilidir. Burada, biz fibroblastlar hem homospheroids üretmek, CAF veya cafs ıntegrin α3 altbirim farklılaşma sürecini incelemek için ve cafs veya ıntegrin α3 Ko cafs ve pankreatik kanal Karsinomu hücreler (ASPC-ı ve panc-ı) işgali çalışma çevreleyen matrisin içine.
Bu çalışmaların amacı, insan pankreas Karsinomu biyopsilerinde izole edilen birincil cafeleri kullanıyordu. Ancak, biyopsiler hücreleri elde etmek için az ve bu nedenle, bu çalışmalar kullanılan CAFs Lentivirus HTERT içeren kullanarak ölümsüzleşmiş olmuştur. Onlar ıcafs denir, ve onların normal meslektaşları, primer insan pankreas fibroblastlar, INFs olarak adlandırılır. İnsan pankreatik fibroblastlar ve pankreatik kanal Karsinomu hücreleri, AsPC-ı ve PANC-ı, ticari olarak mevcuttur.
Bu protokol, laminin-332-ıntegrin etkileşiminin CAF farklılaşma sürecinde etkisini incelemek için kullanılmıştır. Bu etkileşimin ve fonksiyonunun özgüllüğünü kanıtlamak için, inhibitör bileşikleri kullanıldı: km2, ıntegrin bağlayıcı sitesini engelleyen bir monoklonal antikor laminin-332 α3 Chain10, veya lebein 1, bir yılan zehiri türeyen bileşik laminin-bağlayıcı integrinler α3β1, α6β1 ve α7β111,12.
İnvazif tahlil için hücreler, heterokürlerde farklı hücre tiplerini ayırt etmek için mCherry (ıcafs ve ıntegrin α3 KO ıcafs) veya GFP (AsPC-I ve PANC-I) kodlaması içeren Lentivirus ile transpenoed edilmiştir. Hücrelerin dönüştürücü onları ölümsüzleştirmek ve/veya floresan protein (mCherry ve GFP) ifade onları etiketlemek için bir önceki çalışmada açıklanan13, daha fazla bilgi için danışılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre matris etkileşimi farklı TGF-β1 inhibe bileşikleri kullanarak fibroblast/CAF farklılaşma için bir in vitro model olarak 3D kürler
- Mix 1 Bölüm 6 mg/mL metilselüloz çözeltisi ve 3 parça hücre kültürü medya, MEM ile tamamlayıcı 1% ısı-inaktive fetal Sığır serum (FBS) ve 1% penisilin/streptomisin küroid oluşumu çözeltisi elde etmek için.
- Resuspend yeni çözülür ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastlar (INFs), ölümsüzleştirilmiş CAF (ıcafs) veya ıntegrin α3β1 KO ICAF (25 ' e kadar geçiş) küroid oluşumu çözeltisi. 1 96 iyi plaka hazırlanırsa, bir aşırı küroid oluşumu çözeltisi hazırlamak, 10 mL ve 75.000 hücre eklemek, her küroid 750 hücreler tarafından oluşan aklınızda tutarak, ve bu 100 μL her iyi plaka başına dağıtılır.
- Eğer sitokinler veya ıntegrin inhibitörleri çalışmaya dahil edilir, bu bileşikleri hücre süspansiyona ekleyin, onların oluşumu sırasında küreler içine gömmek için. INFs 'in, farklılaşma tetiklemesi için 10 ng/mL TGF-β1 ile uyarılabilmesi gerektiğini unutmayın. Uygun olduğu durumlarda, 20 μg/mL BM2 veya 10 μg/mL lebein 1 gibi TGF-β1 ile birlikte inhibitör bileşikleri ekleyin.
- CAF homospheroidleri aynı şekilde hazırlayın ama TGF-β1 Stimulus olmadan, zaten farklılaşmış olduğundan. Entegre α3 KO CAF homospheroidleri herhangi bir bileşiğin eklenmesi olmadan hazırlayın.
- Her bir kuyu için 100 μL çözeltisi ekleyerek küroid oluşumu çözümünü yuvarlak alt 96 çok kuyu plakasına dağıtın. Her zaman küroid çözüm kuyularda dağıtılır, yukarı ve aşağı pipetleme ile iyi karıştırın, birkaç kez.
- Her kuyunda bir küre oluşturulmasına izin vermek için 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçoradaki plakayı yerleştirin.
- Yaklaşık 24 saat sonra kürleri toplayın ve farklı akış amaçları için bunları kullanın: immünofluorescent boyama, gerçek zamanlı (RT) q-PCR ve akış sitometri. İç ve iç-hücre dışı antijenlerin ifadesinin algılanması için, dil içinde ECM proteinlerinin birikmesi de dahil olmak üzere, immünofluorescent boyama kullanın. Kürlerin tek hücrelere dağıldıktan sonra, Akış sitometrisi ile membran bağlantılı reseptör ölçmek. Gen aktivasyonu ve transkripsiyonel değişiklikleri tespit etmek için, küre hücrelerinden yalıtılmış mRNA RT q-PCR kullanın.
2. kürlerin immünofluorescent boyama
- Yaklaşık 24 saat sonra bir 1,5 mL reaksiyon tüpü deneysel durum başına veya protein başına analiz edilecek sonra kürler toplayın. Örneğin, TGF-β1 ile uyarılan INFs 'in kürleri, tedavi edilmemiş kontrol Infsinden farklı bir tüpte yerleştirin. Çok güçlü kesme kuvvetleri nedeniyle kürlerin rüptürü önlemek için, Orifice büyütmek için pipet ucunun sonunu kesti. Tek bir reaksiyon tüpünde en az 5-10 küreler ekleyin, çoğaltır ve yıkama adımları sırasında olası kayıpları dikkate almak için.
- 1.000 x g'de yaklaşık 30-60 s için bir tezgah üst Santrifüjü ile kürleri santrifüjler. Metilselüloz içeren süpernatant 'ı pipetleme ile dikkatlice çıkarın, pelletli küreler rahatsız etmeden.
- 50 μL 1x PBS ile yıkayın. Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve 2,2 'de açıklandığı gibi PBS 'i pipetleme ile dikkatle kaldırın.
- Lekelenecek proteine bağlı olarak, PBS 'de 50 μL% 4 civarında formaldehite ile Oda sıcaklığında 20 dakika (αsma, NG2 ve ıntegrin α3β1 için) veya 10 dk-20 °c ' de 50 μL metanol ile (laminin-332 alt tesisleri için) düzeltin.
- 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca PBS 'de% 0,1 Triton-X ile hücreleri geçirgen.
- Üç kez 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
- 5% FBS ve% 2 BSA içeren PBS 'deki küreler, özel olmayan protein etkileşimi sitelerini engellemek için RT 'de 1 saat boyunca inküsler.
- PBS 'de 30 μL primer antikorlar,% 2,5 FBS ve 4 °C ' de% 1 BSA ile küreler bir gecede. Aşağıdaki primer antikorlar kullanıldı: Anti-αSMA Cy-3 konjuated ve anti-NG2 5 μg/mL 'de; BM2 Anti-laminin α3, 6F12 Anti-laminin β3 ve anti-laminin γ 2 20 μg/mL.
- Üç kez 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
- PBS 'de 30 μL ikincil antikorlar, 2,5% FBS ve 90 dk için RT 'de% 1 BSA ile küreler inküsler. Kullanılan aşağıdaki ikincil antikorlar: Alexa 488 Anti-tavşan ve anti-Mouse (5 μg/mL).
- Üç kez 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 30 μL DAPı boyama çözeltisi ile hücreleri inküser.
- 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
- Bir cam Pasteur pipet kullanarak, bir damla PBS içinde, bir cam slayt üzerinde küreler yerleştirin.
- Bir lazer tarama mikroskobu 10X büyütme kullanarak floresan mikroskopisi ile kürler görüntü. Bir z-yığınının farklı optik düzlemlerinde (15-20 yığın düzlemleri) farklı optik çapraz kesit alın. Mikroskopla lazer ayarlarını kurmak için, faiz antijen veya ikincil antikor ile lekelenmiş bir küroid için negatif hücrelerden oluşan bir küroid kullanın. Karşılaştırılacak tüm örnekleri için aynı ayarları yeniden kullanın.
- Daha önce14yayımlanan olarak ımagej yazılımı ile mikroskobik görüntüleri analiz edin. Adımlar ek Şekil 1' de özetlenmiştir. Arka plan olarak, hücre içermeyen bir ilgi alanı (YG) entegre sinyal yoğunluğunu belirleyin. Toplam düzeltilmiş hücre floresans (TCCF) olarak hesaplayın:
- Genel olarak düzeltilmiş Floresan (TCF) ' i, TCCF 'nin bölge ve yığın sayısının normale döneceği şekilde belirleyin.
3. RT q-PCR homospheroids
- RT-qPCR gerçekleştirmek için, en az 288 küre (3 96-kuyu plakalarına karşılık gelen) bir 50 mL reaksiyon tüpüne toplayın. 1.000 x g 'de 5 dakika Santrifüjlü ve pelleted küreler rahatsız etmeden pipetleme ile metilselüloz içeren süpernatant dikkatle çıkarın.
- 1 mL 1x PBS ile yıkayın ve küreler 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın. 1.000 x g'de yaklaşık 30-60 s için bir tezgah üst Santrifüjü ile kürleri santrifüjler. PBS 'i pipetleme ile dikkatlice çıkarıp pelletli küreler rahatsız etmeden çıkarın.
- 250 μL, 4 mg/ml kolagenaz B, 50 μg/ml DNase ı,% 2 BSA, 1 mm CAcl2 ' de PBS 'de 37 °c ' de, yaklaşık 30-45 dakika boyunca, her 5 dakikada bir birkaç saniye boyunca zaman zaman yavaş bir şekilde vorherfer ve darbeli ile birlikte yer ayırın.
- 3,2 adımda açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
- Üreticilerin talimatlarına göre, toplam RNA 'ya, ticari RNA yalıtım kiti kullanarak, söküsel kürlerin hücrelerinden yalıtın.
- Üreticinin talimatlarına göre, yalıtılmış mRNA 'yı ticari bir kit ile cDNA 'ya geri çevirir.
- Gerçek zamanlı PCR tarafından çoğaltır transkripsiyon seviyeleri ölçmek. Kullanılan astarlar: α-SMA: FW 5 ′-ccgaccgaatgcagaag GA-3 ′, Rev 5 ′ acagagtatttgcgctccgaa-3 ′15; Laminin α3 zincir: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, Rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′16; Laminin β3 zincir: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ Rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; Laminin γ2 zincir: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ Rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ Rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′18; ıntegrin α3 subunit: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' Rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '19; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ Rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.
- ÜST-1 denklemi kullanarak: 2-δδctgibi bir endojen referans geni CT değeri için CT değerlerini düzeltin. ΔΔCt = ΔCt (hedef örnek) – ΔCt (referans numune) ve ΔCt = hedef geni veya referans geni BT – TOP-ı.
4. ıntegrin ifadesinin akış sitometri Analizi
- Akış cytometrik analiz için, en az 288 küre (3 96-kuyu plakalarına karşılık gelen) bir 50 mL reaksiyon tüpüne toplayın. 1.000 x g 'de 5 dakika santrifüj yapın ve metilselüloz içeren süpernatant 'i pipetleme ile dikkatlice çıkarın.
- 1 mL 1x PBS ile yıkayın ve küreler 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın. Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve PBS 'i pipetleme ile dikkatle kaldırın.
- 3,3 adımda açıklandığı gibi kürler ayırmak.
- 4,2 adımda açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
- Özel olmayan bağlama sitelerini engellemek ve Fcγ-reseptörlerine (CD16, CD32 ve CD64) algılama ile ilgili antikorların bağlanması önlemek için, 100 μL PBS% 2 at serumu (veya başka bir hayvan türünün serum içeren hücreleri inküye, antikorlar hangi olmayacaktır ) ve 0,1% BSA% 20 dk, 4 °C ' de dönme ile kullanılır.
- Hücre içi işaretleri boyama durumunda, 2.2-2.5 adım altında açıklandığı gibi hücreleri düzeltin/geçirgen.
- Hücreleri% 2 at serum içeren PBS 100 μL 'de ve döndürme ile 4 °C ' de 30 dakika boyunca% 0,1 BSA cinsinden primer antikorlar ile kulbinın. Primer antikor 10 μg/mL 'ye seyreltilmeli.
- 100 μL PBS + 0,1% BSA ile yıkayın üç kez, en üst tezgah santrifüjte santrifüj adımları ile 1.000 x g arasında.
- Hücreleri% 2 at serum içeren PBS 100 μL ve döndürme ile 4 °C ' de 30 dakika boyunca% 0,1 BSA cinsinden ikincil antikorlar ile Inkük. Sekonder antikor 10 μg/mL 'ye seyreltir.
- 4,7 adımda açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
- Bir akış cytometer 2,0 x 104 lekelenmiş hücreleri analiz edin. FSC-SSC nokta Arsa üzerinden tek canlı hücreler için kapı ve seçilen fluorophore için uygun kanalda Gated hücrelerin floresan analiz.
5. heterospheroids kullanarak istila tahlil
- Tablo 1' de özetlenen farklı hücre türlerini ve ilgili ortamları içeren heteroküroidler için küroid oluşumu çözümünü hazırlayın. Hücreler daha önce mCherry veya GFP ifadesi için vektörler içeren Lentivirus ile dönüştürücülü oldu.
- Tabakanın her bir kuyusu içinde küroid oluşumu çözeltisi 100 μL doldurun ve her iyi bir küre oluşturulmasına izin vermek için 24 saat hücre kültürü kuluçk plaka Inkük.
- 60 mg/mL sıçan kuyruk kollajen ı,% 30 ticari gelifying matris ve 2,5 μg/mL laminin-332 içeren, 1,5 mL 'lik reaksiyon tüpünde jelatinli matriks karışımının% 30unu hazırlayın. Μ-slayt anjiyogenez odasının 3 kuyularında 15 μL hızla dağıtın. Her iyi zaten jel içeren bir küroid embed.
- Gerekirse, mikroskopın altındaki pipet ile kürlerin yerini hızla kuyu merkezine ayarlayın.
- Sonraki heterospheroids için 5.2-5.3 adımlarını yineleyin ve homospheroidler için tekrar tekrarlayın.
- İnküyörün içindeki jelleri 1 saat boyunca katalatın ve daha sonra hücre kültürü ortamı ile jelleri nazikçe bindirin.
- Lazer tarama mikroskobu floresan mikroskopisi ile kürler görüntü. Bir z-yığınının farklı optik düzlemlerinde ve istilanın farklı zaman noktalarında (örn. 0 saat, 24 saat, 48 h ve 72 h) farklı optik çapraz kesit alın.
- İşgalci kanser hücrelerinin sayısını sayarak görüntüleri analiz edin. İşgalci hücreler, kürü terk eden ve invazif bölgeye giren olanlar. İnvazif alan, en uzağa işgal edilen hücre tarafından verilen dış ve iç Perimetreleri ile işgal deneylerinin başlangıcında, sırasıyla, ek Şekil 2 ' de özetlenen olarak küroların küre sınırına göre halka alanı olarak tanımlanır. .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneysel tasarımın sonuçları, Bu deneylerden çekilen sonuçlara ilişkin daha fazla okuma için tavsiye edilen Martins Cavaco ve al.13' te yayınlanmaktadır.
Şekil 1, immünofluorescent küroların temsili bir görüntüsü, hem ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastlar ve ölümsüzleştirilmiş cafs (Şekil 1a), hem de immünofluorescence ıntegrin α3 altbirim immünostalize gösterir (Şekil 1B) ve qPCR tarafından ıntegrin α3 altbirim geni transkripsiyonel seviyeleri (Şekil 1C). Bu sonuçlar panel, α3 ' ün ıcafs 'de normal meslektaşı ile karşılaştırıldığında yukarı düzenlenmiş olduğunu göstermektedir. Bu, α3β1 integrinin pankreatik fibroblastların farklılaşması için bir marker olarak düşünülebilir olduğunu kanıtladı. Bu da akış sitometri çalışmaları13tarafından gösterilmiştir.
Şekil 1. INFs ve ıcafs ile ıntegrin α3 alt birim ifadesi. Integrin α3 altbirim, pankreatik cafler için farklılaşma işaretçisi olarak potansiyelini yansıtan ıcafs tarafından yükselmektedir. (A) ICAF 'ın homoküratörlerine kıyasla normal pankreas fibroblastları (INFs) homospheroidlerin immünofluorescent boyama diferenli hücrelerde ıntegrin α3 altbirim daha yüksek bir sinyal gösterir. (B) sahteki hücrelerin floresan sinyali, ımagej yazılımını kullanarak 3B kürlerin Z yığını görüntülerine göre ölçülebilir. Üç bağımsız deneyden ± SEM gösterilir ve t-testi (*, p < 0,1) ile karşılaştırılır. (C) ayrılmış küratörlerden elde edilen hücreler, ıntegrin α3 subunit transkripsiyon seviyeleri için analiz edildi. İki bağımsız deneyden kat değişiklikleri olarak ΔΔCt-değerleri ± SEM gösterir ve t-testi ile karşılaştırıldığında. 0,1 önem düzeyine ulaşmasına karşın, ıntegrin α3-Encoding mRNA 'nın transkripsiyonel seviyeleri INFs 'den daha ıcafs 'de daha yüksektir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Heterokürler | ||
| Hücreler tipi (25 ' e kadar geçiş) | Hücre sayısı | Orta (1 parça metilselüloz +...) |
| mCherry-ıcafs + GFP-AsPC-ı | 400 CAF + 400 pankreas kanseri hücreleri | 1,5 parça Cell MEM ile% 10 FBS ve 1% kalem/strep + 1, 5 RPMı parçaları% 10 FBS ve% 1 kalem/strep |
| mCherry-α3KO-ıcafs + GFP-AsPC-ı | ||
| mCherry-ıcafs + GFP-PANC-ı | 1,5 parça Cell MEM ile% 10 FBS ve 1% kalem/strep + 1,5 parça DMEM ile% 10 FBS ve% 1 kalem/strep | |
| mCherry-α3KO-ıcafs + GFP-PANC-ı | ||
| Homokürler | ||
| Hücre tipi (25 ' e kadar geçiş) | Hücre sayısı | Orta (1 parça metilselüloz +...) |
| mCherry-ıcafs | 400 hücreleri | 3 parça MEM FBS% 10 ve% 1 kalem/strep ile tamamlayıcı |
| mCherry-α3KO-ıcafs | ||
| GFP-AsPC-ı | FBS% 10 ve% 1 kalem/strep ile 3 parça RPMı | |
| GFP-PANC-ı | FBS% 10 ve% 1 kalem/strep ile 3 parça DMEM | |
Tablo 1. Hetero-ve homospheroidlerin hücre bileşimi. Hetero-ve homospheroidlerin montajı için gerekli hücrelerin sayısı ve aynı zamanda küroid oluşumu çözeltisi için kullanılması gereken ilgili orta aşağıdaki tabloda özetlenmiştir.
Ek Şekil 1. Imagej kullanarak, kürlerde ilgi bir proteinin immünofluorescent boyama ölçümü için sıralı adımlar. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2. Imalat testinde istila kanser hücrelerinin sayısının ölçülmesini için sıralı adımlar, ımagej kullanarak. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAF farklılaşma çalışması için uygun bir in vitro model geliştirmek için zorlu bir iştir. Farklı yaklaşımlar istihdam ettikten sonra, biz bir 3D küroid modeli daha pratik olduğunu sonucuna, fizyolojik ve klinik olarak ilgili model, hangi ölümsüzleştirilmiş CAFs ile pankreas Karsinomu hücreleri arasında etkileşim incelenebilir. Bu model, hücre kültürü plastiğin sertliği, en azından kısa vadeli kültür koşullarında (48 h 'ye kadar) gibi artifaktüel stres nedeniyle fibroblastların spontan farklılaşmasını engelledi. Bu çalışmalarda kullanılan kürenin tam sertliği ölçülmese de, Ito ve al. insan göbek ven endotel hücrelerinin sertlik ve mezenkimal kök hücre heteroküroidlerin bir robot entegre mikrofluidik çip kullanarak değerlendirildi22. Heterokürlerin ortalama sertliği-endeksi montajdan 1 ve 3 gün sonra ölçülmüştür. Kürlerin büyüklüğü farklıydı, msc onların toplama kapasitesini artırmak gibi görünüyordu, hangi zaman içinde büyüklüğü bir azalma sonuçlandı (dan 135,5 μm için 99,8 μm)21,22. Sonuç olarak, kürlerin sertliği de 5,0 x 10-3 ila 7,5 x 10-3 PA22arasında arttı. Ancak, CAFs ve AsPC bir heterotypic nüfusu oluşan kürlerin sertliği-I mekanik özellikleri ve sertlik değerleri fibroblastlar/CAFs tek bir nüfusun yapılmış homospheroids olanlardan farklı sahip olabilir. Bu hala bilinmiyor ve Ito ve Al22tarafından açıklanan olandan farklı olabilir. Sertlik aynı zamanda hücre üretimi ve yatırılan ECM 'nin miktarı ve çapraz bağlantısıyla, kürlük içindeki farklı hücre hücresi etkileşimlerine, bölge içindeki hücrelerin sayısına veya kültür süresince bağlıdır.
Diğer herhangi bir model gibi, deneysel tasarım, küre, tedavi ve mikroskobik görüntüleme zaman noktaları oluşturmak için gerekli hücre sayısı gibi optimizasyon gereken bazı değişkenler içerir. Açıklanan deneysel tasarım, kütle taşıma sınırlamaları9nedeniyle bir difüzyon limiti olduğu için, besinlerin ve oksijenin difüzyonunda minimal etkiye sahip olan bir küroid boyutuna sahip olma amacı ile optimize edilmiştir. Örneğin, 150-200 μm ' den büyük bir boyuta sahip olan küroidlerde oksijen taşınması, 300 μm9,18' den büyük olan arterlerde glikoz ve lakdamak difüzyon yanı sıra önemli ölçüde etkilenir. 400-500 μm ' den büyük çapları olan küreler genellikle bir nekrotik çekirdeğe sahip, uygun bir şekilde sessiz hücrelerle çevrili ve proliferasyon hücrelerinin bir dış kenarından oluşan bir katik katmanlı yapı sunar9,24. Bileşiklerin sınırlı difüzyon önlemek için, ve erişilemeyen küroid çekirdeğin sorunu ortadan kaldırmak için, hücreler bağımsız olarak küroid oluşumu çözeltisi içinde askıya alındığında, küroid oluşumundan önce TGF-β1, BM2 ve lebein-1 ile hücreleri tedavi edildi. Dahası, oksijen ve besinlerin çoğu, kürodeki hücrelerin çoğunu ve nekrotik çekirdeğin oluşumunu önlemek için, küroid başına hücre sayısı 750-1000 hücrelere düşürüldü ve bu da 140-200 μm çapı olan küroidleri oluşturur.
Farklı hücre tiplerini küroid oluşumu çözümünde iyice karıştırmak önemlidir, bu nedenle kürlerin yaklaşık olarak aynı sayıda hücre tarafından oluşturduğu, bu nedenle kürler arasındaki önemli boyutta farklar kaçınılır. Yine de bazen bazı kürler diğerinden biraz daha büyük olabilir ve bu da mikroskop içinde elde edilen daha fazla Z-yığınlara neden olur. Bazı kürler de mükemmel küresel formdan sapma olabilir, ancak bu da dikkate alınır zaman küratörün YG belirlendi. Bu boyut ve şekil farklılıkları, bir sonraki paragrafta açıklandığı gibi normalleştirilmiş ölçüme değerlerinde muhasebeleştirilir. Diğer önemli faktör küroid şekli ile ilgili hücre türüdür. Örneğin, fibroblastlar ve CAFs neredeyse küresel bir form ile kürler formu, AsPC-ı ve PANC-ı hücreler hücrelerin daha dağıtır toplama oluşturur.
Görüntüleme için kürler, sabit kürlerin kriyobölümler de kullanılabilir, ancak kürünün bütünlüğü, hücre tipine ve immünosteme protokolüne bağlı olarak, kesişim üzerine tehlikeye olabilir. Alternatif olarak, 3D yapısında tüm kürünün boyama, daha basit bir seçenek olduğunu kanıtladı. 3D yapı olarak kürlerin mikroskobik Z-yığılmış resimleri elde etmek ortalama 5-15 dk her küroid alır.
3D yapıların uçaklarını temsil ettikleri için, kürlerin görüntülerinde immünofluorescent sinyalleri ölçmek zordur. Kullanılan yöntem önceden açıklanan bir, burada yazarlar ekstrapole ve bir hücre14olarak küroid kabul dayanmaktadır. Bu şekilde, floresans sinyali denklem 1kullanılarak düzeltilmiştir.
Arka plan olarak, hücre içermeyen bir ilgi alanı (YG) entegre sinyal yoğunluğu belirlendi. Ölçülen entegre sinyal yoğunluğu, seçilen YG içerisindeki piksellerin yoğunluk değerlerinin toplamıdır. Küroidlerin 3D yapıları olduğundan, farklı yığınlardan gelen Konfokal görüntüler elde edilir. Bu tür görüntüleri işlemek için tek tek her yığınında floresan sinyali ölçmek veya bir Z-projeksiyon içine tüm yığınları toplamını kullanabilirsiniz. Tüm miktarları ımagej kullanılarak yapılabilir. Genel olarak düzeltilmiş floresans (TCF), eşitlik 2' nin kullanıldığı, küre alanı ve yığın sayısı göz önüne alındığında, NORMALLEŞTIRILMIŞ tccf olarak belirlenir. Bu, farklı boyutlarda kürlerin ve küresel şekildeki tutarsızlık için hesaplar. Bu yöntemi kullanarak kürlerin immünofluorescent lekeleme analizi, küroid başına 5 dakikaya kadar sürebilir.
Benzer şekilde, çevreleyen stromal matrisin içine kürodan hücrelerin istilası farklı algoritmalar tarafından analiz edilebilir. Basit bir yöntem daha önce invaziv kanser hücrelerinin23sayıldığı Nowicki ve Al tarafından tanımlanmıştır. İnvazif hücreleri istila etmeyen olanlardan ayrımcılık yapmak için, hücrelerin küroid yapısını terk ettiği düşünülür ötesinde bir uzamsal limit kurmak önemlidir. Bu nedenle, başlangıç noktası, kürlerin jel içine gömülür ilk zaman noktasında (saat 0) elde edilen küroid görüntülerin çevreye karşılık gelen sınırdır. Jeli en uzağa istila eden hücre, invazif bir hücrenin ulaşabileceği en yüksek mesafe olarak kabul edilir ve böylece istila bölgesinin dış kenarını tanımlar. Bu yöntem, işgal alanında mevcut olan invazif kanser hücrelerini sayar, ımagej 'den sayım aracını kullanarak, ve zaman içinde kürelite karşılık gelen YG 0 h YG yöneticisine eklenir ve daha sonra elde edilen aynı tam küre görüntü aktarılmış 48 h veya 72 h daha sonra. Bu nedenle, küre, elde edilen farklı zamanlarda, mümkün olduğunca uçakların merkezine yakın kalması önemlidir. Hücrelerin sayısını saymak, küroid başına 5 dakikaya kadar sürebilir.
Başka bir önemli göz heterospheroid farklı hücre türlerini ayırt etmektir. Bu hücre tipi yüksek hücre bölünmesi oranı veya deneme uzun süre gerçekleştirilecektir varsa sorunlu olabilir canlı hücre floresan boyalar, kullanılarak gerçekleştirilebilir. İki farklı nüfusu ayırt etmenin daha sağlam ve güvenilir bir yolu, mCherry ve GFP gibi floresan proteinleri ifade eden hücre hatları geliştirmektir. İfade vektörler teslim Lentivirus kullanılarak yapılabilir, bu proteinlerin istikrarlı ifade sonuçlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor. Bu malzeme sadece yazarın görüşlerini yansıtır ve Avrupa Birliği, burada yer alan bilgilerden yapılmış olabilecek herhangi bir kullanımından sorumlu değildir.
Acknowledgments
Barbara Schedding 'in BM2 ve lebein-1 ' i hazırlamak için yaptığı yardımı kabul ediyoruz. Àgnes Noel 'i, uzmanlık alanındaki uzmanlığına göre paylaştığı için kabul ediyoruz. Biz S2 koşullarında lentiviral transfeksiyon ele yardım için Sonja Schelhaas ve Michael Schäfers teşekkür ederiz. Biz Pankreatik kanser dokusundan CAFs hazırlanması Sabine von Rüdenin yardımcı kabul.
Bu sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Birliği 'nin yedinci çerçeve programı olan FP7/2007-2013/REA hibe anlaşması uyarınca n ◦ (316610) kişi programı (Marie Curie Actions) J.A.E. için fon aldı Dahası, J.A.E. ve A.C.M.C., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından, hücre içinde hareket kümesi mükemmellik (EXC 1003-CIM) içinde mali olarak destekleniyordu. Bu proje Ayrıca Wilhelm Sander Stiftung tarafından destekleniyordu (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
- Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
- Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
- Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
- Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
- Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
- Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
- Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
- Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
- Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
- Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
- Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
- Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
- Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
- Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).
