Summary
L'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d'analyse, tels que l'immunofluorescence, la transcription l'analyse et l'imagerie des cellules de vie.
Abstract
Définir le modèle idéal pour une étude in vitro est essentiel, principalement si l'étude des processus physiologiques tels que la différenciation des cellules. Dans le stroma tumoral, les fibroblastes hôtes sont stimulés par les cellules cancéreuses pour se différencier. Ainsi, ils acquièrent un phénotype qui contribue au microenvironnement tumoral et soutient la progression tumorale. En utilisant le modèle sphéroïde, nous avons mis en place un tel système de modèle in vitro 3D, dans lequel nous avons analysé le rôle de la laminin-332 et son récepteur integrin 3-1 dans ce processus de différenciation. Ce système de modèle sphéroïde reproduit non seulement les conditions de microenvironnement de tumeur d'une manière plus précise, mais est également un modèle très polyvalent puisqu'il permet différentes études en aval, telles que la coloration immunofluorescente de l'intra- et de l'extracellulaire marqueurs, ainsi que les protéines de matrice extracellulaire déposées. En outre, les analyses transcriptionnelles par qPCR, la cytométrie de flux et l'invasion cellulaire peuvent être étudiées avec ce modèle. Ici, nous décrivons un protocole d'un modèle sphéroïde pour évaluer le rôle de l'integrin de CAFs '3'1 et son ligand ectopique déposé, laminin-332, dans la différenciation et en soutenant l'invasion des cellules cancéreuses pancréatiques.
Introduction
Le microenvironnement tumoral est une niche très complexe et extrêmement importante pour le maintien et la progression des cellules tumorales1. Il est formé non seulement par les cellules cancéreuses, mais aussi par les fibroblastes stromaux. Les cellules tumorales sont entourées d'un stroma qui est spécifique et différent du stroma des tissus normaux2. Lalaminin-332 est une protéine de matrice extracellulaire ectopiquement exprimée dans le stroma de différentes tumeurs, telles que de l'adénocarcinome pancréatique3. En outre, la composition biochimique de l'ECM et aussi ses propriétés biophysiques, telles que la rigidité et la tension, changent dans le volume de tumeur4. Ce stroma tumoral, ou « stroma réactif », est causé par une adaptation des fibroblastes aux cellules cancéreuses voisines et par le recrutement d'autres acteurs très importants qui développent un environnement favorable et favorable à la progression tumorale. La différenciation des fibroblastes stromaux entraîne des fibroblastes associés au cancer (CAF). Ces cellules peuvent être identifiées à l'aide de différents marqueurs tels que l'actine musculaire lisse (SMA)5 ou l'antigène neural/glial 2 (NG2)6.
Le modèle in vitro le plus approprié pour récapituler le microenvironnement tumoral (TME) avec les CAT est difficile à sélectionner. La méthode pour imiter les paramètres physiologiques du TME d'une manière rentable et reproductible doit être considérée pour un tel système modèle. Dans le TME, différents processus, tels que la prolifération, la différenciation, la migration et l'invasion des différents types de cellules se produisent. Ces processus cellulaires peuvent être effectués individuellement avec différentes méthodes. Cependant, les conditions expérimentales doivent considérer les interactions cellulaires avec l'ECM de stroma de tumeur, puisque la rigidité du substrat influence le processus de différenciation de CAF. R.G. Wells a commenté sur l'impact de la rigidité de matrice sur le comportement cellulaire et a souligné que l'organisation cytosquelettique et le statut de différenciation observés dans les cellules cultivées in vitro pourraient être artéfactuels7. Différents stimuli semblent être impliqués dans la différenciation des FAC, y compris la tension mécanique5,7. Pour éviter cela, les substrats mous 2D pourraient être des approches possibles pour les études de différenciation, car ils contournent le problème du plastique plat de culture rigide. Une surface 2D douce, sur laquelle les fibroblastes peuvent être cultivés, peut être des gels polyacrylamide enduits de collagène-I, par lesquels la rigidité du gel peut être manipulée par la concentration de polyacrylamide et le gel cross-linker. L'adhérence et la formation de fibres de stress riches en SMA sont renforcées dans les fibroblastes avec la rigidité du gel8. Ces résultats soulignent l'importance des échafaudages de substrat souple pour des modèles de différenciation in vitro plus physiologiques. Cependant, dans nos mains la reproductibilité expérimentale et l'imagerie de ces gels étaient provocants. Pour surmonter ces lacunes, nous avons changé le système de substrat souple 2D pour un modèle sphéroïde 3D pour des études de différenciation et d'invasion. Ce modèle est plus pertinent sur le plan clinique et, à l'instar d'un organoïde in vitro, récapitule les interactions cellules-cellules in vivo, la production et le dépôt d'ECM, ainsi que le comportement cellulaire9.
Les sphéroïdes se forment lorsque les cellules n'ont pas de substrat auquel adhérer. Lorsque les cellules sont laissées sans surface adhésive, elles s'agrégent pour former une structure plus ou moins sphérique. Si les sphéroïdes sont composés d'un type de cellule, ils sont appelés homosphéyoïdes; s'ils sont composés de deux ou plusieurs types de cellules différents, ils forment des hétérorosphétoïdes.
Parmi les différentes méthodes de préparation sphéroïde, nous effectuons le protocole en utilisant des plaques rondes non adhérentes en bas de 96 puits. Il est très efficace en ce qui concerne les coûts. Ici, nous produisons à la fois des homosphéroïdes de fibroblastes, caf ou CAFs dépourvus de l'integrin 3 sous-unité pour examiner le processus de différenciation et les hétérorosphénoïdes des CAF ou intégrine 3 CAF ko et cellules de carcinome des canaux pancréatiques (AsPC-I et PANC-I) pour étudier l'invasion dans la matrice environnante.
L'objectif de ces études était d'utiliser des CAF primaires isolés des biopsies du carcinome pancréatique humain. Cependant, les biopsies pour obtenir les cellules sont rares et pour cette raison, les CAF utilisés dans ces études ont été immortalisés à l'aide de lentivirus contenant HTERT. Ils sont appelés iCAFs, et leurs homologues normaux, fibroblastes pancréatiques humains primaires, sont appelés iNFs. Les fibroblastes pancréatiques humains et les cellules du carcinome des canaux pancréatiques, AsPC-I et PANC-I, sont disponibles dans le commerce.
Ce protocole a été employé pour étudier l'effet de l'interaction laminin-332-integrin dans le processus de différenciation de CAF. Pour prouver la spécificité de cette interaction et de sa fonction, des composés inhibiteurs ont été utilisés : BM2, un anticorps monoclonal qui bloque le site de liaison intégrine de la chaîne laminin-332 310, ou lebein 1, un composé dérivé du venin de serpent qui bloque le integrins laminin-contraignants 3,1, 6 et 11,12.
Pour l'analyse d'invasion, les cellules avaient été transduisées avec le lentivirus contenant l'encodage de cDNA codant soit mCherry (iCAFs et integrin s'il n'y a pas 3 KO iCAFs) ou GFP (AsPC-I et PANC-I) pour distinguer les différents types de cellules dans les hétérorosphénoïdes. La transduction des cellules pour les immortaliser et/ou pour les étiqueter avec l'expression de protéine fluorescente (mCherry et GFP) est décrite dans une étude précédente13,qui devrait être consultée pour plus d'informations.
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Protocol
1. Les sphéroïdes 3D comme modèle in vitro pour la différenciation fibroblaste/CAF à l'aide de différents composés inhibiteurs du TGF-1
- Mélanger 1 partie de la solution de méthylcellulose de 6 mg/mL et 3 parties du support de culture cellulaire, MEM complétée avec 1% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur (FBS) et 1% de pénicilline/streptomycine pour obtenir la solution de formation sphéroïde.
- Resuspendre les fibroblastes normaux immortalisés fraîchement décongelés (iNF), les CAF immortalisés (iCAFs) ou l'intégrine de l'iCAF KO 3-1 (passage jusqu'à 25) dans la solution de formation sphéroïde. Si vous préparez une plaque de puits de 96, préparez un excès de solution de formation sphéroïde, 10 ml et ajoutez 75 000 cellules, en gardant à l'esprit que chaque sphéroïde est composé de 750 cellules, et que 100 l sont distribués par puits de la plaque.
- Si des cytokines ou des inhibiteurs de l'intégrine sont inclus dans l'étude, ajoutez ces composés à la suspension cellulaire, afin de les intégrer dans les sphéroïdes pendant leur formation. Notez que les iNF sont stimulés avec 10 ng/mL de TGF-1 afin de déclencher la différenciation. Le cas échéant, ajouter des composés inhibiteurs avec le TGF-1, comme 20 G/mL BM2 ou 10 g/mL de lebein 1.
- Préparer les homosphénoïdes CAF de la même manière, mais sans le stimulus TGF-1, car ils sont déjà différenciés. Préparer l'intégrine 3 KO CAF homosphéroïdes sans l'ajout d'un composé.
- Distribuez la solution de formation sphéroïde sur une plaque ronde 96 multi-puits en ajoutant 100 L de la solution dans chaque puits. Chaque fois que la solution sphéroïde est distribuée dans les puits, bien mélanger par pipetting de haut en bas, plusieurs fois.
- Placez la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 24 h pour permettre la formation d'un sphéroïde dans chaque puits.
- Recueillir les sphéroïdes après environ 24 h et les utiliser à différentes fins en aval: coloration immunofluorescente, en temps réel (RT) q-PCR et la cytométrie de flux. Pour détecter l'expression des antigènes intra- et extracellulaires, y compris le dépôt des protéines DM dans le sphéroïde, utilisez la coloration immunofluorescente. Après la désintégration des sphéroïdes en cellules simples, quantifiez le récepteur membrane-ancré par cytométrie d'écoulement. Pour détecter l'activation des gènes et les changements transcriptionnels, utilisez RT q-PCR de l'ARNm isolé des cellules sphéroïdes.
2. Coloration immunofluorescente des sphéroïdes
- Recueillir les sphéroïdes après environ 24 h dans un tube de réaction de 1,5 ml par condition expérimentale ou par protéine à analyser. Par exemple, placez les sphéroïdes des iNF stimulés par le TGF-1 dans un tube différent des iNF témoins, qui n'ont pas été traités. Pour éviter la rupture des sphéroïdes due à des forces de cisaillement trop fortes, coupez l'extrémité de la pointe de la pipette pour agrandir l'orifice. Inclure au moins 5-10 sphéroïdes dans un tube de réaction, pour permettre les répliques et prendre en compte les pertes possibles pendant les étapes de lavage.
- Centrifugeles les sphéroïdes avec une centrifugeuse de dessus de banc pour environ 30-60 s à 1.000 x g. Retirez soigneusement le supernatant contenant de la méthylcellulose par pipetting, sans déranger les sphéroïdes granulés.
- Laver avec 50 oL de 1x PBS. Répétez l'étape de centrifugation et retirez soigneusement le PBS par pipetting, tel que décrit dans 2.2.
- Selon la protéine à souir, fixer avec 50 oL de 4 % de paraformaldéhyde en PBS pendant 20 minutes à température ambiante (pour les sous-unités de laminin-332 de laminine, NG2 et d'intégrine).
- Répétez l'étape de lavage comme expliqué dans les étapes 2.2-2.3.
- Perméabilize les cellules avec 0,1% Triton-X en PBS pendant 4 min à température ambiante.
- Répétez l'étape de lavage comme expliqué dans les étapes 2.2-2.3 trois fois.
- Incuber les sphéroïdes dans PBS contenant 5% FBS et 2% BSA, pour 1 h à RT pour bloquer les sites d'interaction protéique non spécifiques.
- Incuber les sphéroïdes avec 30 oL d'anticorps primaires dans le PBS, 2,5 % de FBS et 1 % de BSA à 4 oC pendant la nuit. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : anti-SMA Cy-3 conjugué et anti-NG2 à 5 g/mL ; BM2 anti-laminin 3, 6F12 anti-laminin 3 et anti-laminin 2 20 g/mL.
- Répétez l'étape de lavage comme expliqué dans les étapes 2.2-2.3 trois fois.
- Incuber les sphéroïdes avec 30 l d'anticorps secondaires en PBS, 2,5% FBS et 1% BSA à RT pendant 90 min. Les anticorps secondaires suivants utilisés étaient : Alexa 488 anti-lapin et anti-souris (5 g/mL).
- Répétez l'étape de lavage comme expliqué dans les étapes 2.2-2.3 trois fois.
- Incuber les cellules avec une solution de coloration DAPI de 30 l l pendant 4 min à température ambiante.
- Répétez l'étape de lavage comme expliqué dans les étapes 2.2-2.3.
- Placer les sphéroïdes sur un toboggan en verre, dans une goutte de PBS, à l'aide d'un tuyau pasteur en verre.
- Imagez les sphéroïdes par microscopie de fluorescence dans un microscope à balayage laser à l'aide d'un grossissement de 10x. Prenez différentes sections optiques du sphéroïde à différents plans optiques d'une z-pile (15-20 avions pile). Pour établir les réglages laser dans le microscope, utilisez un sphéroïde composé de cellules négatives pour l'antigène d'intérêt ou un sphéroïde taché seulement avec l'anticorps secondaire. Réutiliser les mêmes réglages pour tous les échantillons qui seront comparés.
- Analyser les images microscopiques avec le logiciel ImageJ tel que publié précédemment14. Les étapes sont résumées dans la figure supplémentaire 1. En arrière-plan, déterminez la densité de signal intégrée d'une région d'intérêt sans cellules (ROI). Calculer la fluorescence cellulaire corrigée totale (TCCF) comme :
- Déterminer la fluorescence corrigée totale (TCF) des sphéroïdes à mesure que le TCCF se normalisait en fonction de la zone du sphéroïde et du nombre de piles.
3. RT q-PCR des homosphéroïdes
- Pour effectuer RT-qPCR, recueillir au moins 288 sphéroïdes (correspondant à trois plaques de 96 puits) dans un tube de réaction de 50 ml. Centrifugeuse pendant 5 min à 1 000 x g et retirez soigneusement le supernatant contenant de la méthylcellulose en pipetting sans déranger les sphéroïdes granulés.
- Laver avec 1 ml de 1x PBS et transférer les sphéroïdes dans un tube de réaction de 1,5 ml. Centrifugeles les sphéroïdes avec une centrifugeuse de dessus de banc pour environ 30-60 s à 1.000 x g. Retirez soigneusement le PBS par pipetting, sans déranger les sphéroïdes granulés.
- Dissocier les sphéroïdes avec 250 oL de 4 mg/mL de collagène B, 50 g/mL DNase I, 2 % BSA, 1 mM CaCl2 en PBS à 37 oC pendant environ 30-45 min en vortexant doucement et en pulsant par intermittence pendant quelques secondes toutes les 5 minutes.
- Répétez l'étape de lavage comme expliqué à l'étape 3.2.
- Isoler l'ARN total des cellules des sphéroïdes désintégrés à l'aide d'un kit commercial d'isolement de l'ARN, selon les instructions des fabricants.
- Inverser transcrire l'ARNm isolé en cDNA avec un kit commercial, selon les instructions des fabricants.
- Quantifier les niveaux de transcription en répliques par PCR en temps réel. Les amorces utilisées étaient les suivante : '-SMA: Fw 5'-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3', Rev 5' ACAGAGTTTGCGCTCCGAA-3'3'15; Chaîne Laminin no 3 : Fw 5-GCTCAGCTGTTTGtTGTGGTTTGA-3, Rev 5-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-36 ; Chaîne Laminin no 3 : Fw 5-GGCAGATGATGATGGGGCAGCCGAGGAA-3Rev 5-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3'17; Chaîne Laminin no 2 : Fw 5-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3Rev 5-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3' 16; NG2: Fw 5-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3Rev 5-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3'18; integrin 3 sous-unité: Fw 5'-AGGGGACCTCAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3'19; TOP-1: Fw 5-CCAGACGGAAGCTCGGAAAAAC-3Rev 5-GTCCAGGAGGCTTTTTTTTTGAA-3.
- Corriger les valeurs Ct pour la valeur Ct d'un gène de référence endogène tel que TOP-1 en utilisant l'équation: 2- Ct. Ct 'Ct 'Ct (échantillon cible) ' 'Ct (échantillon de référence) et 'Ct' Ct du gène cible ou du gène de référence ' TOP-I.
4. Analyse de cytométrie de flux de l'expression intégrine
- Pour l'analyse cytométrique du débit, recueillir au moins 288 sphéroïdes (correspondant à trois plaques de 96 puits) dans un tube de réaction de 50 ml. Centrifugeuse pendant 5 min à 1 000 x g et retirez soigneusement le supernatant contenant de la méthylcellulose par pipetting.
- Laver avec 1 ml de 1x PBS et transférer les sphéroïdes dans un tube de réaction de 1,5 ml. Répétez l'étape de centrifugation et retirez soigneusement le PBS par pipetting.
- Dissocier les sphéroïdes tels que décrits à l'étape 3.3.
- Répétez l'étape de lavage comme expliqué à l'étape 4.2.
- Pour bloquer les sites de liaison non spécifiques et pour empêcher la liaison d'anticorps pertinents à la détection aux récepteurs FcMD (CD16, CD32 et CD64), incuber les cellules dans 100 L de PBS contenant 2 % de sérum de cheval (ou sérum d'une autre espèce animale, dont les anticorps ne seront pas utilisé dans l'expérience) et 0,1% BSA pendant 20 min à 4 oC avec rotation.
- En cas de coloration des marqueurs intracellulaires, fixer / perméabize les cellules telles que décrites sous l'étape 2.2-2.5.
- Incuber les cellules avec les anticorps primaires dans 100 OL de PBS contenant 2% de sérum de cheval et 0,1% de BSA pendant 30 min à 4 oC avec rotation. Diluer l'anticorps primaire à 10 g/mL.
- Laver avec 100 L de PBS - 0,1% BSA trois fois, avec des étapes de centrifugation dans la centrifugeuse du banc supérieur à 1000 x g entre les deux.
- Incuber les cellules avec les anticorps secondaires dans 100 OL de PBS contenant 2% de sérum de cheval et 0,1% de BSA pendant 30 min à 4 oC avec rotation. Diluer l'anticorps secondaire à 10 g/mL.
- Répétez l'étape de lavage comme expliqué à l'étape 4.7.
- Analyser 2,0 x 104 cellules tachées dans un cytomètre d'écoulement. Porte pour les cellules vivantes simples par l'intermédiaire de la parcelle de point FSC-SSC et analysez la fluorescence des cellules fermées sur le canal approprié pour le fluorophore sélectionné.
5. Exemple d'invasion à l'aide d'hétérosphézoïdes
- Préparer la solution de formation sphéroïde pour les hétérorosphétoïdes, contenant les différents types de cellules et les médiums correspondants, tel que résumé dans le tableau 1. Les cellules avaient été précédemment transdulées avec le lentivirus contenant des vecteurs pour l'expression mCherry ou GFP.
- Remplir 100 L de la solution de formation sphéroïde dans chaque puits de la plaque et incuber la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 24 h pour permettre la formation d'un sphéroïde dans chaque puits.
- Préparer 60 l de mélange de matrice gélatineuse contenant 2 mg/ml de collagène de queue de rat I, 30 % de matrice de gélification commerciale et 2,5 g/mL de laminin-332 dans un tube de réaction de 1,5 mL. Distribuer rapidement 15 L dans 3 puits de la chambre d'angiogenèse de la diapositive. Intégrer un sphéroïde dans chaque puits contenant déjà le gel.
- Si nécessaire, ajustez rapidement l'emplacement du sphéroïde au centre du puits avec une pipette sous le microscope.
- Répétez les étapes 5.2-5.3 pour les prochains hétérorosphénoïdes et répétez à nouveau pour les homosphéyoïdes.
- Incuber les gels dans l'incubateur pendant 1 h pour se solidifier et, ensuite, reconss doucement les gels avec le milieu de culture cellulaire.
- Imagez les sphéroïdes par microscopie de fluorescence dans un microscope à balayage laser. Prendre différentes sections optiques du sphéroïde à différents plans optiques d'une z-pile et à différents moments d'invasion (par exemple, 0 h, 24 h, 48 h et 72 h).
- Analysez les images en comptant le nombre de cellules cancéreuses envahissantes. Les cellules d'invasion sont celles qui ont quitté le sphéroïde et sont entrées dans la zone envahissante. La zone envahissante est définie comme la zone de l'anneau entre les périmètres extérieurs et intérieurs donnés par la cellule la plus éloignée envahie et par la bordure sphéroïde du sphéroïde au début des expériences d'invasion, respectivement, comme indiqué dans la figure supplémentaire 2 .
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Representative Results
Les résultats de cette conception expérimentale sont publiés dans Martins Cavaco et al.13, qui est recommandé pour une lecture plus approfondie des conclusions qui ont été tirées de ces expériences.
Figure 1, image représentative d'un sphéroïde immunofluorescent, montre l'immunostaining de la sous-unité integrin no 3 des fibroblastes normaux immortalisés et des CAF immortalisés (figure 1A), ainsi que l'immunofluorescence quantification (Figure 1B) et les niveaux transcriptionnels du gène de sous-unité intégrine no 3 par qPCR (Figure 1C). Ce panel de résultats démontre que l'intégrine 3 est régulée dans les iCAF, par rapport à la contrepartie normale. Cela a prouvé que l'intégrine 3'1 peut être considérée comme un marqueur pour la différenciation des fibroblastes pancréatiques. Cela a également été démontré par les études de cytométrie de flux13.
Figure 1. Expression de la sous-unité d'intégrine 3 par les iNF et les iCAB. La sous-unité intégrine 3 est régulée par les ICAB, ce qui reflète son potentiel en tant que marqueur de différenciation pour les CAT pancréatiques. (A) La coloration immunofluorescente des homosphéroïdes des fibroblastes pancréatiques normaux (iNFS) par rapport aux homosphéyoïdes de l'iCAF montre un signal accru de la sous-unité integrin no 3 dans les cellules différenciées. (B) Le signal de fluorescence des cellules dans le sphéroïde a été quantifié avec les images Z-pile du sphéroïde 3D, à l'aide du logiciel ImageJ. Moyens - SEM de trois expériences indépendantes sont montrés et comparés par t-test (, p 'lt; 0.1). (C) Les cellules obtenues à partir des sphéroïdes dissociés ont été analysées pour leurs niveaux transcriptionnels de sous-unité d'intégrine no 3. Moyens - SEM de 'Ct-values que les changements de pli de deux expériences indépendantes sont montrés et comparés par t-test. Bien qu'ils n'atteignent pas le niveau d'importance de 0,1, les niveaux transcriptionnels de l'ARNm integrin 3-encodage sont plus élevés dans les iCAFs que dans les INF. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Les hétérorosphétoïdes | ||
| Type de cellules (passage jusqu'à 25) | Nombre de cellules | Moyen (1 partie méthylcellulose...) |
| mCherry-iCAFs - GFP-AsPC-I | 400 CAF et 400 cellules cancéreuses pancréatiques | 1,5 pièces de cellules MEM avec 10% de FBS et 1% stylo/streptocoque - 1,5 parties de RPMI avec 10% de FBS et 1% de stylo/strep |
| mCherry-3KO-iCAFs - GFP-AsPC-I | ||
| mCherry-iCAFs - GFP-PANC-I | 1,5 pièces de cellules MEM avec 10% de FBS et 1% stylo/streptocoque - 1,5 parties de DMEM avec 10% de FBS et 1% de stylo/strep | |
| mCherry-3KO-iCAFs - GFP-PANC-I | ||
| Homosphéroïdes | ||
| Type de cellule (passage jusqu'à 25) | Nombre de cellules | Moyen (1 partie méthylcellulose...) |
| mCherry-iCAFs | 400 cellules | 3 pièces MEM complétées par 10% de FBS et 1% stylo/strep |
| mCherry-3KO-iCAFs | ||
| GFP-AsPC-I | 3 parties RPMI avec 10% de FBS et 1% stylo/strep | |
| GFP-PANC-I | 3 parties DMEM avec 10% de FBS et 1% stylo/strep | |
Tableau 1. Composition cellulaire des hétéros et des homosphéiens. Le nombre de cellules nécessaires à l'assemblage des hétéros et des homosphéroïdes ainsi que le milieu correspondant qui devrait être utilisé pour la solution de formation sphéroïde sont résumés dans le tableau suivant.
Figure supplémentaire 1. Étapes séquentielles pour quantifier la coloration immunofluorescente d'une protéine d'intérêt dans les sphéroïdes, utilisant ImageJ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2. Étapes séquentielles pour quantifier le nombre de cellules cancéreuses envahissantes dans l'analyse d'invasion, utilisant ImageJ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Développer un modèle in vitro approprié pour étudier la différenciation des FAC est une tâche difficile. Après avoir utilisé différentes approches, nous avons conclu qu'un modèle sphéroïde 3D est le modèle le plus pratique, physiologique et cliniquement pertinent, dans lequel l'interaction entre les cellules du carcinome pancréatique avec des CAF immortalisés peut être étudiée. Ce modèle a empêché la différenciation spontanée des fibroblastes, due aux facteurs de stress artéfactuels tels que la rigidité du plastique de culture cellulaire, au moins dans des conditions de culture à court terme (jusqu'à 48 h). Bien que la rigidité exacte du sphéroïde utilisé dans ces études n'ait pas été mesurée, Ito et coll. ont évalué la rigidité des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine et des hétérosphézoïdes de cellules souches mésenchymales à l'aide d'une puce microfluidique intégrée robotisée22. L'indice moyen de rigidité des hétérorosphénoïdes a été mesuré 1 et 3 jours après l'assemblage. La taille des sphéroïdes était différente, le MSC semblait augmenter leur capacité d'agrégation, ce qui a entraîné une diminution de la taille au fil du temps (de 135,5 à 99,8 m)21,22. Par conséquent, la rigidité du sphéroïde a également augmenté de 5,0 x 10-3 à 7,5 x 10-3 Pa22. Cependant, la rigidité des sphéroïdes composés d'une population hétérotypique de CAFs et d'AsPC-I pourrait posséder des propriétés mécaniques et des valeurs de rigidité différentes de celles des homosphéroïdes constitués d'une seule population de fibroblastes/CAF. Ceci est encore inconnu et pourrait être différent de ce qui a été décrit par Ito et al22. La rigidité dépend également de la quantité et du lien croisé de l'ECM produit par les cellules et déposé, des différentes interactions cellule-cellule au sein du sphéroïde, du nombre de cellules dans le sphéroïde ou de la durée de la culture.
Comme tout autre modèle, la conception expérimentale implique certaines variables qui ont besoin d'optimisation telles que le nombre de cellules nécessaires pour former les sphéroïdes, les moments de traitement et d'imagerie microscopique. La conception expérimentale décrite a été optimisée dans le but d'avoir une taille sphéroïde, qui aurait une influence minimale dans la diffusion des nutriments et de l'oxygène, car il ya une limite de diffusion en raison de limitations de transport de masse9. Par exemple, le transport de l'oxygène dans les sphéroïdes d'une taille supérieure à 150-200 m est significativement affecté, ainsi que la diffusion du glucose et du lactate, dans des agrégats supérieurs à 300 m9,18. Les sphéroïdes d'un diamètre supérieur à 400-500 m présentent habituellement une structure concentrique composée d'un noyau nécrotique entouré d'une couche viable de cellules quiescentes et d'un bord externe de cellules proliférantes9,24. Afin d'éviter la diffusion limitée des composés et d'éliminer le problème du noyau sphéroïde inaccessible, les cellules ont été traitées avec du TGF-1, du BM2 et de la lebein-1 avant la formation du sphéroïde, lorsque les cellules sont suspendues individuellement dans la solution de formation sphéroïde. En outre, pour permettre la disponibilité de l'oxygène et des nutriments à la plupart des cellules dans le sphéroïde et pour empêcher la formation d'un noyau nécrotique, le nombre de cellules par sphéroïde a été réduit à 750-1000 cellules, qui forment des sphéroïdes avec un diamètre de 140-200 m.
Il est important de bien mélanger les différents types de cellules dans la solution de formation sphéroïde, de sorte que les sphéroïdes sont composés par environ le même nombre de cellules, en évitant les différences de taille significatives entre les sphéroïdes. Néanmoins, parfois certains sphéroïdes peuvent être légèrement plus grands que l'autre et qui se traduira par plus de Z-stacks acquis dans le microscope. Certains sphéroïdes peuvent également s'écarter de la forme parfaitement sphérique, mais cela est également pris en compte lorsque le retour sur investissement du sphéroïde est délimité. Ces différences de taille et de forme sont prises en compte dans les valeurs de quantification normalisées telles qu'expliquées dans le paragraphe suivant. Un autre facteur important concernant la forme du sphéroïde est le type de cellule. Par exemple, les fibroblastes et les CAF forment des sphéroïdes avec une forme presque sphérique, tandis que les cellules AsPC-I et PANC-I forment un agrégat plus dispersé de cellules.
Pour l'imagerie des sphéroïdes, des cryosections de sphéroïdes fixes peuvent également être utilisées, mais l'intégrité du sphéroïde peut être compromise lors de la section, selon le type de cellule et le protocole d'immunostaining. Alternativement, la coloration de l'ensemble du sphéroïde dans sa structure 3D, s'est avéré être une option plus simple. L'acquisition microscopique z-empilés images du sphéroïde comme une structure 3D prend en moyenne 5-15 min par sphéroïde.
Les signaux immunofluorescents dans les images des sphéroïdes sont difficiles à quantifier car ils représentent des plans de structures 3D. La méthode utilisée était basée sur une méthode décrite précédemment, où les auteurs extrapolaient et considéraient le sphéroïde comme une cellule14. De cette façon, le signal de fluorescence est corrigé à l'aide de l'équation 1.
En arrière-plan, la densité de signal intégrée d'une région d'intérêt sans cellules (ROI) a été déterminée. La densité de signal intégrée mesurée est la somme des valeurs d'intensité des pixels dans le roi-retour sélectionné. Puisque les sphéroïdes sont des structures 3D, des images confocales de différentes piles sont acquises. Pour traiter de telles images, on peut mesurer le signal fluorescent dans chaque pile individuellement ou utiliser la somme de toutes les piles dans une projection Z. Toutes les quantifications peuvent être effectuées à l'aide d'ImageJ. La fluorescence corrigée totale (TCF) des sphéroïdes est déterminée comme le TCCF normalisé, compte tenu de la zone de sphéroïde et le nombre de piles, en utilisant l'équation 2. Cela explique les différentes tailles de sphéroïdes et l'écart dans la forme sphérique. L'analyse de la coloration immunofluorescente des sphéroïdes utilisant cette méthode peut prendre jusqu'à 5 min par sphéroïde.
De même, l'invasion des cellules des sphéroïdes dans la matrice stromale environnante peut être analysée par différents algorithmes. Une méthode simple a été précédemment décrite par Nowicki et autres, dans laquelle les cellules invasifs de cancer ont été comptées23. Afin de discriminer les cellules envahissantes de ceux qui n'envahissent pas, il est important d'établir une limite spatiale au-delà de laquelle les cellules sont considérées comme ayant quitté la structure sphéroïde. Par conséquent, le point de départ est la limite qui correspond au périmètre des images sphéroïdes acquises au point de temps initial (temps 0), lorsque les sphéroïdes ont été incorporés dans le gel. La cellule qui envahit le gel le plus éloigné est considérée comme la distance maximale qu'une cellule invasive peut atteindre, et donc, elle définit le bord externe de la région d'invasion. Cette méthode compte les cellules cancéreuses invasives qui sont présentes dans la zone d'invasion, à l'aide de l'outil de comptage d'ImageJ, et le retour sur investissement correspondant au sphéroïde au moment où 0 h est ajouté au gestionnaire de retour sur investissement, puis transposé à l'image du même sphéroïde exact acquis 48 h ou 72 h plus tard. Pour cette raison, il est important que le sphéroïde reste aussi proche du centre des avions que possible, pendant les différents moments de l'acquisition. Compter le nombre de cellules peut prendre jusqu'à 5 min par sphéroïde.
Une autre considération importante est de distinguer les différents types de cellules dans l'hétérorosphéroïde. Cela peut être effectué à l'aide de colorants fluorescents à cellules vivantes, ce qui peut être problématique lorsque le type de cellule a un taux de division cellulaire élevé ou si l'expérience doit être effectuée pendant de longues périodes de temps. La façon la plus robuste et la plus fiable de distinguer les deux populations différentes est de développer des lignées cellulaires exprimant des protéines fluorescentes telles que la mCherry et le GFP. La livraison des vecteurs d'expression peut être effectuée à l'aide de lentivirus, ce qui entraîne une expression stable de ces protéines.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts. Ce matériel ne reflète que les vues de l'auteur et l'Union européenne n'est pas responsable de toute utilisation qui peut être faite des informations qui y sont contenues.
Acknowledgments
Nous reconnaissons l'aide de Barbara Schedding dans la préparation du BM2 et du lebein-1. Nous remercions Àgnes Noel d'avoir partagé son expertise dans les essais sphéroïdes. Nous remercions Sonja Schelhaas et Michael Schàfers pour leur aide dans la gestion de la transfection lentivirale dans des conditions S2. Nous reconnaissons l'insistance de Sabine von Ràden dans la préparation des CAF à partir de tissus cancéreux pancréatiques.
La recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Programme des personnes (Actions Marie Curie) du septième programme-cadre de l'Union européenne, le 7e PC/2007-2013/ dans le cadre de l'accord de subvention REA (316610) à J.A.E. De plus, J.A.E. et A.C.M.C. ont reçu le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) au sein du Cluster d'excellence Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Ce projet a également été soutenu par Wilhelm Sander Stiftung (subvention: 2016.113.1 à J.A.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
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