Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello in vitro 3D per studiare la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro (CAF) in un ambiente di massa tumorale, che può essere affrontato in diversi sistemi di analisi, come l'immunofluorescenza, la trascrizione l'analisi e l'imaging delle cellule di vita.
Abstract
Definire il modello ideale per uno studio in vitro è essenziale, soprattutto se si studiano i processi fisiologici come la differenziazione delle cellule. Nello stroma tumorale, i fibroblasti ospiti sono stimolati dalle cellule tumorali per differenziarsi. Così, acquisiscono un fenotipo che contribuisce al microambiente tumorale e supporta la progressione del tumore. Utilizzando il modello sferoide, abbiamo istituito un tale sistema di modelli in vitro 3D, in cui abbiamo analizzato il ruolo della laminina-332 e il suo recettore integrin n. 31 in questo processo di differenziazione. Questo sistema di modelli sferoidi non solo riproduce le condizioni del microambiente tumorale in modo più accurato, ma è anche un modello molto versatile in quanto consente diversi studi a valle, come la colorazione immunofluorescente di entrambi gli intra che extracellulari marcatori, così come le proteine della matrice extracellulare depositate. Inoltre, le analisi trascrizionali di qPCR, la citometria di flusso e l'invasione cellulare possono essere studiate con questo modello. Qui, descriviamo un protocollo di un modello sferoide per valutare il ruolo dell'integro dei CAF n. 31 e il suo ligando depositato ectopicamente, laminina-332, nella differenziazione e nel sostenere l'invasione delle cellule tumorali del pancreas.
Introduction
Il microambiente tumorale è una nicchia molto complessa ed estremamente importante per il mantenimento e la progressione delle cellule tumorali1. È formato non solo dalle cellule tumorali, ma anche dai fibroblasti stromici. Le cellule tumorali sono circondate da uno stroma specifico e diverso dallo stroma dei tessuti normali2. Laminin-332 è una proteina matrice extracellulare ectopicamente espressa nello stroma di diversi tumori, come l'adenocarcinoma pancreatico3. Inoltre, la composizione biochimica dell'ECM e anche le sue proprietà biofisiche, come rigidità e tensione, cambiano all'interno della massa tumorale4. Questo stroma tumorale, o "stroma reattivo", è causato da un adattamento dei fibroblasti alle cellule tumorali vicine e dal reclutamento di altri giocatori molto importanti che sviluppano un ambiente favorevole e favorevole per la progressione del tumore. La differenziazione dei fibroblasti stromali provoca fibroblasti associati al cancro (CAF). Queste cellule possono essere identificate utilizzando diversi marcatori come actin muscolare sleale (SMA)5 o antigene neurale/gliale 2 (NG2)6.
Il modello in vitro più adatto per ricapitolare il microambiente tumorale (TME) con I CAF è difficile da selezionare. Il metodo per imitare i parametri fisiologici del TME in modo efficiente in termini di costi e riproducibile deve essere considerato per un tale sistema modello. All'interno del TME, si verificano diversi processi, come la proliferazione, la differenziazione, la migrazione e l'invasione dei diversi tipi di cellule. Questi processi cellulari possono essere eseguiti singolarmente con diversi metodi. Tuttavia, le condizioni sperimentali devono considerare le interazioni cellulari con il tumore stroma ECM, poiché la rigidità del substrato influenza il processo di differenziazione CAF. R.G. Wells ha commentato l'impatto della rigidità della matrice sul comportamento cellulare e ha evidenziato che l'organizzazione citoscheletrica e lo stato di differenziazione osservati nelle cellule coltivate in vitro potrebbero essere artefattuale7. Diversi stimoli sembrano essere coinvolti nella differenziazione CAF, tra cui tensione meccanica5,7. Per evitare questo, i substrati morbidi 2D potrebbero essere possibili approcci per gli studi di differenziazione, in quanto eludono il problema della plastica piatto di coltura rigida. Una superficie 2D morbida, su cui possono essere coltivati fibroblasti, può essere gel in poliacrilammide rivestiti di collagene,I, per cui la rigidità del gel può essere manipolata dalla concentrazione di poliacrilammide e dal paralinker ad gel. L'adesione e la formazione di fibre da stress ricche di SMA sono esaltate nei fibroblasti insieme alla rigidità del gel8. Questi risultati sottolineano l'importanza degli scaffold di substrato morbido per modelli di differenziazione in vitro più fisiologici. Tuttavia, nelle nostre mani la riproducibilità sperimentale e l'imaging di questi gel erano impegnativi. Per superare queste carenze, abbiamo cambiato il sistema di substrato morbido 2D per un modello di sferoide 3D per gli studi di differenziazione e invasione. Questo modello è più clinicamente rilevante e, simile a un organoide in vitro, riassume in vivo le interazioni cellula-cellula, la produzione e la deposizione di ECM, nonché il comportamento cellulare9.
Gli sferoidi si formano quando le cellule non hanno un substrato a cui aderire. Quando le cellule vengono lasciate senza una superficie adesiva, si aggregano per formare una struttura più o meno sferica. Se gli sferoidi sono composti da un tipo di cellula, sono chiamati omospheroidi; se composti da due o più tipi di cellule diverse formano eterospheroidi.
Tra i diversi metodi per la preparazione degli sferoidi, eseguiamo il protocollo utilizzando piastre di 96 pozze di fondo rotonde non aderenti. È molto efficace per quanto riguarda i costi. Qui produciamo sia omospheroidi di fibroblasti, CAF o CAF privi della sottounità integrin n. 3 per esaminare il processo di differenziazione e gli eterospheroidi dei CAF o integrin, ovvero LE CAF e le cellule carcinoma pancreatiche (AsPC-I e PANC-I) per studiare l'invasione nella matrice circostante.
L'obiettivo di questi studi era quello di utilizzare CAF primari isolati dalle biopsie del carcinoma pancreatico umano. Tuttavia, le biopsie per ottenere le cellule sono scarse e per questo motivo, i CAF utilizzati in questi studi sono stati immortalati utilizzando lentivirus contenente HTERT. Sono chiamati iCAIf, e le loro controparti normali, fibroblaste pancreatiche umane primarie, sono chiamate iNF. I fibroblasti pancreatici umani e le cellule carcinomiche del condotto pancreatico, AsPC-I e PANC-I, sono disponibili in commercio.
Questo protocollo è stato utilizzato per studiare l'effetto dell'interazione laminina-332-integrin nel processo di differenziazione CAF. Per dimostrare la specificità di questa interazione e della sua funzione, sono stati utilizzati composti inibitori: BM2, un anticorpo monoclonale che blocca il sito di legame integrin i lamini lamin-33 catena10, o lebein1, un composto derivato dal veleno di serpente che blocca il integrins leganti alla laminina : 3 , 1 , 1 e 7 ,11,12.
Per il saggio di invasione, le cellule erano state tradusse con lentivirus contenente la codifica cDNA o mCherry (iCAF e iCAF) o GFP integr (AsPC-I e PANC-I) per distinguere i diversi tipi di cellule negli eterospheroids. La trasduzione delle cellule per immortalarle e/o per etichettarle con espressione di proteina fluorescente (mCherry e GFP) è descritta in uno studio precedente13, che dovrebbe essere consultata per ulteriori informazioni.
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Protocol
1. Sferoidi 3D come modello in vitro per la differenziazione fibroblasto/CAF utilizzando diversi composti inibitori di TGF-1 dell'interazione cellula-matrice
- Mescolare 1 parte della soluzione di metilcellulosa a 6 mg/mL e 3 parti dei mezzi di coltura cellulare, MEM ha integrato con l'1% del siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e l'1% di penicillina/streptomimina per ottenere la soluzione di formazione di sferoidi.
- Risospendere i fibroblasti normali (iCF) appena scongiurati, immortalati CAF (iCAF) o integrin sèppi (passaggio fino a 25) nella soluzione di formazione degli sferoidi. Se si prepara una piastra da 96 pozzetti, preparate un eccesso di soluzione di formazione degli sferoidi, 10 mL e aggiungete 75.000 cellule, tenendo presente che ogni sferoide è composto da 750 cellule, e che 100 l sono distribuiti per ogni pozzo della piastra.
- Se le citochine o gli inibitori dell'integrina sono inclusi nello studio, aggiungere questi composti alla sospensione cellulare, al fine di incorporarli negli sferoidi durante la loro formazione. Si noti che gli iNF sono stimolati con 10 ng/mL di TGF-1 al fine di innescare la differenziazione. Se necessario, aggiungere i composti inibitori insieme al TGF-1, ad esempio 20 g/mL BM2 o 10 g/mL di lebeina 1.
- Preparare gli omospheroidi CAF nello stesso modo, ma senza lo stimolo TGF-1, dal momento che sono già differenziati. Preparare gli omospheroidi di integro 3 KO CAF senza l'aggiunta di alcun composto.
- Distribuire la soluzione di formazione degli sferoidi su una piastra multi-bene tonda 96 aggiungendo 100 l'l della soluzione in ogni pozzo. Ogni volta che la soluzione sferoide viene distribuita nei pozzi, mescolare bene pipetting su e giù, più volte.
- Posizionare la piastra nell'incubatrice a coltura cellulare per 24 h per consentire la formazione di uno sferoide in ogni pozzo.
- Raccogliere gli sferoidi dopo circa 24 h e utilizzarli per diversi scopi a valle: colorazione immunofluorescente, tempo reale (RT) q-PCR e citometria di flusso. Per rilevare l'espressione di antigeni intra ed extracellulari, compresa la deposizione di proteine ECM all'interno dello sferoide, utilizzare la colorazione immunofluorescente. Dopo la disintegrazione degli sferoidi in singole cellule, quantifica il recettore ancorato alla membrana per citometria di flusso. Per rilevare l'attivazione genica e i cambiamenti trascrizionali, utilizzare RT q-PCR di mRNA isolato dalle cellule sferoidi.
2. Colorazione immunofluorescente degli sferoidi
- Raccogliere gli sferoidi dopo circa 24 h in un tubo di reazione da 1,5 mL per condizione sperimentale o per proteina da analizzare. Ad esempio, posizionare gli sferoidi degli INF stimolati con il TGF-1 in un tubo diverso dagli INF di controllo, che non sono stati trattati. Per evitare la rottura degli sferoidi a causa di forze di taglio troppo forti, tagliare l'estremità della punta della pipetta per ingrandire l'orifizio. Includere almeno 5-10 sferoidi in un tubo di reazione, per consentire repliche e tener conto delle possibili perdite durante le fasi di lavaggio.
- Centrifugare gli sferoidi con una centraleratura panca per circa 30-60 s a 1.000 x g. Rimuovere con attenzione il supernatale contenente metilcellulosa con la pipettatura, senza disturbare gli sferoidi pelleti.
- Lavare con 50 -L di 1x PBS. Ripetere la fase di centrifugazione e rimuovere con attenzione il PBS con il pipettaggio, come descritto nella versione 2.2.
- A seconda della proteina da macchiare, fissare con 50 , luna del 4% di paraformaldeide in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente (per la sMA, NG2 e integrin n. 31) o con 50 lun di metanolo per 10 min a -20 gradi (per le sottounità laminin-332).
- Ripetere il passaggio di lavaggio come spiegato nei passaggi 2.2-2.3.
- Permeabilizzare le cellule con 0,1% Triton-X in PBS per 4 min a temperatura ambiente.
- Ripetere il passaggio di lavaggio come spiegato nei passaggi 2.2-2.3 tre volte.
- Incubare gli sferoidi in PBS contenenti il 5% di FBS e il 2% di BSA, per 1 h a RT per bloccare siti di interazione con proteine non specifici.
- Incubare gli sferoidi con 30 -L di anticorpi primari in PBS, 2,5% FBS e 1% BSA a 4 gradi durante la notte. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: anti-SMA Cy-3 coniugato e anti-NG2 a 5 g/mL; BM2 anti-laminina n. 3, 6F12 anti-lamin n. 3 e anti-lamininin2 20 g/mL.
- Ripetere il passaggio di lavaggio come spiegato nei passaggi 2.2-2.3 tre volte.
- Incubare gli sferoidi con 30 - L di anticorpi secondari in PBS, 2,5% FBS e 1% BSA a RT per 90 min. I seguenti anticorpi secondari utilizzati erano: Alexa 488 anti-coniglio e antitopo (5 g/mL).
- Ripetere il passaggio di lavaggio come spiegato nei passaggi 2.2-2.3 tre volte.
- Incubare le cellule con 30 - L di SOLUZIONE di colorazione DAPI per 4 min a temperatura ambiente.
- Ripetere il passaggio di lavaggio come spiegato nei passaggi 2.2-2.3.
- Posizionare gli sferoidi su uno scivolo di vetro, in una goccia di PBS, utilizzando un tubo di pasteur di vetro.
- Immagina gli sferoidi mediante microscopia a fluorescenza in un microscopio a scansione laser utilizzando un ingrandimento di 10x. Prendere diverse sezioni ottiche dello sferoide su diversi piani ottici di uno z-stack (15-20 piani di pila). Per stabilire le impostazioni laser al microscopio, utilizzare uno sferoide composto da cellule negative per l'antigene di interesse o uno sferoide macchiato solo con l'anticorpo secondario. Riutilizzare le stesse impostazioni per tutti i campioni che verranno confrontati.
- Analizzare le immagini microscopiche con il software ImageJ come pubblicato in precedenza14. I passaggi sono riepilogati nella figura supplementare 1. Come sfondo, determinare la densità del segnale integrato di una regione di interesse senza cellule (ROI). Calcolare la fluorescenza totale delle cellule corretta (TCCF) come:
- Determinare la fluorescenza totale corretta (TCF) degli sferoidi quando il TCCF si è normalizzato nell'area dello sferoide e nel numero di pile.
3. RT q-PCR degli omospheroidi
- Per eseguire RT-qPCR, raccogliere almeno 288 sferoidi (corrispondenti a tre piastre da 96 pozze) in un tubo di reazione da 50 mL. Centrifuga per 5 min a 1.000 x g e rimuovere con attenzione il supernatante contenente metilcellulosa con pipettaggio senza disturbare gli sferoidi pelleti.
- Lavare con 1 mL di 1x PBS e trasferire gli sferoidi in un tubo di reazione da 1,5 mL. Centrifugare gli sferoidi con una centraleratura panca per circa 30-60 s a 1.000 x g. Rimuovere con cura il PBS pipettando, senza disturbare gli sferoidi pelleti.
- Dissociare gli sferoidi con 250 l una di 4 mg/mL di collagenasi B, 50 g/mL DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl2 in PBS a 37 min per circa 30-45 min da vortice delicatamente e pulsando ad intermittenza per alcuni secondi ogni 5 min.
- Ripetere la fase di lavaggio come spiegato nel passaggio 3.2.
- Isolare l'RNA totale dalle cellule degli sferoidi disintegrati utilizzando un kit commerciale di isolamento dell'RNA, secondo le istruzioni dei produttori.
- Trascrivere inversamente l'mRNA isolato in cDNA con un kit commerciale, secondo le istruzioni dei produttori.
- Quantificare i livelli di trascrizione nelle repliche tramite PCR in tempo reale. I primer utilizzati sono stati: s-SMA: Fw 5-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3, Rev 5' ACAGAGTATTGCTGCTCCGAA-3'15; Lamin : catena Di lamin n. 3: Fw 5-GCTCAGCTGTTGTTGTTGA-3, Rev 5,TGTCTGCTGCCAATAGC-3,16; Catena di Laminin 3: Fw 5-GGGATGATTAGGGCAGCCGAA-3 Rev 5-CGGACCTGGTGGATTAGGAGCCGTGT-3 '17; Catena Laminin2: Fw 5'-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3' Rev 5-TCGAGCACTAAGAGABAA -ACCTTTGG-3' 16; NG2: Fw 5-CTGCAGGTCTCTCGGTCA-3' Rev 5'-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3'18; sottounità integrin n. 3: Fw 5'-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3'19; TOP-1: Fw 5-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 , Rev 5 ,GTCCAGGAGGCTCTCTCTCTGAA-3,20.
- Correggere i valori Ct per il valore Ct di un gene di riferimento endogeno, ad esempio TOP-1 utilizzando l'equazione: 2- Ct . -Ct -Ct (campione bersaglio) – - Ct (campione di riferimento) e Ct ct del gene bersaglio o gene di riferimento – TOP-I.
4. Analisi della citometria di flusso dell'espressione dell'integrinina
- Per l'analisi citometrica del flusso, raccogliere almeno 288 sferoidi (corrispondenti a tre piastre da 96 pozze) in un tubo di reazione da 50 mL. Centrifuga per 5 min a 1.000 x g e rimuovere con attenzione la supernata contenente metilcellulosa mediante pipettatura.
- Lavare con 1 mL di 1x PBS e trasferire gli sferoidi in un tubo di reazione da 1,5 mL. Ripetere la fase di centrifugazione e rimuovere con cautela il PBS pipetting.
- Dissociare gli sferoidi come descritto al punto 3.3.
- Ripetere la fase di lavaggio come spiegato nel passaggio 4.2.
- Per bloccare i siti di legame non specifici e per evitare il legame di anticorpi rilevanti per il rilevamento ai recettori Fc (CD16, CD32 e CD64), incubare le cellule in 100 nell'esperimento) e lo 0,1% di BSA per 20 min a 4 gradi centigradi con la rotazione.
- In caso di colorazione dei marcatori intracellulari, fissare/permeilizzare le cellule come descritto al punto 2.2-2.5.
- Incubare le cellule con gli anticorpi primari in 100 : L di PBS contenente il 2% di siero di cavallo e lo 0,1% di BSA per 30 min a 4 gradi centigradi con rotazione. Diluire l'anticorpo primario a 10 g/mL.
- Lavare con 100 gradi l di PBS - 0,1% di BSA tre volte, con gradini di centrifuga nella centrifuga della panca superiore a 1.000 x g in mezzo.
- Incubare le cellule con gli anticorpi secondari in 100: L di PBS contenente il 2% di siero di cavallo e lo 0,1% di BSA per 30 min a 4 gradi centigradi con rotazione. Diluire l'anticorpo secondario a 10 g/mL.
- Ripetere la fase di lavaggio come spiegato nel passaggio 4.7.
- Analizzare 2,0 x 104 cellule colorate in un citometro a flusso. Cancello per singole cellule vive tramite il grafico a punti FSC-SSC e analizzare la fluorescenza delle cellule gated sul canale appropriato per il fluoroforo selezionato.
5. Assaggio dell'invasione con eterospheroidi
- Preparare la soluzione di formazione degli sferoidi per gli eterospheroidi, contenente i diversi tipi di cellule e i mezzi corrispondenti, come riassunto nella tabella 1. Le cellule erano state precedentemente traduci con lentivirus contenente vettori per l'espressione mCherry o GFP.
- Riempire 100 l della soluzione di formazione degli sferoidi in ogni pozzo della piastra e incubare la piastra nell'incubatrice di coltura cellulare per 24 h per consentire la formazione di uno sferoide in ogni pozzo.
- Preparare 60 l-l di miscela di matrice gelatinosa contenente 2 mg/mL di collagene coda di ratto I, il 30% della matrice di gelificazione commerciale e 2,5 g/mL di laminina-332 in un tubo di reazione di 1,5 mL. Distribuire rapidamente 15 L in 3 pozzi della camera di angiogenesi. Incorporare uno sferoide in ogni pozzo già contenente il gel.
- Se necessario, regolare rapidamente la posizione dello sferoide al centro del pozzo con una pipetta al microscopio.
- Ripetere i passaggi da 5,2 a 5,3 per gli eterospheroidi successivi e ripetere l'operazione per gli omospheroidi.
- Incubare i gel nell'incubatrice per 1 h per solidificare e, quindi, sovrapporre delicatamente i gel con il mezzo di coltura cellulare.
- Immagina gli sferoidi mediante microscopia a fluorescenza in un microscopio a scansione laser. Prendere diverse sezioni ottiche dello sferoide su diversi piani ottici di uno z-stack e in diversi punti di invasione del tempo (ad esempio, 0 h, 24 h, 48 h e 72 h).
- Analizzare le immagini contando il numero di cellule tumorali invasori. Le cellule invasive sono quelle che hanno lasciato lo sferoide ed sono entrate nell'area invasiva. L'area invasiva è definita come l'area ad anello tra i perimetri esterni e interni datata dalla cella più invasa più lontana e dal bordo sferoide dello sferoide all'inizio degli esperimenti di invasione, rispettivamente, come descritto nella figura supplementare 2 .
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Representative Results
I risultati di questo progetto sperimentale sono pubblicati in Martins Cavaco et al.13, che è raccomandato per ulteriori letture sulle conclusioni che sono state tratte da questi esperimenti.
Figura 1, un'immagine rappresentativa di uno sferoide immunofluorescente, mostra l'immunostainizzazione della sottounità integrin n. 3 di fibroblasti normali immortalati e CAF immortalati (Figura1A), così come l'immunofluorescenza quantificazione (Figura 1B) e i livelli trascrizionali del gene dell'integrina di sottounità n. 3 di qPCR (Figura 1C). Questo pannello di risultati dimostra che l'integrin n. 3 è up-regolato negli iCAF, rispetto alla controparte normale. Ciò ha dimostrato che l'integrin n. 3-1 può essere considerato un indicatore della differenziazione dei fibroblasti pancreatici. Questo è stato dimostrato anche da studi di citometria di flusso13.
come illustrato nella Figura 1. Espressione della sottounità integrin n. 3 da parte di iNF e ICAF. La sottounità n. 3 è regolata da iCAF, riflettendo il suo potenziale come marcatore di differenziazione per i CAF pancreatici. (A) La colorazione immunofluorescente degli omospheroidi dei fibroblasti pancreatici normali (iNFS) rispetto agli omospheroidi dell'iCAF mostra un segnale maggiore della sottounità integrinn . (B) Il segnale di fluorescenza delle cellule nello sferoide è stato quantificato con le immagini a z dello sferoide 3D, utilizzando il software ImageJ. Mezzi: SEM di tre esperimenti indipendenti vengono mostrati e confrontati tramite t-test (Sezione p < 0.1). (C) Le cellule ottenute dagli sferoidi dissociati sono state analizzate per i loro livelli trascrizionali di integrare la sottounità n. 3. Mezzi : SEM dei valori di zCT come le modifiche di piegatura da due esperimenti indipendenti vengono mostrati e confrontati tramite t-test. Anche se non raggiungono il livello di significatività di 0,1, i livelli trascrizionali dell'integrina mRNA con codifica n. 3 sono più alti negli iANF che negli iNF. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Eterospheroidi | ||
| Tipo di celle (passaggio fino a 25) | Numero di celle | Medio (1 parte di metilcellulosa...) |
| mCherry-iCAFs - GFP-AsPC-I | 400 CAF - 400 cellule tumorali pancreatiche | 1,5 parti cella MEM con 10% di FBS e 1% penna / strep , 1,5 parti di RPMI con 10% di FBS e 1% penna / streptopp |
| mCherry-'3KO-iCAFs - GFP-AsPC-I | ||
| mCherry-iCAFs - GFP-PANC-I | 1,5 parti cella MEM con 10% di FBS e 1% penna / strep , 1,5 parti di DMEM con 10% di FBS e 1% penna / streptoppa | |
| mCherry-'3KO-iCAFs - GFP-PANC-I | ||
| Omosperoidi | ||
| Tipo di cella (passaggio fino a 25) | Numero di celle | Medio (1 parte di metilcellulosa...) |
| mCherry-iCAFs | 400 cellule | 3 parti MEM integrate con 10% di FBS e 1% penna/streptop |
| mCherry-z3KO-iCAF | ||
| GFP-AsPC-I | 3 parti RPMI con 10% di FBS e 1% penna/streptop | |
| GFP-PANC-I | DMEM da 3 parti con il 10% di FBS e l'1% di penna/streptop | |
Tabella 1. Composizione cellulare di eteroidi e omospheroidi. Il numero di cellule necessarie per assemblare gli eteros e omospheroidi, nonché il mezzo corrispondente che dovrebbe essere utilizzato per la soluzione di formazione degli sferoidi, sono riassunti nella tabella seguente.
Figura supplementare 1. Passaggi sequenziali per la quantificazione della colorazione immunofluorescente di una proteina di interesse per gli sferoidi, utilizzando ImageJ. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2. Passaggi sequenziali per la quantificazione del numero di cellule tumorali invasori nel saggio di invasione, utilizzando ImageJ. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Sviluppare un modello in vitro appropriato per studiare la differenziazione CAF è un compito impegnativo. Dopo aver impiegato approcci diversi, abbiamo concluso che un modello sferoide 3D è il modello più pratico, fisiologico e clinicamente rilevante, in cui è possibile studiare l'interazione tra le cellule carcinoma pancreatiche con CAF immortalati. Questo modello ha impedito la differenziazione spontanea dei fibroblasti, a causa di fattori di stress artefattuali come la rigidità della coltura cellulare plastica, almeno in condizioni di coltura a breve termine (fino a 48 h). Anche se l'esatta rigidità dello sferoide utilizzato in questi studi non è stata misurata, Ito et al. ha valutato la rigidità delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana e degli eterospheroidi delle cellule staminali mesenchymal malacheconiche utilizzando un chip microfluidico integrato robot22. L'indice medio di rigidità degli eterospheroidi è stato misurato 1 e 3 giorni dopo l'assemblaggio. La dimensione degli sferoidi era diversa, la MSC sembrava aumentare la loro capacità di aggregazione, che ha provocato una diminuzione delle dimensioni nel tempo (da 135,5 m a 99,8 m)21,22. Di conseguenza, la rigidità dello sferoide è aumentata anche da 5,0 x 10-3 a 7,5 x 10-3 Pa22. Tuttavia, la rigidità degli sferoidi composti da una popolazione eterotipica di CAF e AsPC-I potrebbe possedere proprietà meccaniche e valori di rigidità diversi da quelli degli omospheroidi costituiti da una singola popolazione di fibroblasti/CAF. Questo è ancora sconosciuto e potrebbe essere diverso da quello descritto da Ito et al22. La rigidità dipende anche dalla quantità e dal collegamento incrociato dell'ECM prodotto e depositato dalle cellule, dalle diverse interazioni cellula-cellula all'interno dello sferoide, dal numero di cellule all'interno dello sferoide o dalla durata della coltura.
Come qualsiasi altro modello, il progetto sperimentale comporta alcune variabili che necessitano di ottimizzazione come il numero di cellule necessarie per formare gli sferoidi, i punti temporali del trattamento e l'imaging microscopico. La progettazione sperimentale descritta è stata ottimizzata con l'obiettivo di avere una dimensione sferoide, che avrebbe un'influenza minima nella diffusione di nutrienti e ossigeno, in quanto vi è un limite di diffusione dovuto alle limitazioni del trasporto di massa9. Ad esempio, il trasporto di ossigeno in sferoidi di dimensioni superiori a 150-200 m è notevolmente influenzato, così come la diffusione di glucosio e lattato, in aggregati superiori a 300 m9,18. Gli sferoidi con diametri superiori a 400-500 m presentano solitamente una struttura a strati concentrialmente costituiti da un nucleo necrotico circondato da uno strato vitale di cellule quiescenti e da un bordo esterno di cellule di proliferazione9,24. Per evitare la limitata diffusione dei composti e per eliminare il problema dell'inaccessibile nucleo sferoide, le cellule sono state trattate con TGF-1, BM2 e lebeina-1 prima della formazione di sferoidi, quando le cellule sono sospese individualmente nella soluzione di formazione degli sferoidi. Inoltre, per consentire la disponibilità di ossigeno e sostanze nutritive per la maggior parte delle cellule dello sferoide e per prevenire la formazione di un nucleo necrotico, il numero di cellule per sferoide è stato ridotto a 750-1000 cellule, che formano sferoidi con un diametro di 140-200 m.
È importante mescolare accuratamente i diversi tipi di cellule nella soluzione di formazione degli sferoidi, in modo che gli sferoidi siano composti approssimativamente dallo stesso numero di cellule, evitando differenze significative di dimensioni tra gli sferoidi. Tuttavia, a volte alcuni sferoidi possono essere leggermente più grandi degli altri e che si tradurrà in più stack z acquisiti al microscopio. Alcuni sferoidi potrebbero anche discostarsi dalla forma perfettamente sferica, ma questo è preso in considerazione anche quando il ROI dello sferoide è delineato. Queste differenze di dimensioni e forma sono prese in considerazione nei valori di quantificazione normalizzati, come spiegato nel paragrafo successivo. Un altro fattore importante per quanto riguarda la forma dello sferoide è il tipo di cellula. Ad esempio, i fibroblasti e i CAF formano sferoidi con una forma quasi sferica, mentre le cellule AsPC-I e PANC-I formano un aggregato di dati più disperso di cellule.
Per l'imaging degli sferoidi, possono essere utilizzate anche criosezioni di sferoidi fissi, tuttavia l'integrità dello sferoide può essere compromessa durante il sezionamento, a seconda del tipo di cellula e del protocollo di immunostaining. In alternativa, la colorazione dell'intero sferoide nella sua struttura 3D, si è rivelata un'opzione più semplice. L'acquisizione di microscopiche immagini impilate da z dello sferoide come struttura 3D richiede in media 5-15 min per sferoide.
I segnali immunofluorescenti nelle immagini degli sferoidi sono difficili da quantificare in quanto rappresentano piani di strutture 3D. Il metodo utilizzato era basato su uno descritto in precedenza, in cui gli autori estrapolavano e consideravano lo sferoide come una cella14. In questo modo, il segnale di fluorescenza viene corretto utilizzando l'equazione 1.
Come sfondo, è stata determinata la densità del segnale integrato di una regione di interesse senza cellule (ROI). La densità del segnale integrato misurata è la somma dei valori di intensità dei pixel all'interno del ROI selezionato. Poiché gli sferoidi sono strutture 3D, vengono acquisite immagini confocali provenienti da pile diverse. Per elaborare tali immagini si può misurare il segnale fluorescente in ogni pila individualmente o utilizzare la somma di tutte le pile in una proiezione a z. Tutte le quantificazioni possono essere eseguite utilizzando ImageJ. La fluorescenza totale corretta (TCF) degli sferoidi è determinata come il TCCF normalizzato, considerando l'area dello sferoide e il numero di pile, utilizzando l'equazione 2. Ciò spiega le diverse dimensioni degli sferoidi e la discrepanza nella forma sferica. L'analisi della colorazione immunofluorescente degli sferoidi utilizzando questo metodo può richiedere fino a 5 min per sferoide.
Allo stesso modo, l'invasione di cellule da sferoidi nella matrice stromaleiana circostante può essere analizzata da diversi algoritmi. Un metodo semplice è stato precedentemente descritto da Nowicki et al, in cui le cellule tumorali invasive sono state conteggiate23. Al fine di discriminare le cellule invasive da quelle che non invadono, è importante stabilire un limite spaziale oltre il quale le cellule sono considerate hanno lasciato la struttura degli sferoidi. Pertanto, il punto di partenza è il limite che corrisponde al perimetro delle immagini sferoidi acquisite al punto iniziale (tempo 0), quando gli sferoidi sono stati incorporati nel gel. La cellula che invade il gel più lontano è considerato la distanza massima che una cellula invasiva può raggiungere, e quindi, definisce il bordo esterno della regione di invasione. Questo metodo conta le cellule tumorali invasive presenti nell'area di invasione, utilizzando lo strumento di conteggio di ImageJ, e il ROI corrispondente allo sferoide al momento viene aggiunto al gestore del ROI e poi trasposto all'immagine dello stesso sferoide esatto acquisito 48 h o 72 h dopo. Per questo motivo, è importante che lo sferoide rimanga il più vicino possibile al centro degli aerei, durante i diversi periodi di acquisizione. Il conteggio del numero di cellule può richiedere fino a 5 min per sferoide.
Un'altra considerazione importante è quella di distinguere i diversi tipi di cellule nell'etereopoide. Questo può essere eseguito utilizzando coloranti fluorescenti a cellule vive, che possono essere problematici quando il tipo di cellula ha un alto tasso di divisione cellulare o se l'esperimento deve essere eseguito per lunghi periodi di tempo. Il modo più robusto e affidabile per distinguere le due diverse popolazioni è quello di sviluppare linee cellulari che esprimano proteine fluorescenti come mCherry e GFP. La consegna dei vettori di espressione può essere eseguita utilizzando il lentivirus, che si traduce nell'espressione stabile di queste proteine.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi. Questo materiale riflette solo le opinioni dell'autore e l'Unione europea non è responsabile per qualsiasi uso che possa essere fatto delle informazioni in esso contenute.
Acknowledgments
Riconosciamo l'aiuto di Barbara Schedding nella preparazione del BM2 e del lebein-1. Riconosciamo che il signor Noel è stato condiviso per aver condiviso la sua esperienza nei saggi sferoidi. Ringraziamo Sonja Schelhaas e Michael Schafers per il loro aiuto nella gestione della trasfezione lentivirale in condizioni Di S2. Riconosciamo l'assistenza di Sabine von Ràden nella preparazione di CAF dal tessuto tuscitico.
La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Programma Persone (Azioni Marie Curie) del settimo programma quadro dell'Unione europea FP7/2007-2013/ in base all'accordo di sovvenzione REA n. (316610) a J.A.E. Inoltre, J.A.E. e A.C.M.C. sono stati sostenuti finanziariamente dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) all'interno del Cluster di Eccellenza Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Questo progetto è stato sostenuto anche da Wilhelm Sander Stiftung (sovvenzione: 2016.113.1 a J.A.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
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