Summary
El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.
Abstract
Definir el modelo ideal para un estudio in vitro es esencial, principalmente si se estudian procesos fisiológicos como la diferenciación de células. En el estroma tumoral, los fibroblastos del huésped son estimulados por las células cancerosas para diferenciarse. Por lo tanto, adquieren un fenotipo que contribuye al microambiente tumoral y apoya la progresión tumoral. Mediante el uso del modelo de esferoides, hemos configurado un sistema de modelo 3D in vitro, en el que analizamos el papel de laminina-332 y su receptor integrador n.o 3-1 en este proceso de diferenciación. Este sistema modelo esferoide no sólo reproduce las condiciones tumorales de microambiente de una manera más precisa, sino que también es un modelo muy versátil ya que permite diferentes estudios aguas abajo, como la tinción inmunofluorescente tanto intra- como extracelular marcadores, así como proteínas de matriz extracelular depositadas. Además, los análisis transcripcionales por qPCR, citometría de flujo e invasión celular se pueden estudiar con este modelo. Aquí, describimos un protocolo de un modelo esferoide para evaluar el papel de la integrina de los CAFs n.o 3-1 y su ligando depositado ectopáticamente, laminina-332, en la diferenciación y en el apoyo a la invasión de células cancerosas de páncreas.
Introduction
El microambiente tumoral es un nicho muy complejo y extremadamenteimportante para el mantenimiento y la progresión de las células tumorales 1. Se forma no sólo por las células cancerosas, sino también por los fibroblastos estromales. Las células tumorales están rodeadas por un estroma quees específico y diferente del estroma de los tejidos normales 2. Laminin-332 es una proteína de matriz extracelular expresada ectópicamente en el estroma de diferentes tumores, como el adenocarcinoma pancreático3. Además, la composición bioquímica del ECM y también sus propiedades biofísicas, comola rigidez y la tensión, cambian dentro del tumor a granel 4. Este estroma tumoral, o "estroma reactivo", es causado por una adaptación de fibroblastos a las células cancerosas vecinas y por el reclutamiento de otros actores muy importantes que desarrollan un ambiente favorable y de apoyo para la progresión tumoral. La diferenciación de los fibroblastos estromales da como resultado fibroblastos asociados al cáncer (CAF). Estas células se pueden identificar utilizando diferentes marcadores, como la actina muscular lisa (SMA)5 o el antígeno neural/glial 2 (NG2)6.
Es difícil seleccionar el modelo in vitro más adecuado para recapitular el microambiente tumoral (TME) con CAF. El método para imitar los parámetros fisiológicos del TME de una manera rentable y reproducible debe ser considerado para un sistema modelo de este tipo. Dentro del TME, se producen diferentes procesos, como la proliferación, diferenciación, migración e invasión de los diferentes tipos de células. Estos procesos celulares se pueden realizar individualmente con diferentes métodos. Sin embargo, las condiciones experimentales deben considerar las interacciones celulares con el eCM estroma tumoral, ya que la rigidez del sustrato influye en el proceso de diferenciación CAF. R.G. Wells comentó sobre el impacto de la rigidez de la matriz en el comportamiento celular y destacó que la organización citoesquelética y el estado de diferenciación observados en células cultivadas in vitro podrían ser artefactofactuales7. Diferentes estímulos parecen estar involucrados en la diferenciación CAF, incluyendo la tensión mecánica5,7. Para evitar esto, los sustratos blandos 2D podrían ser posibles enfoques para los estudios de diferenciación, ya que eluden el problema del plástico de la placa de cultivo rígido. Una superficie 2D suave, en la que se pueden cultivar fibroblastos, puede ser geles de poliacrilamida recubiertos de colágeno I, por lo que la rigidez del gel puede ser manipulada por la concentración de poliacrilamida y el retigente de gel. La adhesión y la formación de fibras de tensión ricas enSMA se potencian en fibroblastos junto con la rigidez del gel 8. Estos resultados subrayan la importancia de los andamios de sustrato blando para modelos de diferenciación in vitro más fisiológicas. Sin embargo, en nuestras manos la reproducibilidad experimental y la imagen de estos geles eran un reto. Para superar estas deficiencias, cambiamos el sistema de sustrato suave 2D por un modelo de esferoides 3D para estudios de diferenciación e invasión. Este modelo es más relevante desde el momento clínica y, al igual que un organoide in vitro, recapitulalas interacciones in vivo de células celulares, la producción y deposición de ECM, así como el comportamiento celular 9.
Los esferoides se forman cuando las células carecen de un sustrato al que adherirse. Cuando las células se quedan sin una superficie adhesiva, se agregan para formar una estructura más o menos esférica. Si los esferoides se componen de un tipo de célula, se llaman homoesferoides; si se compone de dos o más tipos de células diferentes que forman heterospheroids.
Entre los diferentes métodos para la preparación de esferoides, realizamos el protocolo utilizando placas de fondo inferior de 96 pocillos no adherentes. Es muy eficaz con respecto a los costes. Aquí, producimos tanto homoesferoides de fibroblastos, CAF o HCA que carecen de la subunidad integrina n.o 3 para examinar el proceso de diferenciación y los heteroesferoides de los CAF o la integrina 3 KO HCA y las células del carcinoma de conductopante (AsPC-I y PANC-I) para estudiar la invasión en la matriz circundante.
El objetivo de estos estudios era utilizar CAF primarios aislados de biopsias de carcinoma pancreático humano. Sin embargo, las biopsias para obtener las células son escasas y por esta razón, los CAC utilizados en estos estudios han sido inmortalizados utilizando lentivirus que contiene HTERT. Se llaman iCIF, y sus homólogos normales, los fibroblastos pancreáticos humanos primarios, se denominan iNF. Los fibroblastos pancreáticos humanos y las células del carcinoma del conducto pancreático, AsPC-I y PANC-I, están disponibles comercialmente.
Este protocolo se utilizó para estudiar el efecto de la interacción laminina-332-integrina en el proceso de diferenciación CAF. Para probar la especificidad de esta interacción y su función, se utilizaron compuestos inhibidores: BM2, un anticuerpo monoclonal que bloquea el sitio de unión de integrina de la cadena laminina-332 x 310,o lebeina 1, un compuesto derivado del veneno de serpiente que bloquea el integrinas de laminina 3o1, 6o1 y 7o111,12.
Para el ensayo de invasión, las células habían sido transducidas con lentivirus que contenían cDNA codificando mCherry (iCIF y integrin a 3 KO iCFÁs) o GFP (AsPC-I y PANC-I) para distinguir los diferentes tipos de células en los heteroesferoides. La transducción de las células para inmortalizarlas y/o etiquetarlas con expresión de proteína fluorescente (mCherry y GFP) se describe en un estudio anterior13,que debe ser consultado para más información.
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Protocol
1. Esferoides 3D como modelo in vitro para la diferenciación de fibroblastos/CAF utilizando diferentes compuestos de inhibición de TGF-1 de interacción célula-matriz
- Mezclar 1 parte de la solución de metilcelulosa de 6 mg/ml y 3 partes de los medios de cultivo celular, MEM complementado con 1% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina para obtener la solución de formación de esferoides.
- Resuspender los fibroblastos normales inmortalizados recién desconectados (iNF), CAF inmortalizado (iCOF) o integrin a 3o KO iCAF (paso hasta 25) en la solución de formación de esferoides. Si prepara una placa de 96 pozos, prepare un exceso de solución de formación de esferoides, 10 ml y agregue 75.000 células, teniendo en cuenta que cada esferoide está compuesto por 750 células, y que se distribuyen 100 ml por cada pocil de la placa.
- Si las citoquinas o inhibidores de la integrina están incluidos en el estudio, agregue estos compuestos a la suspensión celular, con el fin de incrustarlos en los esferoides durante su formación. Tenga en cuenta que los iNF se estimulan con 10 ng/ml de TGF-1 para desencadenar la diferenciación. Cuando proceda, añada los compuestos inhibidores junto con el TGF-1, como 20 g/ml BM2 o 10 g/ml de lebeína 1.
- Preparar los homoesferoides CAF de la misma manera pero sin el estímulo TGF--1, ya que ya están diferenciados. Preparar los homospheroides de capero sin adición de ningún compuesto.
- Distribuya la solución de formación de esferoides en una placa de 96 pocillos de fondo redondo añadiendo 100 ml de la solución en cada pocal. Cada vez que la solución de esferoides se distribuye en los pozos, mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo, varias veces.
- Coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas para permitir que se forme un esferoide en cada pocal.
- Recoger los esferoides después de aproximadamente 24 h y utilizarlos para diferentes propósitos aguas abajo: tinción inmunofluorescente, en tiempo real (RT) q-PCR y citometría de flujo. Para detectar la expresión de antígenos intra y extracelulares, incluida la deposición de proteínas ECM dentro del esferoide, utilice la tinción inmunofluorescente. Después de la desintegración de los esferoides en células individuales, cuantificar el receptor anclado por membrana por citometría de flujo. Para detectar la activación genética y los cambios transcripcionales, utilice RT q-PCR de ARNm aislado de las células esferoides.
2. Tinción inmunofluorescente de esferoides
- Recoger los esferoides después de unas 24 horas en un tubo de reacción de 1,5 ml por condición experimental o por proteína a analizar. Por ejemplo, coloque los esferoides de los iNF estimulados con TGF-1 en un tubo diferente de los iNF de control, que no fueron tratados. Para evitar la rotura de esferoides debido a fuerzas de cizallamiento demasiado fuertes, corte el extremo de la punta de la pipeta para agrandar el orificio. Incluir al menos 5-10 esferoides en un tubo de reacción, para permitir réplicas y tener en cuenta las posibles pérdidas durante los pasos de lavado.
- Centrifugar los esferoides con una centrífuga de sobremesa durante unos 30-60 s a 1.000 x g. Retire cuidadosamente el sobrenadante que contiene metilcelulosa pipeteando, sin perturbar los esferoides peletizares.
- Lavar con 50 s de 1x PBS. Repita el paso de centrifugación y retire cuidadosamente el PBS pipeteando, como se describe en 2.2.
- Dependiendo de la proteína a teñir, fijar con 50 éL de 4% de paraformaldehído en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente (para las subunidades de laminina- 3oC, NG2 e integrina n.o 3o1) o con 50 ml de metanol durante 10 min a -20 oC (para las subunidades laminina-332).
- Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3.
- Permeabilizar las células con 0.1% Triton-X en PBS durante 4 min a temperatura ambiente.
- Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3 tres veces.
- Incubar los esferoides en PBS que contienen 5% DE FBS y 2% de BSA, durante 1 h a RT para bloquear sitios de interacción proteica no específicos.
- Incubar los esferoides con 30 oC de anticuerpos primarios en PBS, 2,5% FBS y 1% de BSA a 4oC durante la noche. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-SMA Cy-3 conjugado y anti-NG2 a 5 g/ml; BM2 anti-laminin a 3, 6F12 anti-laminin a 3 y anti-laminin a 2 20 g/ml.
- Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3 tres veces.
- Incubar los esferoides con 30 l de anticuerpos secundarios en PBS, 2,5% FBS y 1% BSA a RT durante 90 min. Los siguientes anticuerpos secundarios utilizados fueron: Alexa 488 anticonejo y antiratón (5 g/ml).
- Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3 tres veces.
- Incubar las células con 30 ml de solución de tinción DAPI durante 4 minutos a temperatura ambiente.
- Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3.
- Coloque los esferoides en un portaobjetos de vidrio, en una gota de PBS, usando un pipeta Pasteur de vidrio.
- Imagen de los esferoides mediante microscopía de fluorescencia en un microscopio de escaneo láser utilizando un aumento de 10x. Tome diferentes secciones transversales ópticas del esferoide en diferentes planos ópticos de una pila z (15-20 planos de pila). Para establecer la configuración del láser en el microscopio, utilice un esferoide compuesto de células negativas para el antígeno de interés o un esferoide manchado sólo con el anticuerpo secundario. Reutilice la misma configuración para todos los ejemplos que se compararán.
- Analice las imágenes microscópicas con el software ImageJ tal como se publicó anteriormente14. Los pasos se resumen en la Figura suplementaria 1. Como fondo, determine la densidad de señal integrada de una región de interés (ROI) libre de células. Calcule el total de fluorescencia celular corregida (TCCF) como:
- Determinar la fluorescencia total corregida (TCF) de los esferoides como el TCCF normalizado al área de esferoide y el número de pilas.
3. RT q-PCR de homoesferoides
- Para realizar RT-qPCR, recoja al menos 288 esferoides (correspondientes a tres placas de 96 pocillos) en un tubo de reacción de 50 ml. Centrifugar durante 5 min a 1.000 x g y eliminar cuidadosamente el sobrenadante que contiene metilcelulosa pipeteando sin molestar a los esferoides peletizados.
- Lavar con 1 ml de 1x PBS y transferir los esferoides a un tubo de reacción de 1,5 ml. Centrifugar los esferoides con una centrífuga de sobremesa durante unos 30-60 s a 1.000 x g. Retire cuidadosamente el PBS pipeteando, sin molestar a los esferoides peletizaron.
- Disociar los esferoides con 250 oL de colagenasa B de 4 mg/ml, 50 g/ml de DNase I, 2% de BSA, 1 mM de CaCl2 en PBS a 37 oC durante unos 30-45 minutos vórtice suavemente y pulsando intermitentemente durante unos segundos cada 5 minutos.
- Repita el paso de lavado como se explica en el paso 3.2.
- Aísle el ARN total de las células de los esferoides desintegrados utilizando un kit de aislamiento de ARN comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Reverse transcribe el ARNm aislado en ADNc con un kit comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Cuantifique los niveles de transcripción en réplicas por PCR en tiempo real. Los imprimadores utilizados fueron: -SMA: Fw 5o-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3o, Rev 5o ACAGAGTATTTGCGCCCGAA-3o15; Cadena Laminin n.o 3: Fw 5o-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3o, Rev 5o-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3o16; Cadena Laminin n.o 3: Fw 5o-GGCAGATGATTAGCAGCCGAGGA-3o Rev 5o-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGT-3o17; Cadena Laminin n.o 2: Fw 5o-GATGGCATTCCTGCGAGAAG-3'Rev 5'-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3' 16; NG2: Fw 5o-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3'Rev 5'-TTGGCTTTTGACCCTGACTATG-3'18; integrin 3 subunidad: Fw 5'-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3'19; TOP-1: Fw 5o-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3o Rev 5o-GTCCAGG-GCTCTATCTTGAA-3o20.
- Corrija los valores ct para el valor Ct de un gen de referencia endógeno como TOP-1 utilizando la ecuación: 2- . •Ct (muestra de objetivo) – Ct (muestra de referencia) y Ct de gen objetivo o gen de referencia – TOP-I.
4. Análisis de citometría de flujo de la expresión de integrina
- Para el análisis citométrico de flujo, recoja al menos 288 esferoides (correspondientes a tres placas de 96 pocillos) en un tubo de reacción de 50 ml. Centrifugar durante 5 min a 1.000 x g y eliminar cuidadosamente el sobrenadante que contiene metilcelulosa pipeteando.
- Lavar con 1 ml de 1x PBS y transferir los esferoides a un tubo de reacción de 1,5 ml. Repita el paso de centrifugación y retire cuidadosamente el PBS pipeteando.
- Disociar los esferoides como se describe en el paso 3.3.
- Repita el paso de lavado como se explica en el paso 4.2.
- Para bloquear sitios de unión no específicos y evitar la unión de anticuerpos relevantes para la detección a los receptores de Fc -receptores (CD16, CD32 y CD64), incubar las células en 100 ol de PBS que contengan un 2% de suero de caballo (o suero de otra especie animal, cuyos anticuerpos no serán en el experimento) y 0,1% de BSA durante 20 min a 4oC con rotación.
- En caso de tinción de marcadores intracelulares, fijar/permeabilizar las células como se describe en el paso 2.2-2.5.
- Incubar las células con los anticuerpos primarios en 100 ml de PBS que contienen 2% de suero de caballo y 0,1% de BSA durante 30 min a 4 oC con rotación. Diluir el anticuerpo primario a 10 g/ml.
- Lavar con 100 s de PBS + 0,1% de BSA tres veces, con pasos de centrifugación en la centrífuga superior del banco a 1.000 x g en el medio.
- Incubar las células con los anticuerpos secundarios en 100 ml de PBS que contienen 2% de suero de caballo y 0,1% de BSA durante 30 min a 4 oC con rotación. Diluir el anticuerpo secundario a 10 g/ml.
- Repita el paso de lavado como se explica en el paso 4.7.
- Analice 2.0 x 104 células manchadas en un catómetro de flujo. Puerta para células vivas individuales a través de la gráfica de puntos FSC-SSC y analizar la fluorescencia de las células cerradas en el canal apropiado para el fluoróforo seleccionado.
5. Ensayo de invasión con heteroesferoides
- Preparar la solución de formación de esferoides para heteroesferoides, que contiene los diferentes tipos de células y los medios correspondientes, como se resume en la Tabla1. Las células habían sido previamente transducidas con lentivirus que contenían vectores para la expresión mCherry o GFP.
- Llenar 100 l de la solución de formación de esferoides en cada pocal de la placa e incubar la placa en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas para permitir que se forme un esferoide en cada poca.
- Preparar 60 ml de mezcla de matriz gelatinosa que contenga 2 mg/ml de colágeno de cola de rata I, 30% de matriz gelificante comercial y 2,5 g/ml de laminina-332 en un tubo de reacción de 1,5 ml. Distribuir rápidamente 15 l en 3 pozos de la cámara de angiogénesis de deslizamiento. Incruste un esferoide en cada pocal que ya contenga el gel.
- Si es necesario, ajuste rápidamente la ubicación del esferoide al centro del pozo con una pipeta bajo el microscopio.
- Repita los pasos 5.2-5.3 para los siguientes heterospheroides y repita de nuevo para los homoesferoides.
- Incubar los geles en la incubadora durante 1 h para solidificar y, a continuación, superponer suavemente los geles con medio de cultivo celular.
- Imagen de los esferoides mediante microscopía de fluorescencia en un microscopio de escaneo láser. Tome diferentes secciones transversales ópticas del esferoide en diferentes planos ópticos de una pila z y en diferentes puntos de tiempo de invasión (por ejemplo, 0 h, 24 h, 48 h y 72 h).
- Analice las imágenes contando el número de células cancerosas invasoras. Las células invasoras son las que han salido del esferoide y han entrado en el área invasora. El área invasora se define como el área del anillo entre los perímetros exterior e interior dados por la célula invadida más leal y por el borde esferoide del esferoide al comienzo de los experimentos de invasión, respectivamente, como se describe en la Figura Suplementaria 2 .
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Representative Results
Los resultados de este diseño experimental se publican en Martins Cavaco et al.13, que se recomienda para una lectura posterior sobre las conclusiones que se extrajeron de estos experimentos.
Figura 1, una imagen representativa de un esferoide inmunofluorescente, muestra la inmunomancha de la subunidad integrina n.o 3 tanto de los fibroblastos normales inmortalizados como de los HCA inmortalizados (Figura1A),así como de la inmunofluorescencia cuantificación(Figura 1B) y los niveles de transcripción del gen de la subunidad integrina 3 por qPCR (Figura1C). Este panel de resultados demuestra que la integrina n.o 3 está regulada en iCOF, en comparación con la contraparte normal. Esto demostró que la integrina n.o 3-1 puede considerarse un marcador para la diferenciación de fibroblastos pancreáticos. Esto también fue demostrado por los estudios de citometría de flujo13.
Figura 1. Expresión de la subunidad de integrina n.o 3 por iNF e iCIF. La subunidad integrina 3 está regulada por iCOF, lo que refleja su potencial como marcador de diferenciación para los HCA pancreáticos. (A) La tinción inmunofluorescente de los homospheroides de fibroblastos pancreáticos normales (iNFS) en comparación con los homospheroides del iCAF muestra una mayor señal de la subunidad integrina n.o 3 en las células diferenciadas. (B) La señal de fluorescencia de las células en el esferoide se cuantificó con las imágenes de la pila Z del esferoide 3D, utilizando el software ImageJ. Medios: se muestran y se comparan con el SEM de tres experimentos independientes (*, p < 0,1). (C) Las células obtenidas de los esferoides disociados fueron analizadas para sus niveles transcripcionales de la subunidad de integrina n.o 3. Medios: SEM de valores de ct a medida que se muestran los cambios de plegado de dos experimentos independientes y se comparan mediante la prueba t. Aunque no alcanzan el nivel de significancia de 0.1, los niveles de transcripción de mRNA de codificación de integrina 3 son más altos en iCOF que en iNF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Heterospheroides | ||
| Tipo de celdas (paso de hasta 25) | Número de células | Medio (1 parte metilcelulosa +...) |
| mCherry-iCAFs + GFP-AsPC-I | 400 CAF + 400 células cancerosas de páncreas | 1,5 partes de la célula MEM con 10% de FBS y 1% pluma / estreptococo + 1,5 partes de RPMI con 10% de FBS y 1% pluma / estreptococo |
| mCherry-3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I | ||
| mCherry-iCAFs + GFP-PANC-I | 1,5 partes de la célula MEM con 10% de FBS y 1% pluma / estreptococo + 1,5 partes de DMEM con 10% de FBS y 1% pluma / estreptococo | |
| mCherry-3KO-iCAFs + GFP-PANC-I | ||
| Homoesferoides | ||
| Tipo de celda (paso de hasta 25) | Número de células | Medio (1 parte metilcelulosa +...) |
| mCherry-iCAFs | 400 células | 3 partes MEM complementado con 10% de FBS y 1% pluma/estreptococo |
| mCherry-3KO-iAFs | ||
| GFP-AsPC-I | 3 partes rpmI con 10% de FBS y 1% pluma / estreptococo | |
| GFP-PANC-I | 3 partes de DMEM con 10% de FBS y 1% pluma/estreptococo | |
Tabla 1. Composición celular de hetero- y homoesferoides. El número de células necesarias para ensamblar los heteroesferoides y los homoesferoides, así como el medio correspondiente que se debe utilizar para la solución de formación de esferoides se resumen en la siguiente tabla.
Figura suplementaria 1. Pasos secuenciales para la cuantificación de la tinción inmunofluorescente de una proteína de interés en esferoides, utilizando ImageJ. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 2. Pasos secuenciales para la cuantificación del número de células cancerosas invasoras en el ensayo de invasión, utilizando ImageJ. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Desarrollar un modelo in vitro adecuado para estudiar la diferenciación CAF es una tarea difícil. Después de emplear diferentes enfoques, llegamos a la conclusión de que un modelo de esferoides 3D es el modelo más práctico, fisiológico y clínicamente relevante, en el que se puede estudiar la interacción entre células de carcinoma pancreático con CAF inmortalizados. Este modelo previno la diferenciación espontánea de fibroblastos, debido a factores de estrés artefactosfásicos como la rigidez del plástico de cultivo celular, al menos en condiciones de cultivo a corto plazo (hasta 48 h). Aunque no se midió la rigidez exacta del esferoide utilizado en estos estudios, Ito et al. evaluaron la rigidez de las células endoteliales de venas umbilicales humanas y los heterospheroides de células madre mesenquimales utilizando un chip microfluídico integrado robot22. El índice de rigidez promedio de los heteroesferoides se midió 1 y 3 días después del montaje. El tamaño de los esferoides era diferente, el MSC parecía aumentar su capacidad de agregación, lo que resultó en una disminución en el tamaño con el tiempo (de 135,5 a 99,8 m)21,22. En consecuencia, la rigidez del esferoide también aumentó de 5,0 x 10-3 a 7,5 x 10-3 Pa22. Sin embargo, la rigidez de los esferoides compuestos por una población heterotípica de CAFs y AsPC-I podría poseer propiedades mecánicas y valores de rigidez diferentes de los de los homoesferoides hechos de una sola población de fibroblastos/CAP. Esto todavía es desconocido y podría ser diferente de lo descrito por Ito et al22. La rigidez también depende de la cantidad y la vinculación cruzada de ECM producido y depositado celularmente, de las diferentes interacciones células celulares dentro del esferoide, del número de células dentro del esferoide o de la duración del cultivo.
Como cualquier otro modelo, el diseño experimental implica algunas variables que necesitan optimización como el número de células necesarias para formar los esferoides, los puntos de tiempo del tratamiento y la imagen microscópica. El diseño experimental descrito fue optimizado con el objetivo de tener un tamaño de esferoide, que tendría una influenciamínima en la difusión de nutrientes y oxígeno, ya que existe un límite de difusión debido a las limitaciones de transporte masivo 9. Por ejemplo, el transporte de oxígeno en esferoides con un tamaño superior a 150-200 m se ve significativamente afectado, así como la difusión de glucosa y lactato, en agregados de más de 300 m9,18. Los esferoides con diámetros de más de 400-500 m suelen presentar una estructura concéntrica mente estratificada que consiste en unnúcleo necrótico rodeado por una capa viable de células en reposo y un borde exterior de células proliferantes 9,24. Para evitar la difusión limitada de compuestos, y para eliminar el problema del núcleo esferoide inaccesible, las células fueron tratadas con TGF-1, BM2 y lebeino-1 antes de la formación de esferoides, cuando las células se suspenden individualmente en la solución de formación de esferoides. Por otra parte, para permitir la disponibilidad de oxígeno y nutrientes a la mayoría de las células en el esferoide y para evitar la formación de un núcleo necrótico, el número de células por esferoide se redujo a 750-1000 células, que forman esferoides con un diámetro de 140-200 m.
Es importante mezclar a fondo los diferentes tipos de células en la solución de formación de esferoides, por lo que los esferoides están compuestos por aproximadamente el mismo número de células, evitando diferencias de tamaño significativas entre los esferoides. Sin embargo, a veces algunos esferoides pueden ser ligeramente más grandes que el otro y eso resultará en más pilas Z adquiridas en el microscopio. Algunos esferoides también pueden desviarse de la forma perfectamente esférica, pero esto también se tiene en cuenta cuando se delinea el ROI del esferoide. Estas diferencias de tamaño y forma se contabilizan en los valores de cuantificación normalizados, como se explica en el párrafo siguiente. Otro factor importante con respecto a la forma del esferoide es el tipo de celda. Por ejemplo, los fibroblastos y los CAC forman esferoides con una forma casi esférica, mientras que las células AsPC-I y PANC-I forman un agregado más disperso de las células.
Para la toma de imágenes de los esferoides, también se pueden utilizar criosecciones de esferoides fijos, sin embargo, la integridad del esferoide puede verse comprometida al seccionar, dependiendo del tipo de célula y el protocolo de inmunostaining. Alternativamente, la tinción de todo el esferoide en su estructura 3D, resultó ser una opción más simple. La adquisición de imágenes microscópicas apiladas en Z del esferoide como una estructura 3D toma en promedio 5-15 minutos por esferoide.
Las señales inmunofluorescentes en imágenes de esferoides son difíciles de cuantificar ya que representan planos de estructuras 3D. El método utilizado se basó en uno descrito anteriormente, donde los autores extrapolaron y consideraron que el esferoide era una celda14. De esta manera, la señal de fluorescencia se corrige utilizando la Ecuación 1.
Como fondo, se determinó la densidad de señal integrada de una región de interés (ROI) libre de células. La densidad de señal integrada medida es la suma de los valores de intensidad de los píxeles dentro del ROI seleccionado. Dado que los esferoides son estructuras 3D, se adquieren imágenes confocales de diferentes pilas. Para procesar este tipo de imágenes se puede medir la señal fluorescente en cada pila individualmente o utilizar la suma de todas las pilas en una proyección Z. Todas las cuantificaciones se pueden realizar utilizando ImageJ. La fluorescencia total corregida (TCF) de los esferoides se determina como el TCCF normalizado, teniendo en cuenta el área de esferoides y el número de pilas, utilizando la Ecuación2. Esto explica los diferentes tamaños de los esferoides y la discrepancia en la forma esférica. El análisis de la tinción inmunofluorescente de los esferoides utilizando este método puede tardar hasta 5 minutos por esferoide.
Del mismo modo, la invasión de células de esferoides en la matriz estromal circundante puede ser analizada por diferentes algoritmos. Un método sencillo fue descrito previamente por Nowicki et al, en el que las células cancerosas invasivas se contaron23. Con el fin de discriminar las células invasoras de las que no invaden, es importante establecer un límite espacial más allá del cual se considera que las células han dejado la estructura esferoide. Por lo tanto, el punto de partida es el límite que corresponde al perímetro de las imágenes esferoides adquiridas en el punto de tiempo inicial (tiempo 0), cuando los esferoides estaban incrustados en el gel. La célula que invade el gel más leal se considera la distancia máxima que una célula invasora puede alcanzar, y por lo tanto, define el borde exterior de la región de invasión. Este método cuenta las células cancerosas invasivas que están presentes en el área invasora, utilizando la herramienta de recuento de ImageJ, y el ROI correspondiente al esferoide en el momento 0 h se agrega al gestor de ROI y luego se transpone a la imagen del mismo esferoide exacto adquirido 48 h o 72 h más tarde. Por esta razón, es importante que el esferoide permanezca lo más cerca posible del centro de los planos, durante los diferentes tiempos de adquisición. Contando el número de células puede tomar hasta 5 minutos por esferoide.
Otra consideración importante es distinguir los diferentes tipos de células en el heteroesferoide. Esto se puede realizar utilizando colorantes fluorescentes de células vivas, que pueden ser problemáticos cuando el tipo de celda tiene una alta tasa de división celular o si el experimento se va a realizar durante largos períodos de tiempo. La forma más robusta y confiable de distinguir las dos poblaciones diferentes es desarrollar líneas celulares que expresen proteínas fluorescentes como mCherry y GFP. La entrega de los vectores de expresión se puede realizar utilizando lentivirus, lo que resulta en una expresión estable de estas proteínas.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses. Este material refleja únicamente las opiniones del autor y la Unión Europea no se hace responsable de ningún uso que pueda hacerse de la información contenida en el mismo.
Acknowledgments
Reconocemos la ayuda de Barbara Schedding en la preparación del BM2 y el lebein-1. Reconocemos a Gnes Noel por compartir su experiencia en ensayos esferoides. Agradecemos a Sonja Schelhaas y Michael Sch-fers por su ayuda en el manejo de la transfección lentiviral bajo condiciones S2. Reconocemos la asistencia de Sabine von R-den en la preparación de los CAF a partir del tejido de cáncer de páncreas.
La investigación que ha llevado a estos resultados ha recibido financiación del Programa de Personas (Marie Curie Actions) del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Unión Europea/ en virtud del acuerdo de subvención rea (316610) a J.A.E. Además, J.A.E. y A.C.M.C. contaron con el apoyo financiero de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro del Clúster de Excelencia de Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Este proyecto también fue apoyado por Wilhelm Sander Stiftung (subvención: 2016.113.1 a J.A.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
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