Summary
이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.
Abstract
시험관 내 연구에 대한 이상적인 모델을 정의하는 것은 필수적입니다, 세포의 분화와 같은 생리적 과정을 공부하는 경우 주로. 종양 기질에서, 호스트 섬유아세포는 분화하기 위하여 암세포에 의해 자극됩니다. 따라서, 그(것)들은 종양 미세 환경에 기여하고 종양 진행을 지원하는 표현형을 취득합니다. 스페로이드 모델을 사용하여, 우리는 이러한 3D 체외 모델 시스템을 설정하여, 우리는 이 분화 과정에서 라미닌-332 및 그 수용체 인테그린 α3β1의 역할을 분석했습니다. 이 스페로이드 모델 시스템은 종양 미세 환경 조건을 보다 정확한 방식으로 재현할 뿐만 아니라 세포 내 및 세포 외의 면역 형광 염색과 같은 다양한 다운스트림 연구를 허용하기 때문에 매우 다재다능한 모델입니다. 마커뿐만 아니라 퇴적 된 세포 외 매트릭스 단백질. 더욱이, qPCR에 의한 전사 분석, 유세포 분석 및 세포 침입은 이 모델로 연구될 수 있다. 여기서, 우리는 CAFs의 인테그린 α3β1 및 그 ectopically 증착 리간드, 라미닌-332의 역할을 평가하기 위한 스페로이드 모델의 프로토콜을 분화하고 췌장암 세포의 침입을 지원하는 것을 기술한다.
Introduction
종양 미세 환경은 매우 복잡한 틈새 시장이며 종양 세포의 유지및 진행에 매우 중요합니다 1. 그것은 암세포뿐만 아니라 기질 섬유 아세포에 의해 형성됩니다. 종양 세포는 정상 조직의 기질과 특이적이고 다른 기질로 둘러싸여있습니다2. 라미닌-332는 췌장 선암종3과같은 상이한 종양의 기질에서 ectopically 발현되는 세포외 기질 단백질이다. 더욱이, ECM의 생화학적 조성물은 또한 그 생물학적 특성, 예: 강성 및 장력, 종양 벌크 내의 변화4. 이 종양 기질, 또는 "반응성 기질"은 인접한 암세포에 섬유아세포의 적응과 종양 진행을 위한 유리하고 지지적인 환경을 개발하는 그밖 아주 중요한 선수의 모집에 기인합니다. 기질 섬유아세포의 분화는 암 관련 섬유아세포 (CAF)를 초래합니다. 이들 세포는 α-평활근 액틴(αSMA)5 또는 신경/신경교항원 2(NG2)6과 같은 상이한 마커를 사용하여 식별될 수 있다.
CAFs를 사용하여 종양 미세환경(TME)을 재량화하는 데 가장 적합한 시험관내 모델은 선택하기 어렵다. 이러한 모델 시스템에 대해 비용 효율적이고 재현 가능한 방식으로 TME의 생리적 파라미터를 모방하는 방법을 고려해야 합니다. TME 내에서, 상이한 세포 모형의 증식, 분화, 이동 및 침략과 같은 다른 프로세스가 생깁니다. 이러한 세포 과정은 다른 방법으로 개별적으로 수행 될 수있다. 그러나, 실험 조건은 종양 기질 ECM과의 세포 상호 작용을 고려해야 합니다, 지층의 강성은 CAF 분화 과정에 영향을 미치기 때문에. R.G. Wells는 세포 행동에 대한 매트릭스 강성의 영향에 대해 논평하고 시험관 내 배양 세포에서 관찰된 세포골격조직 및 분화 상태가 artefactual 7일 수 있음을 강조했다. 다른 자극은 기계적 장력5,7을포함하여 CAF 분화에 관여하는 것 같습니다. 이를 피하기 위해 2D 연질 기판은 경직된 배양 접시 플라스틱의 문제를 우회하기 때문에 분화 연구를 위한 가능한 접근법이 될 수 있습니다. 섬유 아세포가 성장 할 수있는 부드러운 2D 표면은 콜라겐 - I 코팅 폴리 아크릴 아미드 젤일 수 있으며, 이에 따라 젤 강성은 폴리 아크릴 아미드 및 젤 크로스 링커의 농도에 의해 조작 될 수 있습니다. αSMA가 풍부한 스트레스 섬유의 접착력 및 형성은 겔 강성과 함께섬유아세포에서 강화된다 8. 이러한 결과는 더 많은 생리적 체외 분화 모델에 대한 부드러운 기판 스캐폴드의 중요성을 강조한다. 그러나, 우리의 손에 이 젤의 실험적인 재현성 그리고 화상 진찰은 도전적이었습니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 차별화 및 침입 연구를 위한 3D 스페로이드 모델을 위한 2D 소프트 기판 시스템을 변경했습니다. 이 모델은 보다 임상적으로 관련성이 있고, 생체외 오르가노이드와 유사하게, 생체 내 세포-세포 상호작용, ECM 생산 및 증착, 세포 행동 뿐만 아니라 재류도있다9.
스페로이드는 세포가 부착하는 기질이 부족할 때 형성됩니다. 세포가 접착제 표면없이 남아있을 때, 그들은 더 많거나 적은 구형 구조를 형성하기 위해 집계. 스페로이드가 한 가지 유형의 세포로 구성되어 있다면 호모스페로이드라고합니다. 2 개 이상의 다른 세포 유형으로 구성 하는 경우 그들은 헤 테 로스 페로이드를 형성.
스페로이드 제제를 위한 상이한 방법 들 중, 우리는 비부착 원형 바닥 96 웰 플레이트를 사용하여 프로토콜을 수행한다. 그것은 비용에 관하여 매우 효과적입니다. 여기서, 우리는 침략을 연구하기 위하여 섬유아세포, CAF 또는 CAF의 호모스페로이드를 둘 다 생성합니다. 주변 매트릭스로 들어갑니다.
이 연구 결과를 위한 목표는 인간 적인 췌장 암종 생검에서 격리된 1 차적인 CAFs를 이용하기 위한 것이었습니다. 그러나, 세포를 장악하기 위하여 생검은 부족하고 이 이유로, 이 연구 결과에서 사용된 CAFs는 HTERT를 포함하는 lentivirus를 사용하여 불멸되었습니다. 그(것)들은 iCAFs에게 불리고, 그들의 일반적인 대응, 1 차적인 인간 췌장 섬유아세포는, iNFs에게 불립니다. 인간 췌장 섬유아세포 및 췌장 덕트 암종 세포인 AsPC-I 및 PANC-I는 시판되고 있다.
이 프로토콜은 CAF 분화 과정에서 라미닌-332-인테그린 상호작용의 효과를 연구하는데 사용되었다. 이러한 상호작용과 그 기능의 특이성을 증명하기 위해, 억제제 화합물이 사용되었다: BM2, 인테그린 결합 부위를 차단하는 단일클론 항체는 라미닌-332 α3사슬(10)또는 레빈 1, 뱀 독 유래 화합물을 차단하는 라미닌 결합 인테그린 α3β1, α6β1 및 α7β111,12.
침략 분석의 경우, 세포는 이종세포에서 상이한 세포 유형을 구별하기 위해 mCherry(iCAF및 인테그린 α3 KO iCAF) 또는 GFP(AsPC-I 및 PANC-I)를 코딩하는 cDNA를 포함하는 렌티바이러스로 트랜스사이링되었다. 그(것)들을 불멸화하고 형광 성 단백질 (mCherry 및 GFP) 식으로 그(것)들을 표지하기 위하여 세포의 transduction는 추가 정보를 위해 상담되어야 하는 이전 연구13에서기술됩니다.
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Protocol
1. 세포 매트릭스 상호 작용의 다른 TGF-β1 억제 화합물을 사용하여 섬유아세포/CAF 분화를 위한 시험관내 모델로서 3D 스페로이드
- 6 mg/mL 메틸셀룰로오스 용액 1부와 세포 배양 배지 3부분, MEM을 1%의 열불활성화 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충하여 스페로이드 형성 용액을 얻습니다.
- 새로 해동된 불멸의 정상 섬유아세포(iNFs), 불멸화된 CAF(iCAFs) 또는 인테그린 α3β1 KO iCAF(최대 25항) 를 스페로이드 형성 용액에 재혼한다. 하나의 96 웰 플레이트를 준비하는 경우, 과량의 스페로이드 형성 용액, 10 mL을 준비하고 75,000 세포를 추가하고 각 스페로이드가 750 개의 세포로 구성되고 플레이트의 각 웰당 100 μL이 분포된다는 것을 명심하십시오.
- 사이토카인 또는 인테그린 억제제가 연구에 포함되어 있는 경우, 이러한 화합물을 세포 현탁액에 추가하여 형성 중에 스페로이드에 포함시킵니다. iNFs는 분화를 유발하기 위해 TGF-β1의 10 ng/mL로 자극됩니다. 적절한 경우, 20 μg/mL BM2 또는 레빈 1의 10 μg/mL과 같은 TGF-β1과 함께 억제제 화합물을 추가하십시오.
- 이미 분화되어 있기 때문에 TGF-β1 자극없이 동일한 방법으로 CAF 호모스페로이드를 준비합니다. 어떠한 화합물도 첨가하지 않고 인테그린 α3 KO CAF 호모스페로이드를 준비한다.
- 각 웰에 용액의 100 μL을 첨가하여 둥근 바닥 96 멀티 웰 플레이트에 스페로이드 형성 용액을 분배한다. 스페로이드 용액이 우물에 분포 될 때마다, 위아래로 파이펫팅하여 잘 혼합, 여러 번.
- 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 24시간 동안 배치하여 각각의 우물에서 하나의 스페로이드가 형성될 수 있도록 한다.
- 약 24 시간 후에 구형체를 수집하고 다른 하류 목적을 위해 그들을 사용합니다 : 면역 형광 염색, 실시간 (RT) q-PCR 및 유세포 분석. 스페로이드 내의 ECM 단백질의 침착을 포함하여 세포 내 및 세포 외 항원의 발현을 검출하려면 면역 형광 염색을 사용하십시오. 단일 세포로 스페로이드가 분해 된 후 유세포 측정에 의해 막 고정 수용체를 정량화하십시오. 유전자 활성화 및 전사 변화를 검출하려면, spheroid 세포로부터 분리된 mRNA의 RT q-PCR를 사용한다.
2. 구형의 면역 형광 염색
- 약 24시간 후에 실험 조건당 또는 단백질당 1.5 mL 반응 튜브로 분석할 수 있는 스페로이드를 수집한다. 예를 들어, TGF-β1로 자극된 iNFs의 스페로이드를 대조군 iNFs와 다른 튜브에 놓고, 이는 처리되지 않았다. 너무 강한 전단력으로 인해 스페로이드의 파열을 방지하려면 오리피스를 확대하기 위해 파이펫 팁의 끝을 잘라. 한 반응 튜브에 적어도 5-10개의 스페로이드를 포함시키고, 복제를 허용하고 세척 단계 동안 가능한 손실을 고려한다.
- 1,000 x g에서 약 30-60s에 대한 벤치 상단 원심 분리기와 스페로이드를 원심 분리기. 펠릿 된 스페로이드를 방해하지 않고 피펫팅으로 메틸 셀룰로오스 함유 상월제물질을 조심스럽게 제거하십시오.
- 1x PBS의 50 μL로 씻으소서. 원심 분리 단계를 반복하고 2.2에 설명된 대로 파이펫팅을 통해 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
- 염색할 단백질에 따라 PBS에서 4% 파라포름알데히드의 50 μL을 실온(αSMA, NG2 및 인테그린 α3β1의 경우) 또는 -20°C에서 10분 동안 50 μL의 메탄올로 고정합니다(라미닌-332 하위 유닛의 경우).
- 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
- 실온에서 4 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 -X로 세포를 투과시.
- 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 세 번 반복합니다.
- 5% FBS 및 2% BSA를 함유하는 PBS에서 스페로이드를 인큐베이션하고, RT에서 1시간 동안 비특이적 단백질 상호작용 부위를 차단한다.
- PBS에서 1차 항체의 30 μL, 2.5% FBS 및 1% BSA를 밤새 4°C에서 배양한다. 다음과 같은 1차 항체가 사용되었다: 5 μg/mL에서 항αSMA Cy-3 공액 및 항NG2; BM2 항 라미닌 α3, 6F12 항 라미닌 β3 및 항 라미닌 γ2 20 μg/mL.
- 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 세 번 반복합니다.
- PBS에서 30 μL의 이차 항체, 2.5% FBS 및 90 분 동안 RT에서 1 % BSA로 스페로이드를 배양합니다. 사용된 다음이두번째 항체는: 알렉사 488 항토끼 및 항마우스(5 μg/mL)였다.
- 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 세 번 반복합니다.
- 실온에서 4분 동안 30 μL의 DAPI 염색 용액으로 세포를 배양합니다.
- 2.2-2.3단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PS 한 방울에 유리 슬라이드에 스페로이드를 놓습니다.
- 10배배의 배율을 사용하여 레이저 스캐닝 현미경으로 형광 현미경으로 스페로이드를 이미지화한다. z 스택 (15-20 스택 평면)의 다른 광학 평면에서 스페로이드의 다른 광학 단면을 가져 가라. 현미경에서 레이저 설정을 확립하려면 관심 있는 항원 또는 이차 항체로만 염색된 스페로이드에 대해 음성세포로 구성된 스페로이드를 사용한다. 비교할 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 다시 사용합니다.
- 이전에 게시 된 ImageJ 소프트웨어로 현미경 이미지를 분석14. 단계는 추가 그림1에 요약되어 있습니다. 배경으로서, 관심 있는 무세포 영역(ROI)의 통합 신호 밀도를 결정한다. 총 교정 된 세포 형광 (TCCF)을 다음과 같이 계산하십시오.
- TCCF가 스페로이드 영역과 스택 수로 정규화됨에 따라 스페로이드의 총 보정형형형형(TCF)을 결정합니다.
3. 호모 스페로이드의 RT Q-PCR
- RT-qPCR을 수행하려면 적어도 288개의 스페로이드(3개의 96웰 플레이트에 해당)를 50 mL 반응 튜브에 수집합니다. 1,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 조심스럽게 펠릿 스페로이드를 방해하지 않고 피펫팅하여 메틸 셀룰로오스 함유 상급물질을 제거하십시오.
- 1 x PBS의 1 mL로 세척하고 1.5 mL 반응 튜브에 스페로이드를 전송합니다. 1,000 x g에서 약 30-60s에 대한 벤치 상단 원심 분리기와 스페로이드를 원심 분리기. 펠릿 스페로이드를 방해하지 않고 피펫팅하여 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.
- 스페로이드를 4 mg/mL 콜라게나아제 B, 50 μg/mL DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl2로 37°C에서 약 30-45분 동안 약 30-45분 동안 부드럽게 소용돌이치고 맥동하여 5분마다 간헐적으로 분리하여 분리합니다.
- 3.2단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 상업용 RNA 절연 키트를 사용하여 분해된 스페로이드 세포로부터 총 RNA를 분리합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 절연 된 mRNA를 상용 키트로 cDNA로 반전시됩니다.
- 실시간 PCR에 의해 복제된 전사 수준을 정량화합니다. 사용 된 프라이머는 이었다: α-SMA: Fw 5′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3′, 레브 5′ ACAGAGTATTTTTGCGCCCGAA-3′15; 라미닌 α3 체인: Fw 5′-GCTCAGCTGTGTTTGA-3′, 레브 5′-TGTCTGCCTGCGC-3′16; 라미닌 β3 체인: Fw 5′-GGCAGATGATTAGAGAGGAA-3′ 레브 5′-CGGACCTGCTGGAGGAGGTGT-3′17; 라미닌 γ2 체인: Fw 5′-GATGGCATTCACTGCAG-3′ 레브 5′-TCGAGCACTAAGAGATGG-3′ 16; NG2: Fw 5′-CTGCAGGTCTTGTGGCA-3′ 레브 5′-TTGGCTTTTTTTGACCCTGACTATG-3′18; 인테그린 α3 소단위: Fw 5'-AGGGGACCTTCAGGGCA-3' 레브 5'-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3'19; TOP-1: Fw 5′-CCAGACGAGCTCGGAAC-3′ 레브 5′-GTCCAGGAGGCTCTCTTGAA-3′20.
- 방정식을 사용하여 TOP-1과 같은 내인성 참조 유전자의 Ct 값에 대한 Ct 값을 수정합니다: 2- ΔΔCt. ΔΔCt = ΔCt (표적 샘플) – ΔCt (기준 샘플) 및 ΔCt = 표적 유전자 또는 기준 유전자의 Ct – TOP-I.
4. 인테그린 발현의 유세포분석
- 유세포 분석의 경우, 적어도 288개의 스페로이드(3개의 96웰 플레이트에 해당)를 50 mL 반응 튜브로 수집합니다. 1,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 조심스럽게 피펫팅하여 메틸 셀룰로오스 함유 상급물질을 제거하십시오.
- 1 x PBS의 1 mL로 세척하고 1.5 mL 반응 튜브에 스페로이드를 전송합니다. 원심 분리 단계를 반복하고 파이펫팅을 통해 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
- 3.3단계에서 기재된 바와 같이 스페로이드를 해리한다.
- 4.2단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
- 비특이적 결합 부위를 차단하고 Fcγ 수용체(CD16, CD32 및 CD64)에 대한 검출 관련 항체의 결합을 방지하기 위해 2% 말 혈청(또는 다른 동물 종의 혈청)을 함유하는 PBS의 100 μL에서 세포를 배양하는 항체는 실험에 사용) 및 0.1% BSA를 4°C에서 20분 동안 회전하였다.
- 세포내 마커를 염색하는 경우, 단계 2.2-2.5에 설명된 대로 세포를 수정/퍼메아빌화합니다.
- 2% 말 혈청 및 0.1% BSA를 함유하는 PBS의 100 μL에서 1차 항체로 세포를 4°C에서 30분 동안 배양하였다. 1차 항체를 10 μg/mL로 희석한다.
- 100 μL의 PBS + 0.1% BSA로 세 번 세척하고, 상단 벤치 원심분리기의 원심분리 단계는 1,000 x g사이입니다.
- 2% 말 혈청 및 0.1% BSA를 함유하는 PBS의 100 μL에서 이차 항체로 세포를 4°C에서 30분 동안 배양하였다. 이차 항체를 10 μg/mL로 희석합니다.
- 4.7단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복합니다.
- 유세포계에서 2.0 x 104 개의 염색 된 세포를 분석하십시오. FSC-SSC 도트 플롯을 통해 단일 라이브 셀에 대한 게이트 및 선택된 형광에 적합한 채널 상에서 게이트된 세포의 형광을 분석한다.
5. 이종스페로이드를 이용한 침략 분석
- 표1에 요약된 바와 같이 상이한 세포 유형 및 대응 배지를 포함하는 헤테로스페로이드용 스페로이드 형성 용액을 준비한다. 세포는 이전에 mCherry 또는 GFP 발현을 위한 벡터를 포함하는 렌티바이러스로 변환되었다.
- 플레이트의 각 웰에서 스페로이드 형성 용액의 100 μL을 채우고 각각의 웰에 하나의 스페로이드가 형성될 수 있도록 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.
- 1.5 mL 반응 튜브에 래트 테일 콜라겐 I 2 mg/mL, 상업용 겔화 매트릭스 의 30%, 라미닌-332의 2.5 μg/mL을 함유하는 젤라틴 매트릭스 혼합물 60 μL을 준비합니다. μ-슬라이드 혈관신생 챔버의 3개의 웰에 15 μL을 신속하게 분배한다. 이미 겔을 함유하고 있는 각 웰에 스페로이드 1개를 포함시다.
- 필요한 경우 현미경으로 피펫을 사용하여 스페로이드의 위치를 우물 의 중심으로 빠르게 조정하십시오.
- 다음 이종에 대해 5.2-5.3 단계를 반복하고 호모스페로이드에 대해 다시 반복하십시오.
- 겔을 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 고형화한 다음, 겔을 세포 배양 배지와 부드럽게 오버레이한다.
- 레이저 스캐닝 현미경으로 형광 현미경으로 구형을 이미지화합니다. z-스택의 상이한 광학 평면과 침략의 다른 시점(예: 0h, 24h, 48h 및 72h)에서 스페로이드의 다른 광학 단면을 취합니다.
- 침입 암세포의 수를 계산하여 이미지를 분석합니다. 침입 세포는 스페로이드를 떠나 침략적인 지역을 입력한 그들입니다. 침략적인 지역은 보충 그림 2에 설명된 대로, 침략 실험의 시작 부분에 있는 가장 먼 침략한 세포및 스페로이드의 스페로이드 경계에 의해 주어진 외부와 내부 둘레 사이 고리 지역으로 정의됩니다, 각각 .
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Representative Results
이 실험 디자인의 결과는 Martins Cavaco 등13에게시되며, 이러한 실험에서 가져온 결론에 대한 추가 읽기를 권장합니다.
도1은 면역형광 스페로이드의 대표적인 이미지로서, 불멸화된 정상 섬유아세포와 불멸의 CAF(그림 1A)의 인테그린 α3소단위의 면역염색뿐만 아니라 면역형광을 나타낸다. 정량화(도1B)및 qPCR에 의한 인테그린 α3 소단위 유전자의 전사 수준(도1C). 이 결과 패널은 인테그린 α3가 iCAF에서 정상 대응에 비해 업 조절된다는 것을 보여줍니다. 이는 인테그린 α3β1이 췌장 섬유아세포 분화를 위한 마커로 간주될 수 있음을 입증하였다. 이것은 또한 유세포 분석 연구13에의해 입증되었습니다.
그림 1. iNF 및 iCaF에 의한 인테그린 α3 소단위의 발현. 인테그린 α3 소단위는 iCAF에 의해 업그레이팅되어 췌장 CAF에 대한 분화 마커로서의 잠재력을 반영합니다. (a) iCAF의 호모스페로이드와 비교하여 정상 췌장섬유아세포(iNFS)의 호모스페로이드의 면역형광 염색은 분화된 세포에서 인테그린 α3 소단위의 증가된 신호를 나타낸다. (b) 스페로이드 내의 세포의 형광 신호를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 3D 스페로이드의 Z-스택 이미지로 정량화하였다. 3개의 독립적인 실험의 ±SEM을 의미하여 t-검정(*, p< 0.1)에 의해 도시되고 비교된다. (C) 해리된 스페로이드로부터 수득된 세포를 인테그린 α3 소단위의 전사 수준에 대해 분석하였다. 두 개의 독립적인 실험에서 배 변화가 t 검정에 의해 도시되고 비교됨에 따라 ΔΔCt-값의 ± SEM을 의미한다. 0.1의 유의 수준에 도달하지 는 않았지만, 인테그린 α3-인코딩 mRNA의 전사 수준은 iNFs보다 iCAFs에서 더 높다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 헤테로스페로이드 | ||
| 세포 유형 (최대 25 항계) | 셀 수 | 중간 (1 부분 메틸 셀룰로오스 +...) |
| mCherry-iCAF + GFP-AsPC-I | 400 CAF + 400 췌장암 세포 | FBS 10% 및 1% 펜/스트렙 + 1,5부분의 RPMI 부품과 10%의 FBS 및 1% 펜/스트렙이 있는 1,5개 부품 셀 MEM |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I | ||
| m체리-아이카프 + GFP-PANC-I | FBS 10%, 펜/스트렙 1,5개 부품, FBS 10%, 펜/스트렙 1%를 갖춘 1,5개 부품 셀 MEM | |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-PANC-I | ||
| 호모스페로이드 | ||
| 셀 타입(통로 최대 25개) | 셀 수 | 중간 (1 부분 메틸 셀룰로오스 +...) |
| m체리 아이카프 | 셀 400개 | FBS 10% 및 펜/스트렙 1%로 보충된 3개 부품 MEM |
| mCherry-α3KO-iCAF | ||
| GFP-AsPC-I | FBS 10%, 펜/스트렙 1%를 가진 3개 부품 RPMI | |
| GFP-PANC-I | FBS 10%, 펜/스트렙 1%를 갖춘 3개 부품 DMEM | |
표 1. 이종 및 호모스페로이드의 세포 조성. 헤테로 및 호모스페로이드를 조립하는 데 필요한 세포의 수뿐만 아니라 스페로이드 형성 용액에 사용해야 하는 상응하는 배지는 다음 표에 요약되어 있다.
추가 그림 1. ImageJ를 사용하여 스페로이드에 관심 있는 단백질의 면역형광 염색을 정량화하기 위한 순차적 단계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 2. 침략 분석에서 침입암세포의 수를 정량화하기 위한 순차적 단계는 ImageJ를 이용하여. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CAF 분화를 연구하기 위한 적절한 시험관내 모델을 개발하는 것은 어려운 과제이다. 다른 접근법을 채택한 후에, 우리는 3D 스페로이드 모형이 불멸의 CA와 췌장 암종 세포 사이 상호 작용을 공부할 수 있는 더 실용적이고 생리적이고 임상적으로 관련있는 모형이다는 것을 결론을 내렸습니다. 이 모델은 적어도 단기 배양 조건 (최대 48 시간)에서 세포 배양 플라스틱의 강성과 같은 artefactual 스트레스로 인해 섬유 아세포의 자발적인 분화를 방지했습니다. 이러한 연구에서 사용된 스페로이드의 정확한 강성은 측정되지 않았지만, 이토 등은 로봇 통합 미세유체 칩(22)을 이용하여 인간 배꼽 정맥 내피 세포 및 중간엽 줄기세포 이종골의 강성을 평가하였다. 이종스페로이드의 평균 강성-지수는 조립 후 1 및 3일 후에 측정되었다. 스페로이드의 크기는 달랐고, MSC는 그들의 응집 용량을 증가시키는 것처럼 보였고, 이는 시간이 지남에 따라 크기(135.5 μm에서 99.8 μm)의 감소로 이어졌으며,21,22. 결과적으로, 스페로이드의 강성도 5.0 x 10-3에서 7.5 x 10-3 Pa22로증가했습니다. 그러나, CAF와 AsPC-I의 이질적인 인구로 구성된 스페로이드의 강성은 섬유 아세포 / CAFs의 단일 인구로 만들어진 호모스 페로이드의 것과 다른 기계적 특성과 강성 값을 소유 할 수 있습니다. 이것은 아직 알려지지 않았으며 Ito et al22에의해 설명 된 것과 다를 수 있습니다. 강성은 또한 세포 생산 및 증착 된 ECM의 양 및 교차 연결, 스페로이드 내의 상이한 세포 세포 상호 작용, 스페로이드 내의 세포 수 또는 배양 기간에 따라 달라집니다.
다른 모델과 마찬가지로, 실험 설계는 구형 을 형성하는 데 필요한 세포의 수, 치료 및 현미경 이미징의 시간 지점과 같은 최적화가 필요한 몇 가지 변수를 포함한다. 기재된 실험 설계는 대량 수송 제한으로 인한 확산 한계가 있기 때문에 영양소와 산소의 확산에 최소한의 영향을 미칠 수 있는 스페로이드크기를 갖는 것을 목표로 최적화되었다 9. 예를 들어, 150-200 μm 보다 큰 크기의 스페로이드에서 산소의 수송은 300 μm9,18보다큰 응집체에서 포도당 및 젖산염의 확산뿐만 아니라 크게 영향을 받습니다. 400-500 μm보다 큰 직경을 가진 스페로이드는 일반적으로 정지 세포의 실행 가능한 층과 증식 세포의 외부 테두리로 둘러싸인 괴사 코어로 구성된동심층 구조를 제시9,24. 화합물의 제한된 확산을 피하고, 접근불가능한 스페로이드 코어의 문제를 제거하기 위해, 세포는 Spheroid 형성 이전에 TGF-β1, BM2 및 레빈-1로 처리하였고, 세포가 스페로이드 형성 용액에서 개별적으로 중단될 때. 더욱이, 스페로이드에 있는 세포의 대부분에 산소와 영양분의 가용성을 허용하고 괴사 코어의 형성을 방지하기 위하여, 스페로이드 당 세포의 수는 140-200 μm의 직경을 가진 스페로이드를 형성하는 750-1000 세포로 감소되었습니다.
스페로이드 형성 용액에서 다른 세포 유형을 철저히 혼합하는 것이 중요합니다, 그래서 스페로이드는 스페로이드 사이의 상당한 크기 차이를 피하고, 세포의 거의 동일한 수로 구성된다. 그럼에도 불구하고, 때때로 몇몇 spheroids는 그밖 보다는 약간 더 클 수 있고 현미경에서 취득된 더 많은 Z 스택 귀착될 것입니다. 일부 스페로이드는 완벽하게 구형 에서 벗어날 수도 있지만, 이것은 또한 스페로이드의 ROI가 묘사 될 때 고려됩니다. 크기와 모양의 이러한 차이는 다음 단락에서 설명한 대로 정규화된 정량화 값에 설명됩니다. 스페로이드의 모양에 관한 또 다른 중요한 요소는 세포 유형입니다. 예를 들면, 섬유아세포와 CA는 거의 구형 양식을 가진 스페로이드를 형성하고, AsPC-I 및 PANC-I 세포는 세포의 더 분산된 집합체를 형성하는 동안.
스페로이드를 이미징하기 위해 고정 된 스페로이드의 저온 절도 사용할 수 있지만 세포 유형 및 면역 염색 프로토콜에 따라 스페로이드의 무결성이 절편시 손상 될 수 있습니다. 또는 3D 구조에서 전체 스페로이드의 염색이 더 간단한 옵션으로 입증되었습니다. 3D 구조로 스페로이드의 현미경 Z 스택 사진을 획득하는 것은 스페로이드 당 평균 5-15 분 걸립니다.
스페로이드 이미지의 면역 형광 신호는 3D 구조의 평면을 나타내기 때문에 정량화하기가 어렵습니다. 사용된 방법은 저자가 세포14로스페로이드를 추정하고 고려한 이전에 설명한 것을 기반으로 하였다. 이러한 방식으로 형광 신호는 수학식1을 사용하여 보정됩니다.
배경으로서, 관심 있는 무세포 영역(ROI)의 통합 신호 밀도가 결정되었다. 측정된 통합 신호 밀도는 선택한 ROI 내의 픽셀의 강도 값의 합계입니다. 스페로이드는 3D 구조이기 때문에 다른 스택의 공초점 이미지가 수집됩니다. 이러한 이미지를 처리하기 위해 각 스택의 형광 신호를 개별적으로 측정하거나 모든 스택의 합계를 Z-프로젝션으로 사용할 수 있습니다. 모든 정량은 ImageJ를 사용하여 수행 될 수있다. 스페로이드의 총 보정형형형형(TCF)은 수학식2를 사용하여 스페로이드의 면적과 스택 수를 고려하여 정규화된 TCCF로 결정된다. 이것은 구형의 다양한 크기와 구형 모양의 불일치를 설명합니다. 이 방법을 사용하여 스페로이드의 면역 형광 염색을 분석하는 데는 스페로이드 당 최대 5 분이 걸릴 수 있습니다.
유사하게, 주위 기질 매트릭스로 스페로이드에서 세포의 침입은 다른 알고리즘에 의해 분석될 수 있습니다. 간단한 방법은 이전에 침략적인 암세포가23를계산된 Nowicki 외에 의해 기술되었습니다. 침략하지 않는 세포로부터 침략적인 세포를 구별하기 위해서는 세포가 스페로이드 구조를 떠난 것으로 간주되는 공간 한계를 설정하는 것이 중요합니다. 따라서, 시작점은 겔 내로 스페로이드가 내장되었을 때 초기 시점(time 0)에서 획득된 스페로이드 이미지의 둘레에 대응하는 한계이다. 겔을 가장 멀리 침입하는 세포는 침습적 세포가 도달할 수 있는 최대 거리로 간주되며, 따라서, 침략 영역의 외측 림을 정의한다. 이 방법은 침입 부위에 존재하는 침습성 암세포를 카운트하고, ImageJ의 카운팅 툴을 이용하여, 0시간 당시스페로이드에 대응하는 ROI가 ROI 관리자에 추가된 후 동일한 정확한 스페로이드 획득 48의 이미지로 전치된다. h 또는 72 시간 나중에. 이러한 이유로, 스페로이드는 획득의 다른 시간 동안, 가능한 한 비행기의 중심에 가깝게 유지하는 것이 중요하다. 세포 수를 계산하면 스페로이드 당 최대 5 분이 걸릴 수 있습니다.
또 다른 중요한 고려 사항은 이종구에서 상이한 세포 유형을 구별하는 것입니다. 이는 세포 유형이 높은 세포 분열 속도를 가지거나 장기간 실험을 수행해야 하는 경우 문제가 될 수 있는 살아있는 세포 형광 염료를 사용하여 수행할 수 있습니다. 두 개의 상이한 인구를 구별하는 더 강력하고 신뢰할 수있는 방법은 mCherry 및 GFP와 같은 형광 단백질을 발현하는 세포주를 개발하는 것입니다. 발현 벡터의 전달은 렌티바이러스를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 이들 단백질의 안정적인 발현을 초래한다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 이 자료는 저자의 견해만을 반영하며 유럽 연합은 그 안에 포함된 정보로 인해 발생할 수 있는 사용에 대해 책임을 지지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 BM2와 lebein-1을 준비하는 바바라 셰딩의 도움을 인정합니다. 우리는 스페로이드 검소에 그녀의 전문 지식을 공유에 대한 Àgnes 노엘을 인정합니다. 우리는 S2 조건하에서 렌티 바이러스 형질 감염을 처리하는 데 도움을 준 소냐 셸하스와 마이클 셰퍼스에게 감사드립니다. 우리는 췌장암 조직에서 CAF를 준비하는 사빈 폰 뤼덴의 도움을 인정합니다.
이러한 결과로 이어지는 연구는 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 FP7 / 2007-2013 / REA 보조금 계약 n ◦ (316610)에 따라 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (마리 퀴리 액션)에서 자금을 받았다 J.A.E. 또한 J.A.E.와 A.C.M.C.는 엑셀인 모션 클러스터(EXC 1003-CiM) 내에서 도이치 포충제마인샤프트(DFG)의 재정적 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 또한 빌헬름 산더 스티퉁 (부여: 2016.113.1 J.A.E.)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
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