Summary
このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。
Abstract
インビトロ研究のための理想的なモデルを定義することは、主に細胞の分化などの生理学的プロセスを研究する場合に不可欠です。腫瘍間質では、宿主線維芽細胞は癌細胞によって刺激され分化する。したがって、それらは腫瘍微小環境に寄与し、腫瘍の進行を支持する表現型を獲得する。このスフェロイドモデルを用いて、このような3Dインビトロモデルシステムを設定し、この分化過程におけるラミニン-332とその受容体インテグリンα3β1の役割を解析した。このスフェロイドモデルシステムは、腫瘍微小環境条件をより正確な方法で再現するだけでなく、細胞内および細胞外の免疫蛍光染色などの異なる下流研究を可能にするので、非常に汎用性の高いモデルです。マーカー、ならびに沈着した細胞外マトリックスタンパク質。さらに、qPCRによる転写解析、フローサイトメトリーおよび細胞侵襲は、このモデルで研究することができる。ここでは、CAFのインテグリンα3β1およびその異位堆積リガンド、ラミニン-332の役割を評価するスフェロイドモデルのプロトコルを、分化および膵臓癌細胞の侵入を支持する。
Introduction
腫瘍微小環境は非常に複雑なニッチであり、腫瘍細胞1の維持および進行にとって非常に重要である。これは、癌細胞だけでなく、間質線維芽細胞によっても形成されます。腫瘍細胞は、正常組織2の間質と特異的かつ異なる間質に囲まれている。ラミニン-332は、膵臓腺癌3のような異なる腫瘍の間質で異なる腫瘍の間質で異なる細胞外マトリックスタンパク質を発現する。また、ECMの生化学的組成物および剛性および張力などの生体的性質も、腫瘍バルク4内で変化する。この腫瘍間質、または「反応性間質」は、隣接する癌細胞への線維芽細胞の適応および腫瘍進行のための有利で支持的な環境を開発する他の非常に重要なプレーヤーの募集によって引き起こされる。間質線維芽細胞の分化は癌関連線維芽細胞(CAF)をもたらす。これらの細胞は、α平滑筋アクチン(αSMA)5または神経/グリア抗原2(NG2)6などの異なるマーカーを用いて同定することができる。
腫瘍微小環境(TME)をCAFで要約するのに最も適したインビトロモデルを選択することは困難である。このようなモデルシステムについては、費用対効果が高く再現可能な方法でTMEの生理的パラメータを模倣する方法を考慮する必要があります。TME内では、異なる細胞タイプの増殖、分化、移行、および侵入などの異なるプロセスが発生します。これらの細胞プロセスは、異なる方法で個別に行うことができる。しかし、実験条件は、下層の剛性がCAF分化プロセスに影響を与えるので、腫瘍間質ECMとの細胞相互作用を考慮しなければならない。R.G.ウェルズは、細胞の行動に対するマトリックス剛性の影響についてコメントし、インビトロ培養細胞で観察された細胞骨格組織および分化状態が動脈実7である可能性があることを強調した。機械的緊張5、7を含むCAFの分化に異なる刺激が関与しているようです。これを回避するために、2D軟質基板は、硬い培養皿プラスチックの問題を回避するので、分化研究のためのアプローチが可能である可能性があります。線維芽細胞を成長させることができる柔らかい2D表面は、コラーゲン-Iコーティングポリアクリルアミドゲルであり、それによってゲル剛性は、ポリアクリルアミドおよびゲル架材の濃度によって操作することができる。αSMAリッチストレス繊維の接着および形成は、ゲル剛性8と共に線維芽細胞において増強される。これらの結果は、より多くの生理的なインビトロ分化モデルのための柔らかい基板足場の重要性を強調する。しかし、私たちの手の中では、これらのゲルの実験的再現性とイメージングは困難でした。これらの欠点を克服するために、分化と侵入研究のための3Dスフェロイドモデル用の2Dソフト基板システムを変更しました。このモデルは、より臨床的に関連し、インビトロオルガノイドと同様に、生体内細胞相互作用、ECM産生および沈着、ならびに細胞挙動9における要約を行う。
スフェロイドは、細胞が付着する基板を欠いているときに形成される。細胞が粘着面なしで放置されると、それらは多かれ少なかれ球状構造を形成するために凝集する。スフェロイドが1種類の細胞で構成されている場合、それらはホモスフェロイドと呼ばれています。2つ以上の異なる細胞タイプで構成される場合、それらはヘテロスフェロイドを形成する。
スフェロイド調製のための異なる方法の中で、我々は非付着ラウンドボトム96ウェルプレートを使用してプロトコルを実行します。コストに関しては非常に効果的です。ここでは、線維芽細胞、CAFまたはCAFの両方のホモスペロイドを生成し、CAFまたはインテグリンα3 KO CAFおよび膵管癌細胞(AsPC-IおよびPANC-I)の分化プロセスとヘテロスペロイドを調べるために、インテグリンα3サブユニットを欠いている。周囲のマトリックスに。
これらの研究の目的は、ヒト膵臓癌生検から単離された一次CAFを使用することにあった。しかしながら、細胞を得るための生検は乏しく、このため、これらの研究で使用されるCAFはHTERTを含むレンチウイルスを用いて不死化されている。それらはiCAFと呼ばれ、その正常な対応する原発性ヒト膵臓線維芽細胞はiNFと呼ばれる。ヒト膵線維芽細胞および膵管癌細胞、AsPC-IおよびPANC-Iが市販されている。
このプロトコルは、CAF分化プロセスにおけるラミニン-332-インテグリン相互作用の効果を研究するために使用された。この相互作用およびその機能の特異性を証明するために、阻害剤化合物が用された:BM2、ラミニニン結合部位を遮断するモノクローナル抗体であるラミニニン-332α3鎖10、またはレビン1、またはレビン1、およびスネーク毒由来化合物ラミニン結合インテグリンα3β1、α6β1およびα7β111、12.
侵入アッセイでは、細胞はmCherry(iCAFおよびインテグリンα3 KO iCAF)またはGFP(AsPC-IおよびPANC-I)をコードするcDNAを含むレンチウイルスを用いて、ヘテロスフェロイド中の異なる細胞型を区別するために変換された。それらを不死化し、蛍光タンパク質(mCherryおよびGFP)発現でそれらを標識する細胞の伝達は、以前の研究13で説明されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 細胞マトリックス相互作用の異なるTGF-β1阻害化合物を用いた線維芽細胞/CAF分化のためのインビトロモデルとしての3Dスフェロイド
- 6mg/mLメチルセルロース溶液の1部および細胞培養培地の3部を混合し、MEMは熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンの1%を補充し、スフェロイド形成溶液を得た。
- 新たに解凍された不死化された正常線維芽細胞(iNF)、不死化CAF(iCAF)またはインテグリンα3β1 KO iCAF(通路25まで)をスフェロイド形成溶液中で再中断する。1つの96ウェルプレートを調製する場合は、過剰なスフェロイド形成溶液を調製し、10mLを加え、75,000個の細胞を加え、各スフェロイドが750個の細胞によって構成され、プレートの各ウェルごとに100μLが分布することを念頭に置く。
- サイトカインまたはインテグリン阻害剤が研究に含まれている場合は、それらの形成中にスフェロイドにそれらを埋め込むために、細胞懸濁液にこれらの化合物を追加します。iNFは、分化をトリガするためにTGF-β1の10 ng/mLで刺激されることに注意してください。必要に応じて、20 μg/mL BM2 または 10 μg/mL のレビン 1 などの TGF-β1 と共に阻害剤化合物を追加します。
- CAFホモスペロイドは、すでに分化されているので、TGF-β1刺激なしで同じ方法で調製する。任意の化合物を添加することなく、インテグリンα3 KO CAFホモスペロイドを調出す。
- 各ウェルに溶液の100μLを加えて丸底96マルチウェルプレート上にスフェロイド形成溶液を分配する。スフェロイド溶液が井戸に分布するたびに、上下にピペッティングしてよく混ぜます。
- 24時間の細胞培養インキュベーターにプレートを置き、各ウェルに1つのスフェロイドを形成できるようにします。
- 約24時間後にスフェロイドを収集し、異なる下流の目的のためにそれらを使用する:免疫蛍光染色、リアルタイム(RT)q-PCRおよびフローサイトメトリー。スフェロイド内のECMタンパク質の沈着を含む細胞内および細胞外抗原の発現を検出するには、免疫蛍光染色を使用する。スフェロイドを単一細胞に崩壊させた後、フローサイトメトリーにより膜アンカー受容体を定量する。遺伝子活性化と転写変化を検出するには、スフェロイド細胞から単離されたmRNAのRT q-PCRを使用します。
2. スフェロイドの免疫蛍光染色
- 約24時間後に、分析する実験条件またはタンパク質ごとに1本の1.5mL反応管にスフェロイドを集める。例えば、TGF-β1で刺激したiNFのスフェロイドを、処理されなかった対照iNFとは異なるチューブに入れます。せん断力が強すぎるためにスフェロイドが破裂しないように、ピペット先端の端を切ってオリフィスを拡大します。1つの反応管に少なくとも5〜10のスフェロイドを含め、反復を可能にし、洗浄工程中に起こりうる損失を考慮に入れる。
- 1,000 x gで約30-60 sのためのベンチトップ遠心分離機でスフェロイドを遠心分離します。ペレット化されたスフェロイドを邪魔することなく、ピペッティングによってメチルセルロース含有上清を慎重に取り除きます。
- 1x PBSの50 μLで洗浄します。遠心分離ステップを繰り返し、2.2 に記載されているように、ピペッティングによって PBS を慎重に取り外します。
- 染色するタンパク質に応じて、室温で20分間PBSで50 μLの4%パラホルムアルデヒドを固定し(αSMA、NG2およびインテグリンα3β1)、または-20°Cで10分間50μLのメタノールを10分間(ラミニン-332サブユニットの場合)に固定します。
- 手順 2.2-2.3 で説明されているように、洗浄手順を繰り返します。
- 室温で4分間PBSで0.1%のトリトン-Xで細胞を透過化します。
- 手順2.2-2.3で説明されているように、洗浄手順を3回繰り返します。
- 5%FBSおよび2%BSAを含むPBSでスフェロイドをインキュベートし、RTで1時間、非特異的タンパク質相互作用部位を遮断する。
- PBSで30μLの一次抗体、2.5%FBS、1%BSAを一晩4°Cでスフェロイドをインキュベートします。次の一次抗体を使用しました: 抗αSMA Cy-3共役と抗NG2 5 μg/mL;BM2抗ラミニンα3、6F12抗ラミニンβ3および抗ラミニンγ2 20 μg/mL。
- 手順2.2-2.3で説明されているように、洗浄手順を3回繰り返します。
- PBSで30μLの二次抗体、2.5%のFBS、1%のBSAをRTで90分間インキュベートします。使用した次の二次抗体は、Alexa 488抗ウサギおよび抗マウス(5 μg/mL)であった。
- 手順2.2-2.3で説明されているように、洗浄手順を3回繰り返します。
- 室温で4分間、DAPI染色液30μLで細胞をインキュベートします。
- 手順 2.2-2.3 で説明されているように、洗浄手順を繰り返します。
- ガラスパスツールピペを使用して、PBSの滴に、ガラススライド上にスフェロイドを置きます。
- 10倍の倍率を用いてレーザー走査顕微鏡で蛍光顕微鏡でスフェロイドを画像化する。Z スタック(15~20 スタック平面)の異なる光学面で、スフェロイドの異なる光学断面を取ります。顕微鏡でレーザー設定を確立するには、目的の抗原に対して陰性の細胞からなるスフェロイドを使用するか、二次抗体でのみ染色されたスフェロイドを使用する。比較するすべてのサンプルに対して同じ設定を再利用します。
- 以前に公開された ImageJ ソフトウェアを使用して顕微鏡画像を分析します 14.手順を補足図 1にまとめました。背景として、目的のセルフリー領域(ROI)の集積信号密度を決定する。補正された細胞蛍光(TCCF)の合計を次のように計算します。
- SCCFがスフェロイドの面積とスタック数に正規化されたとして、スフェロイドの全補正蛍光(TCF)を決定します。
3. ホモスペロイドのRT q-PCR
- RT-qPCRを実行するには、50 mL反応管に少なくとも288個のスフェロイド(3つの96ウェルプレートに対応)を収集します。1,000 x gで5分間遠心分離し、ペレット化されたスフェロイドを邪魔することなくピペッティングしてメチルセルロース含有上清を慎重に除去する。
- 1x PBSの1 mLで洗浄し、1.5 mL反応管にスフェロイドを転送します。1,000 x gで約30-60 sのためのベンチトップ遠心分離機でスフェロイドを遠心分離します。ペレット化されたスフェロイドを邪魔することなく、ピペッティングによってPBSを慎重に取り外します。
- 4 mg/mLコラゲナーゼB、50μg/mL DNase I、2%BSA、PBSの1mM CaCl2を37°Cで約30~45分間、5分毎に数秒間断続的にボルテックスとパルスで250μLで解離します。
- ステップ 3.2 で説明したように、洗浄手順を繰り返します。
- メーカーの指示に従って、市販のRNA単離キットを使用して、崩壊したスフェロイドの細胞から総RNAを単離します。
- メーカーの指示に従って、単離したmRNAを市販のキットでcDNAに逆転写します。
- リアルタイム PCR による反復での転写レベルを定量化します。使用されたプライマーは:α-SMA:Fw 5'-CCGGGAATGCGAAGGAAG GA-3'、Rev 5'アカガグタットGCGCTCCGAA-3'15;ラミニン α3鎖: Fw 5 '-GCTCAGCTTTTTTTTTGA-3', Rev 5'-TGTCTCTCTCTCAATAGC-31';ラミニン β3 鎖: Fw 5 '-GGCAGGGTAGGGGGGGCGAGGAAA-3' Rev 5'-CGGACCTTTGGTAGTAGGGCCGTGT-3'17;ラミニン γ2鎖: Fw 5 '-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3' Rev 5'-TCGAGCAAAGAGATTTGG'3 16;NG2: Fw 5'-CTGCAGGTGTGTCA-3' Rev 5'-TTGGCTTGGCGATGATG-3'18;インテグリン α3 サブユニット: Fw 5'-AGGGGATTTAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATATAT-3'19;TOP-1: Fw 5'-CCAGACGGAAGCGGAAACAAC-3' Rev 5'-GTAGGAGGCTCTCTCTGAA-3'20.
- 式を使用してTOP-1などの内因性参照遺伝子のCt値のCt値を補正する: 2- ΔΔCt.ΔΔCt = ΔCt(標的試料)– ΔCt(参照試料)およびΔCt=標的遺伝子または参照遺伝子のCt – TOP-I.
4. インテグリン式のフローサイトメトリー分析
- フローサイトメトリック解析では、少なくとも288個のスフェロイド(3つの96ウェルプレートに相当)を50mL反応管に集みます。1,000 x gで5分間遠心分離し、ピペッティングによりメチルセルロース含有上清を慎重に除去する。
- 1x PBSの1 mLで洗浄し、1.5 mL反応管にスフェロイドを転送します。遠心分離ステップを繰り返し、ピペッティングでPBSを慎重に取り外します。
- ステップ 3.3 で説明されているように、スフェロイドを解除します。
- ステップ 4.2 で説明したように、洗浄手順を繰り返します。
- 非特異的結合部位を遮断し、Fcγ受容体(CD16、CD32、およびCD64)への検出関連抗体の結合を防ぐために、2%の馬血清を含むPBSの100 μLで細胞をインキュベートする(または別の動物種の血清、その抗体は、その抗体は、そうでないであろう。実験で使用)および回転と4 °Cで20分のための0.1%BSA。
- 細胞内マーカーを染色する場合は、ステップ2.2-2.5に記載されている細胞を固定/透過化します。
- 2%の馬血清および0.1%のBSAを含むPBSの100 μLの一次抗体で細胞をインキュベートし、回転を伴う4°Cで30分間。一次抗体を10 μg/mLに希釈します。
- PBS + 0.1% BSA の 100 μL で 3 回洗浄し、その間に 1,000 x gでトップ ベンチ遠心分離機の遠心分離ステップを使用します。
- 2%の馬血清および0.1%のBSAを含むPBSの100 μLで二次抗体で細胞をインキュベートし、回転を伴う4°Cで30分間。二次抗体を10 μg/mLに希釈する。
- ステップ 4.7 で説明したように、洗浄手順を繰り返します。
- フローサイトメーターで2.0 x 104染色細胞を分析します。FSC-SSCドットプロットを介した単一生細胞のゲートと、選択された蛍光素に適したチャネル上のゲート細胞の蛍光を分析する。
5. ヘテロスフェロイドを用いた侵入アッセイ
- 異なる細胞型および対応する培地を含むヘテロスフェロイドに対するスフェロイド形成溶液を、表1に要約する。細胞は以前、mCherryまたはGFP発現のベクターを含むレンチウイルスでトランスメオ化されていた。
- プレートの各ウェルに100μLのスフェロイド形成溶液を充填し、細胞培養インキュベーターでプレートを24時間インキュベートし、各ウェルに1つのスフェロイドを形成できるようにします。
- ラットテールコラーゲンIの2mg/mLを含むゼラチン状マトリックス混合物の60 μL、市販のゲル化マトリックスの30%、ラミニン-332の2.5 μg/mLを1.5mL反応管に調製します。μスライド血管新生室の3ウェルに15μLを迅速に分配する。既にゲルを含む各ウェルに1つのスフェロイドを埋め込みます。
- 必要に応じて、顕微鏡下のピペットで井戸の中心にスフェロイドの位置を迅速に調整します。
- 次のヘテロスペロイドの手順 5.2-5.3 を繰り返し、ホモスペロイドに対してもう一度繰り返します。
- インキュベーター内のゲルを1時間インキュベートして固化させ、次いで、細胞培養培地でゲルを静かにオーバーレイする。
- 蛍光顕微鏡でスフェロイドを画像化します。Zスタックの異なる光学面で、および侵略の異なる時点(例えば、0時間、24時間、48時間、72時間)で、スフェロイドの異なる光学断面を取ります。
- 侵入癌細胞の数を数えることによって画像を分析します。侵入細胞は、スフェロイドを残し、侵襲領域に入ったものです。侵襲領域は、最も遠い侵略細胞によって与えられた外側と内周の間のリング領域と、侵略実験の開始時のスフェロイド境界によってそれぞれ、補足図2で概説されているように定義される。 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この実験計画の結果は、マーティンス・カバコら13に掲載されており、これらの実験から得られた結論をさらに読むことをお勧めします。
図1は、免疫蛍光スフェロイドの代表的な画像で、不滅正常線維芽細胞と不死化CAF(図1A)の両方のインテグリンα3サブユニットの免疫染色と免疫蛍光を示す。qPCRによるインテグリンα3サブユニット遺伝子の定量化(図1B)および転写レベル(図1C)。この結果のパネルは、インテグリンα3が通常の対応と比較して、iCAFでアップ規制であることを示しています。これは、インテグリンα3β1が膵繊維芽細胞分化のマーカーと考えることができることを証明した。これはまた、フローサイトメトリー研究13によって実証された。
図 1.iNFおよびiCAFによるインテグリンα3サブユニットの発現インテグリンα3サブユニットはiCAFによってアップレギュレートされ、膵臓CAFの分化マーカーとしての可能性を反映しています。(A)iCAFのホモスフェロイドと比較した正常膵臓線維芽細胞(iNFS)のホモスフェロイドの免疫蛍光染色は、分化細胞におけるインテグリンα3サブユニットの増加シグナルを示す。(B) スフェロイド中の細胞の蛍光シグナルを、ImageJソフトウェアを用いて3DスフェロイドのZスタック画像で定量した。3つの独立した実験の平均±SEMが示され、t検定(*、p<0.1)によって比較される。(C) 解離されたスフェロイドから得られた細胞を、インテグリンα3サブユニットの転写レベルについて分析した。2つの独立した実験からの折り目変化としてのΔΔCt値の平均±SEMを示し、t検定によって比較する。0.1の有意水準には達していないが、インテグリンα3-コードコードmRNAの転写レベルはiNFよりもiCAFで高い。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ヘテロスフェロイド | ||
| セルタイプ(25までの通路) | セル数 | ミディアム(1部メチルセルロース+...) |
| mCherry-iCAFs + GFP-AsPC-I | 400 CAF + 400 膵臓癌細胞 | FBS の 10% と 1% ペン/ストレップ + 1,5 部分の RPMI の 1,5 部分と FBS の 10% と 1% ペン/ストレップの 1,5 部分セル MEM |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I | ||
| mCherry-iCAFs + GFP-PANC-I | FBS の 10% と 1% ペン/ストレップ + 1,5 部分の DMEM の 1,5 部分と FBS の 10% と 1% ペン/ストレップの 1,5 部分を持つセル MEM | |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-PANC-I | ||
| ホモスフェロイド | ||
| 細胞タイプ(25までの通路) | セル数 | ミディアム(1部メチルセルロース+...) |
| mCherry-iCAFs | 400セル | FBSの10%と1%のペン/ストレップを補完する3つの部分MEM |
| mCherry-α3KO-iCAFs | ||
| GFP-AsPC-I | FBSの10%と1%のペン/ストレップの3つの部分RPMI | |
| GFP-PANC-I | FBSの10%と1%のペン/ストレップの3つの部分DMEM | |
表 1.ヘテロとホモスペロイドの細胞組成。ヘテロおよびホモスペロイドを組み立てるのに必要な細胞の数と、スフェロイド形成溶液に使用する必要がある対応する培地の数を以下の表にまとめます。
補足図 1.StepJを用いて、目的のタンパク質の免疫蛍光染色を定量するための逐次的工程。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 2.ImageJを用いた侵入アッセイにおける侵入癌細胞数の定量化のための逐次的ステップ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAFの分化を研究するための適切なインビトロモデルを開発することは困難な作業です。異なるアプローチを採用した後、我々は、3Dスフェロイドモデルは、不死化されたCAFを持つ膵癌細胞間の相互作用を研究することができる、より実用的で生理学的および臨床的に関連するモデルであると結論付けた。このモデルは、少なくとも短期的な培養条件(最大48時間)において、細胞培養プラスチックの剛性などの動脈性ストレスに起因する線維芽細胞の自発的分化を防止した。これらの研究で用いられるスフェロイドの正確な剛性は測定されなかったが、伊藤らはロボット統合マイクロ流体チップ22を用いてヒト臍静脈内皮細胞および間葉系幹細胞ヘテロスフェロイドの剛性を評価した。ヘテロスフェロイドの平均剛性指数を、組み立て後1、3日目に測定した。スフェロイドの大きさは異なり、MSCは集約容量を増加させたようで、時間の経過とともにサイズが減少した(135.5 μmから99.8 μm)21、22。その結果、スフェロイドの剛性も 5.0 x 10-3から 7.5 x 10-3 Pa22に増加しました。しかし、CAFとAsPC-Iの異種集団からなるスフェロイドの剛性は、線維芽細胞/CAFの単一の集団で作られたホモスペロイドの機械的特性および剛性値とは異なる機械的特性および剛性値を有する可能性がある。これはまだ不明であり、伊藤ら22によって記述されたものとは異なる場合があります.剛性はまた、細胞産生および堆積ECMの量および架化、スフェロイド内の異なる細胞相互作用、スフェロイド内の細胞数、または培養期間に依存する。
他のモデルと同様に、実験計画には、スフェロイドを形成するために必要な細胞の数、治療の時間ポイント、顕微鏡イメージングなどの最適化が必要ないくつかの変数が含まれます。記載された実験計画は、大量輸送制限9による拡散制限があるため、栄養素および酸素の拡散に最小限の影響を及ぼすであろうスフェロイドサイズを有することを目的として最適化された。例えば、150〜200μmを超えるサイズのスフェロイド中の酸素の輸送は、グルコースおよび乳酸の拡散と同様に、300 μm9、18より大きい凝集体において著しく影響を受ける。400〜500 μmより大きい直径を有するスフェロイドは、通常、静止細胞の生存層と増殖細胞の外縁に囲まれた壊死性コアからなる同心円状の層構造を示す9、24。化合物の限られた拡散を回避し、アクセス不能な球状コアの問題を排除するために、細胞は、スフェロイド形成前にTGF-β1、BM2およびlebein-1で処理し、細胞がスフェロイド形成溶液中に個別に懸濁される場合。さらに、スフェロイド内のほとんどの細胞に酸素と栄養素を利用できるようにし、壊死性コアの形成を防ぐために、スフェロイド当たりの細胞数を750-1000細胞に減らし、直径140〜200μmのスフェロイドを形成しました。
スフェロイド形成溶液中の異なる細胞タイプを徹底的に混合することが重要であり、スフェロイドはほぼ同じ数の細胞で構成され、スフェロイド間の有意なサイズの違いを回避します。それにもかかわらず、時にはいくつかのスフェロイドが他よりもわずかに大きくなる可能性があり、それは顕微鏡でより多くのZスタックが獲得されます。一部のスフェロイドも完全に球状の形態から逸脱する可能性がありますが、これは、スフェロイドのROIが線形化されている場合にも考慮されます。これらのサイズと形状の違いは、次の段落で説明したように正規化された定量値で説明されます。スフェロイドの形状に関するもう一つの重要な要因は、セルタイプです。例えば、線維芽細胞とCAFはほぼ球形のスフェロイドを形成し、AsPC-IおよびPANC-I細胞はより分散凝集体を形成する。
スフェロイドをイメージングするために、固定スフェロイドの凍結切片も使用できますが、細胞タイプおよび免疫染色プロトコルに応じて、断面時にスフェロイドの完全性が損なわれる可能性があります。あるいは、その3D構造における全球状体の染色は、より簡単な選択肢であることが判明した。3D構造としてスフェロイドの顕微鏡Z積層画像を取得すると、スフェロイドあたり平均5〜15分かかります。
スフェロイドの画像中の免疫蛍光信号は、3D構造の平面を表すため定量化が困難です。使用される方法は、前述の方法に基づいており、著者は外挿し、スフェロイドをセル14と見なした。このようにして、蛍光シグナルは式1を用いて補正される。
背景として、目的の細胞のない領域(ROI)の集積信号密度が決定された。測定された統合信号密度は、選択したROI内のピクセルの強度値の合計です。スフェロイドは 3D 構造であるため、異なるスタックからの共焦点イメージが取得されます。このような画像を処理するには、各スタック内の蛍光シグナルを個別に測定するか、またはすべてのスタックの合計をZ投影に使用することができます。すべての定量化は ImageJ を使用して実行できます。スフェロイドの全補正蛍光(TCF)は、正規化されたTCCFとして決定され、スフェロイドの面積およびスタック数を考慮して、式2を用いた。これは、スフェロイドの様々なサイズと球形の不一致を説明します。この方法を用いてスフェロイドの免疫蛍光染色を解析すると、スフェロイド当たり最大5分かかる場合があります。
同様に、スフェロイドから周囲の間質マトリックスへの細胞の侵入は、異なるアルゴリズムによって分析することができる。簡単な方法は、侵襲性癌細胞を23をカウントしたNowickiらによって以前に説明された。侵入しない細胞から侵襲細胞を判別するためには、細胞が球体構造を残したと考えられる空間的限界を確立することが重要である。したがって、開始点は、最初の時点で取得されたスフェロイド画像の周囲(時間0)に対応する限界であり、スフェロイドがゲルに埋め込まれた時期である。最も遠いゲルに侵入する細胞は、侵襲的な細胞が到達できる最大距離と考えられ、したがって、侵略領域の外縁を定義する。この方法は、ImageJからのカウントツールを使用して、侵入領域に存在する侵襲性癌細胞をカウントし、時間0hでスフェロイドに対応するROIをROIマネージャーに追加し、取得した同じ正確なスフェロイドの画像に転置する48 h または 72 時間後。このため、取得の異なる時間の間に、回転楕骨が可能な限り平面の中心に近いままにすることが重要です。細胞数をカウントすると、スフェロイドあたり最大5分かかる場合があります。
もう 1 つの重要な考慮事項は、ヘテロスフェロイド内の異なる細胞型を区別することです。これは、細胞型が高い細胞分裂率を有する場合、または実験が長期間行われる場合に問題となる可能性のある生細胞蛍光色素を用いて行うことができる。2つの異なる集団を区別するより堅牢で信頼性の高い方法は、mCherryやGFPなどの蛍光タンパク質を発現する細胞株を開発することです。発現ベクターの送達はレンチウイルスを用いて行うことができ、その結果、これらのタンパク質の安定した発現をもたらす。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は利益相反を宣言しない。この資料は著者の見解のみを反映し、欧州連合は、そこに含まれる情報を使用する可能性のあるいかなる使用についても責任を負いません。
Acknowledgments
我々は、BM2とlebein-1を準備するバーバラ・シェディングの助けを認める。私たちは、スフェロイドアッセイにおける彼女の専門知識を共有するためのアグネス・ノエルを認めます。我々は、S2条件下でレンチウイルストランスフェクションを処理する彼らの助けにソーニャ・シェルハースとマイケル・シェーファーズに感謝します。我々は、膵臓癌組織からCAFを準備するサビーヌ・フォン・リューデンの支援を認める。
これらの結果につながる研究は、欧州連合の第7フレームワークプログラムFP7/2007-2013/REA交付協定n◦(316610)のJ.A.E.に基づき、人民プログラム(マリー・キュリー・アクション)から資金を受け取りました。さらに、J.A.E.とA.C.M.C.は、セル・イン・モーション・クラスター・オブ・エクセレンス(EXC 1003-CiM)内のドイツ・フォルシュチュンゲインシャフト(DFG)によって財政的に支援されました。このプロジェクトは、ヴィルヘルム・サンダー・スティフトゥン(助成金:2016.113.1からJ.A.E.)によっても支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
- Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
- Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
- Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
- Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
- Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
- Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
- Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
- Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
- Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
- Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
- Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
- Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
- Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
- Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).
