Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En 3D Spheroid model som et mere fysiologisk system for kræft-associeret fibroblaster differentiering og invasion in vitro undersøgelser

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/60122
Automatic Translation
1,2, 1
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

Summary

Målet med denne protokol er at etablere en 3D in vitro-model til at studere differentieringen af Cancer-associerede fibroblaster (CAFs) i en tumor bulk-lignende miljø, som kan behandles i forskellige analysesystemer, såsom immunofluorescens, transkriptional analyse og Life Cell Imaging.

Abstract

Det er vigtigt at definere den ideelle model for en in vitro-undersøgelse, primært hvis man studerer fysiologiske processer såsom differentiering af celler. I tumor stroma stimuleres Host fibroblaster af kræftceller til at differentiere. Således, de erhverver en fænotype, der bidrager til tumor mikromiljø og understøtter tumorprogression. Ved at bruge sfæroide-modellen har vi oprettet et sådant 3D in vitro-model system, hvor vi analyserede rollen af Laminin-332 og dens receptor anti α3β1 i denne differentierings proces. Denne sfæroide model system ikke kun reproducerer tumor mikromiljø betingelser i en mere præcis måde, men også er en meget alsidig model, da det giver mulighed for forskellige downstream-undersøgelser, såsom immunfluorescent farvning af både intra-og ekstracellulære markører samt deponerede ekstracellulære matrix proteiner. Desuden kan der undersøgt transkriptionelle analyser af qPCR, flow cytometri og cellulær invasion med denne model. Her beskriver vi en protokol af en sfæroide model til at vurdere rollen af cafs ' anti α3β1 og dets ectopically deponeret ligand, Laminin-332, i differentiering og støtte invasionen af kræftceller i bugspytkirtlen.

Introduction

Tumorens mikromiljø er en meget kompleks niche og ekstremt vigtig for vedligeholdelse og progression af tumorcellerne1. Det dannes ikke kun af kræftcellerne, men også af stromale fibroblaster. Tumorcellerne er omgivet af en stroma, der er specifik og forskellig fra stroma af normale væv2. Laminin-332 er en ekstracellulær matrix protein ectopically udtrykt i stroma af forskellige tumorer, såsom af bugspytkirtlen adenokarcinom3. Desuden, den biokemiske sammensætning af ECM og også dens biofysiske egenskaber, såsom stivhed og spændinger, ændre sig inden for tumor bulk4. Denne tumor stroma, eller "reaktiv stroma", er forårsaget af en tilpasning af fibroblaster til de nærliggende kræftceller og ved rekruttering af andre meget vigtige spillere, der udvikler en gunstig og støttende miljø for tumorprogression. Differentieringen af stromale fibroblaster resulterer i Cancer-associerede fibroblaster (CAF). Disse celler kan identificeres ved hjælp af forskellige markører såsom α-glat muskel actin (αSMA)5 eller neurale/glial antigen 2 (NG2)6.

Den mest egnede in vitro -model til at rekapitulere tumor mikromiljø (TME) med cafs er svært at vælge. Metoden til at efterligne fysiologiske parametre af TME på en omkostningseffektiv og reproducerbar måde skal overvejes for et sådant model system. Inden for TME, forskellige processer, såsom spredning, differentiering, migration og invasion af de forskellige celletyper opstår. Disse cellulære processer kan udføres individuelt med forskellige metoder. Dog skal de eksperimentelle betingelser overveje cellulære interaktioner med tumor stroma ECM, da stivhed af grunden påvirker CAF differentierings processen. R.G. Wells kommenterede virkningen af matrix stivhed på celle adfærd og fremhævede, at cytoskelet organisation og differentierings status observeret i in vitro-dyrkede celler kan være artefakter7. Forskellige stimuli synes at være involveret i CAF differentiering, herunder mekanisk spænding5,7. For at undgå dette, 2D bløde substrater kunne være mulige tilgange til differentiering undersøgelser, da de omgå problemet med den stive kultur parabol plastik. En blød 2D overflade, hvorpå fibroblaster kan dyrkes, kan være kollagen-I belagt polyacrylamid geler, hvorved gel stivhed kan manipuleres ved koncentrationen af polyacrylamid og gel Cross-linker. Vedhæftning og dannelse af αSMA-rige stress fibre er forbedret i fibroblaster sammen med gel stivhed8. Disse resultater understreger betydningen af bløde substrat stilladser for mere fysiologiske in vitro-differentierings modeller. Men i vores hænder den eksperimentelle reproducerbarhed og billeddannelse af disse gels var udfordrende. For at overvinde disse mangler, skiftede vi 2D Soft substrat system til en 3D sfæide model til differentiering og invasion undersøgelser. Denne model er mere klinisk relevant og, svarende til en in vitro organoid, rekapitulerer in vivo celle-celle interaktioner, ECM produktion og deposition, samt celle adfærd9.

Sfæroider dannes, når cellerne mangler et substrat at overholde. Når cellerne er tilbage uden en klæbende overflade, de aggregerer til at danne en mere eller mindre sfærisk struktur. Hvis sfæroider er sammensat af en type celle, kaldes de homospheroider; Hvis de består af to eller flere forskellige celletyper, danner de heterosfæroider.

Blandt de forskellige metoder til sfæroide forberedelse udfører vi protokollen ved hjælp af ikke-klæbende runde bund 96-brønd plader. Det er meget effektivt med hensyn til omkostningerne. Her producerer vi både homospheroids af fibroblaster, CAF eller cafs mangler anti α3 underenhed til at undersøge differentierings processen og heterosfæroider af cafs eller anti α3 ko cafs og pancreas Duct karcinom celler (aspc-i og Panc-i) at studere invasionen i den omgivende matrix.

Målet for disse undersøgelser var at bruge primære cafs isoleret fra humane pancreas karcinom biopsier. Men, biopsier at få cellerne er knappe og af denne grund, cafs anvendes i disse undersøgelser er blevet udødeliggjort ved hjælp af lentivirus indeholder hTERT. De kaldes iCAFs, og deres normale modparter, primære menneskelige bugspytkirtel fibroblaster, kaldes iNFs. De menneskelige pancreas fibroblaster og bugspytkirtlen Duct karcinom celler, aspc-i og Panc-i, er kommercielt tilgængelige.

Denne protokol blev anvendt til at undersøge virkningen af Laminin-332-integrin interaktion i CAF differentierings processen. For at påvise specificiteten af denne interaktion og dens funktion blev der anvendt inhibitor forbindelser: BM2, et monoklonalt antistof, der blokerer anti-bindingsstedet Laminin-332 α3 Chain10, eller lebein 1, en slange Venom afledt forbindelse, der blokerer Laminin bindende integriner α3β1, α6β1 og α7β111,12.

For invasions analysen var cellerne blevet transduceret med lentivirus indeholdende cDNA-kodning enten mcherry (icafs og anti α3 ko icafs) eller gfp (aspc-i og Panc-i) for at skelne mellem de forskellige celletyper i heterosfæroider. Den transduktion af cellerne til at udødeliggøre dem og/eller at mærke dem med fluorescerende protein (mCherry og GFP) udtryk er beskrevet i en tidligere undersøgelse13, der bør konsulteres for yderligere oplysninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.3D sfæroider som en in vitro model for fibroblast/CAF differentiering ved hjælp af forskellige TGF-β1 hæmmende forbindelser af celle-matrix interaktion

  1. Bland 1 del af 6 mg/mL methylcellulose opløsning og 3 dele af cellekultur mediet, suppleret med 1% af det varme inaktiverede føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin for at opnå den sfæide dannelse opløsning.
  2. Genopstop nyoptøede udødeliggjort normal fibroblaster (INFS), udødeliggjort CAF (icafs) eller anti α3β1 ko ICAF (passage op til 25) i sfæroide formation Solution. Hvis du forbereder 1 96 brønd plade, forberede et overskud af sfæroide formation løsning, 10 ml og tilsæt 75.000 celler, holde sig for øje, at hver sfæoid er sammensat af 750 celler, og at 100 μl fordeles pr hver brønd af pladen.
  3. Hvis cytokiner eller anti-hæmmere er inkluderet i studiet, tilsættes disse forbindelser til cellesuspensionen for at indlejre dem i sfæroerne under deres dannelse. Bemærk, at iNFs stimuleres med 10 ng/mL TGF-β1 for at udløse differentiering. Hvis det er relevant, tilsættes inhibitor forbindelser sammen med TGF-β1, såsom 20 μg/mL BM2 eller 10 μg/mL lebein 1.
  4. Forbered CAF homospheroids på samme måde, men uden TGF-β1 stimulus, da de allerede er differentieret. Forbered Anti α3 ko CAF homospheroids uden tilsætning af nogen forbindelse.
  5. Distribuer sfæroide-dannelses opløsningen på en rund bund 96 multi-brønd plade ved at tilføje 100 μl af opløsningen i hver brønd. Hver gang sfæroide-opløsningen fordeles i brøndene, blandes godt ved pipettering op og ned flere gange.
  6. Anbring pladen i celle kulturinkubator i 24 timer for at tillade, at der dannes et sfæoid i hver brønd.
  7. Saml sfæroider efter ca. 24 timer og brug dem til forskellige downstream-formål: immunfluorescent farvning, realtid (RT) q-PCR og flow cytometri. For at detektere ekspression af intra-og ekstracellulære antigener, herunder deposition af ECM-proteiner i spheroid, brug immunfluorescent farvning. Efter opløsning af sfæroider i enkeltceller, kvantificeres membran-forankret receptor ved flow cytometri. For at opdage genaktivering og transkriptionelle ændringer skal du bruge rt q-PCR af mRNA isoleret fra sfæroide-cellerne.

2. Immunofluorescent farvning af sfæroider

  1. Efter ca. 24 timer opsamles sfæroider i et 1,5 mL reaktions slange pr. eksperimentel tilstand eller pr. protein, der skal analyseres. For eksempel, placere sfæroider af iNFs stimuleret med TGF-β1 i et rør forskellig fra kontrol iNFs, som ikke blev behandlet. For at undgå ruptur af sfæroider på grund af for kraftige forskydningskræfter, skæres enden af pipettespidsen for at forstørre åbningen. Der skal være mindst 5-10 sfæroider i ét reaktions slange for at tillade replikater og tage hensyn til de mulige tab under vaske trinene.
  2. Centrifuger sfæroerne med en bænk top centrifuge i ca. 30-60 s ved 1.000 x g. Fjern forsigtigt det methylcellulose-holdige supernatanten ved pipettering uden at forstyrre de pelleteret sfæroider.
  3. Vask med 50 μL 1x PBS. Gentag Centrifugerings trinnet, og fjern PBS forsigtigt ved pipettering som beskrevet i punkt 2,2.
  4. Afhængigt af det protein, der skal farves, fix med 50 μl af 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur (for αsma, NG2 og anti α3β1) eller med 50 μl methanol for 10 min ved-20 °c (for Laminin-332 under enheder).
  5. Gentag vaske trinnet som forklaret i trin 2.2-2.3.
  6. Permeabilize cellerne med 0,1% Triton-X i PBS i 4 minutter ved stuetemperatur.
  7. Gentag vaske trinnet som forklaret i trin 2.2-2.3 tre gange.
  8. Der Inkubér sfæroider i PBS indeholdende 5% FBS og 2% BSA, i 1 time ved RT for at blokere for ikke-specifikke protein interaktions steder.
  9. Sfæroider Inkubér med 30 μL primære antistoffer i PBS, 2,5% FBS og 1% BSA ved 4 °C natten over. Følgende primære antistoffer blev anvendt: anti-αSMA CY-3 konjugeret og anti-NG2 ved 5 μg/mL; BM2 anti-Laminin α3, 6F12 anti-Laminin β3 og anti-Laminin γ 2 20 μg/mL.
  10. Gentag vaske trinnet som forklaret i trin 2.2-2.3 tre gange.
  11. Sfæroider Inkubér med 30 μL sekundære antistoffer i PBS, 2,5% FBS og 1% BSA ved RT i 90 min. Følgende sekundære antistoffer blev anvendt: Alexa 488 anti-kanin og anti-mus (5 μg/mL).
  12. Gentag vaske trinnet som forklaret i trin 2.2-2.3 tre gange.
  13. Cellerne inkubates med 30 μL DAPI-farvningsopløsning i 4 minutter ved stuetemperatur.
  14. Gentag vaske trinnet som forklaret i trin 2.2-2.3.
  15. Placer sfæroider på et glas skred, i en dråbe PBS, ved hjælp af et glas Pasteur pipet.
  16. Billedet sfæroider ved Fluorescens mikroskopi i en Laserscanning mikroskop ved hjælp af en forstørrelse på 10x. Tag et andet Optisk tværsnit af sfæroide på forskellige optiske planer i en z-stak (15-20 stack-fly). For at etablere laser indstillingerne i mikroskopet skal du bruge et sfæoid bestående af celler, der er negative for det antigen, der er af interesse, eller en kugleformet kun med det sekundære antistof. Genbrug de samme indstillinger for alle de prøver, der skal sammenlignes.
  17. Analysér de mikroskopiske billeder med ImageJ software som tidligere udgivet14. Trinene er opsummeret i supplerende figur 1. Som baggrund, bestemme den integrerede signal tæthed af en celle-fri region af interesse (ROI). Beregn den totale korrigerede celle fluorescens (TCCF) som:
    Equation 1
  18. Bestem den totale korrigerede fluorescens (TCF) af sfæroderne, da tccf normaliserede sig til området sfæroide og antallet af stakke.
    Equation 2

3. RT q-PCR af homospheroider

  1. For at udføre RT-qPCR skal der opsamles mindst 288 sfæroider (svarende til 3 96-brønd plader) i et 50 mL reaktions slange. Centrifugér i 5 min ved 1.000 x g og fjern forsigtigt det methylcellulose-holdige supernatanten ved pipettering uden at forstyrre de pelleteret sfæroider.
  2. Vask med 1 mL 1x PBS og Overfør sfæroider til et 1,5 mL reaktions slange. Centrifuger sfæroerne med en bænk top centrifuge i ca. 30-60 s ved 1.000 x g. Fjern PBS forsigtigt ved pipettering uden at forstyrre de pelleteret sfæroider.
  3. Dissociér sfæroider med 250 μL 4 mg/mL kollagenase B, 50 μg/mL DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl2 i PBS ved 37 °c i ca. 30-45 min ved forsigtigt at vortexning og pulserer periodisk i et par sekunder hver 5 min.
  4. Gentag vaske trinnet som forklaret i trin 3,2.
  5. Isoler det totale RNA fra cellerne i disintegrerede sfæroider ved hjælp af et kommercielt RNA-isolations sæt i henhold til producentens anvisninger.
  6. Reverse transskribere den isolerede mRNA i cDNA med et kommercielt kit, ifølge producentens anvisninger.
  7. Kvantificering af transskriptions niveauerne i replikater ved real-time PCR. De anvendte primere var: α-SMA: FW 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ′, rev 5 ′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 ′15; Laminin α3 kæde: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′16; Laminin β3 kæde: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; Laminin γ2 kæde: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′18; anti α3 underenhed: FW 5 '-aggggaccttcaggtgca-3 ' rev 5 '-tgtagccggtgatttaccat-3 '19; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.
  8. Korrigere CT-værdierne for CT-værdien af et endogent reference gen, såsom TOP-1 ved hjælp af ligningen: 2-δδct. ΔΔCt = ΔCt (målprøve) – ΔCt (referenceprøve) og ΔCt = CT af målgenet eller reference genet – TOP-I.

4. flow cytometri analyse af anti-ekspression

  1. For flowcytometrisk analyse opsamles mindst 288 sfæroider (svarende til 3 96-brønd plader) i et 50 mL reaktions slange. Centrifugér i 5 minutter ved 1.000 x g , og fjern forsigtigt den methylcellulose, der indeholder supernatanten, ved pipettering.
  2. Vask med 1 mL 1x PBS og Overfør sfæroider til et 1,5 mL reaktions slange. Gentag Centrifugerings trinnet, og fjern PBS forsigtigt ved pipettering.
  3. Dissociere sfæroider som beskrevet i trin 3,3.
  4. Gentag vaske trinnet som forklaret i trin 4,2.
  5. Hvis du vil blokere for ikke-specifikke bindingssteder og forhindre binding af detektionsrelevante antistoffer mod Fcγ-receptorer (CD16, CD32-og CD64), skal du inkubere cellerne i 100 μL PBS, der indeholder 2% heste serum (eller serum fra en anden dyreart, hvis antistoffer ikke vil blive anvendes i forsøget) og 0,1% BSA i 20 min ved 4 °C med rotation.
  6. I tilfælde af farvning intracellulære markører, fix/permeabilize cellerne som beskrevet under trin 2.2-2.5.
  7. Cellerne inkubates med de primære antistoffer i 100 μL PBS, der indeholder 2% heste serum og 0,1% BSA i 30 min ved 4 °C med rotation. Det primære antistof fortyndes til 10 μg/mL.
  8. Vask med 100 μL PBS + 0,1% BSA tre gange, og Centrifugerings trinene i topbænken centrifugeres ved 1.000 x g i mellem.
  9. Cellerne inkubates med de sekundære antistoffer i 100 μL PBS, der indeholder 2% heste serum og 0,1% BSA i 30 min ved 4 °C med rotation. Sekundære antistof fortyndes til 10 μg/mL.
  10. Gentag vaske trinnet som forklaret i trin 4,7.
  11. Analysér 2,0 x 104 farvede celler i et flow cytometer. Gate for enkelt levende celler via FSC-SSC dot plot og analysere fluorescens af gated celler på kanalen passende for den valgte fluorophore.

5. invasion analyse ved hjælp af heterosfæroider

  1. Forbered sfæroide-dannelses opløsningen til heterosfæroider, der indeholder de forskellige celletyper og tilsvarende medier, som opsummeret i tabel 1. Cellerne var tidligere blevet transduceret med lentivirus indeholdende vektorer for enten mCherry eller GFP udtryk.
  2. Fyld 100 μl af sfæroide-dannelses opløsningen i hver brønd af pladen og Inkubér pladen i celle kulturinkubatoren i 24 timer for at tillade, at der dannes et sfæoid i hver brønd.
  3. Forbered 60 μL gelatinøs matrix blanding indeholdende 2 mg/mL Rottehale kollagen i, 30% af den kommercielle gelificerende matrix og 2,5 μg/mL Laminin-332 i et 1,5 mL reaktions slange. Fordel hurtigt 15 μl i 3 brønde i μ-slide angiogenese-kammeret. Integrer en sfæide i hver brønd, der allerede indeholder gelen.
  4. Hvis det er nødvendigt, hurtigt justere placeringen af sfæroide til midten af brønden med en pipette under mikroskop.
  5. Gentag trin 5.2-5.3 for de næste heterosfæroider og Gentag igen for homospheroider.
  6. Incubate geler i inkubator for 1 h at størkne og derefter forsigtigt overlejre geler med cellekulturmedium.
  7. Billedet af sfæroider ved Fluorescens mikroskopi i en laser scannings mikroskop. Tag forskellige optiske tværsnit af sfæroide på forskellige optiske planer i en z-stak og på forskellige tidspunkter for invasion (f. eks 0 h, 24 h, 48 h og 72 h).
  8. Analysér billederne ved at tælle antallet af invaderende cancerceller. Invaderende celler er dem, der har forladt sfæroide og trådte det invasive område. Det invasive område er defineret som ring området mellem de ydre og indvendige perimetre, der gives af den længst invaderede celle og af sfæroide-grænsen ved begyndelsen af invasions forsøgene, som beskrevet i supplerende figur 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaterne af dette eksperimentelle design er offentliggjort i Martins Cavaco et al.13, som anbefales til yderligere læsning om de konklusioner, der blev draget af disse eksperimenter.

Figur 1, et repræsentativt billede af et immunfluorescent spheroid, viser immun farvning af anti α3 under enheden af både udødeliggjort normal fibroblaster og udødeliggjort cafs (figur 1a), samt immunofluorescens kvantificering (figur 1b) og de transkriptionelle niveauer af anti α3 underenhed-genet ved qPCR (figur 1c). Dette panel af resultater viser, at anti α3 er reguleret i icafs, sammenlignet med den normale modstykke. Dette viste sig, at anti α3β1 kan betragtes som en markør for bugspytkirtel fibroblaster differentiering. Dette blev også påvist af flowcytometry Studies13.

Figure 1
Figur 1. Ekspression af anti α3 underenhed af INFS og icafs. Anti α3 underenhed er upregulated af icafs, hvilket afspejler dets potentiale som en differentierings markør for pankreatiske cafs. (A) Immunofluorescent farvning af homospheroider af normale pancreasfibroblaster (INFS) sammenlignet med homospheroider af ICAF viser et øget signal af anti α3 underenhed i de differentierede celler. (B) Fluorescens signalet fra cellerne i sfæroide blev kvantificeret med Z-stak billeder af 3D sfæroide, ved hjælp af ImageJ software. : ± SEM af tre uafhængige eksperimenter vises og sammenlignes med t-test (*, p < 0,1). C) cellerne opnået fra de dissocierede sfæroider blev analyseret for deres transkriptionelle niveauer af anti α3-underenhed. Betyder ± SEM af ΔΔCt-værdier som fold ændringer fra to uafhængige eksperimenter vises og sammenlignes ved t-test. Selvom det ikke når signifikansniveauet på 0,1, er de transkriptionelle niveauer af anti α3-kodning mRNA højere i icafs end i INFS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Heterosfæroider
Celletype (passage op til 25) Antal celler Medium (1 del methylcellulose +...)
mCherry-iCAFs + GFP-AsPC-I 400 CAF + 400 kræftceller i bugspytkirtlen 1,5 dele celle MEM med 10% af FBS og 1% pen/STREP + 1,5 dele af RPMI med 10% af FBS og 1% pen/STREP
mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I
mCherry-iCAFs + GFP-PANC-I 1,5 dele celle MEM med 10% af FBS og 1% pen/STREP + 1,5 dele af DMEM med 10% af FBS og 1% pen/STREP
mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-PANC-I
Homospheroider
Celletype (passage op til 25) Antal celler Medium (1 del methylcellulose +...)
mCherry-iCAFs 400 celler 3 dele MEM suppleret med 10% af FBS og 1% pen/STREP
mCherry-α3KO-iCAFs
GFP-AsPC-I 3 dele RPMI med 10% af FBS og 1% pen/STREP
GFP-PANC-I 3 dele DMEM med 10% af FBS og 1% pen/STREP

Tabel 1. Celle sammensætning af hetero-og homospheroider. Det antal celler, der er nødvendige for at samle hetero-og homospheroider samt det tilsvarende medium, som skal anvendes til sfæroidedannelses opløsningen, er opsummeret i nedenstående tabel.

Supplerende figur 1. Sekventielle trin til kvantificering af immunfluorescent farvning af et protein af interesse i sfæroider, ved hjælp af ImageJ. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2. Sekventielle trin til kvantificering af antallet af invaderende cancerceller i invasions analysen ved hjælp af ImageJ. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

At udvikle en passende in vitro-model til at studere CAF differentiering er en udfordrende opgave. Efter at have ansat forskellige tilgange, konkluderede vi, at en 3D sfæroide model er den mere praktiske, fysiologiske og klinisk relevante model, hvor samspillet mellem pancreas karcinom celler med udødeliggjort cafs kan undersøgt. Denne model forhindrede spontan differentiering af fibroblaster, på grund af arteffaktiske stressorer såsom stivhed af cellekulturen plastik, i det mindste i kortsigtede kulturforhold (op til 48 h). Selv om den nøjagtige stivhed af det sfæroide, der blev anvendt i disse studier, ikke blev målt, evaluerede Ito et al. stivheden af humane navle vene endotelceller og mesenchymal stamcelle heterospheroider ved hjælp af en robot integreret mikrofluidisk chip22. Den gennemsnitlige stivhed-indeks af heterosfæroider blev målt 1 og 3 dage efter montering. Størrelsen af sfæroider var anderledes, MSC syntes at øge deres aggregerings kapacitet, hvilket resulterede i et fald i størrelse over tid (fra 135,5 μm til 99,8 μm)21,22. Derfor er stivhed af sfæroide også steget fra 5,0 x 10-3 til 7,5 x 10-3 PA22. Men stivhed af sfæroider bestående af en heterotypisk population af CAFs og AsPC-jeg kan besidde mekaniske egenskaber og stivhed værdier forskellig fra dem af homospheroider lavet af en enkelt population af fibroblaster/CAFs. Dette er stadig ukendt og kan være anderledes end hvad der blev beskrevet af Ito et al22. Stivheden afhænger også af mængden og den tværgående sammenkædning af celle producerede og deponerede ECM, på de forskellige celle celle interaktioner inden for sfæoprogrammet, på antallet af celler i sfæoprogrammet eller på kulturens varighed.

Som enhver anden model, omfatter det eksperimentelle design nogle variabler, der har brug for optimering såsom antallet af celler, som er nødvendige for at danne sfæroider, tidspunkter for behandling og mikroskopisk billeddannelse. Det beskrevne eksperimentelle design blev optimeret med det formål at have en kugleformet størrelse, som ville have minimal indflydelse på udbredelsen af næringsstoffer og ilt, da der er en diffusions grænse på grund af masse transport begrænsninger9. For eksempel, transport af ilt i sfæroider med en størrelse større end 150-200 μm påvirkes betydeligt, samt diffusion af glucose og laktat, i aggregater større end 300 μm9,18. Sfæroider med diametre større end 400-500 μm præsenterer sædvanligvis en koncentrisk lagdelt struktur bestående af en nekrotisk kerne omgivet af et levedygtigt lag af selvlysende celler og en ydre rand af prolifererende celler9,24. For at undgå den begrænsede udbredelse af forbindelser, og for at eliminere problemet med den utilgængelige sfæide kerne, blev cellerne behandlet med TGF-β1, BM2 og lebein-1 før sfæroide dannelse, når cellerne er individuelt suspenderet i sfæroide formation opløsning. For at tillade tilgængeligheden af ilt og næringsstoffer til de fleste af cellerne i sfæroide og for at forhindre dannelsen af en nekrotisk kerne blev antallet af celler pr. sfæroide desuden reduceret til 750-1000 celler, som danner sfæroider med en diameter på 140-200 μm.

Det er vigtigt grundigt at blande de forskellige celletyper i sfæroide-dannelses opløsningen, så sfæroderne er sammensat af omtrent det samme antal celler, så der undgås signifikante størrelsesforskelle mellem sfæroider. Ikke desto mindre, nogle gange nogle sfæroider kan være lidt større end den anden, og det vil resultere i flere Z-stakke erhvervet i mikroskop. Nogle sfæroider kan også afvige fra den perfekt sfæriske form, men det tages også i betragtning, når svalerens ROI er afgrænset. Disse forskelle i størrelse og form er medregnet i de normaliserede kvantificerings værdier som forklaret i næste afsnit. En anden vigtig faktor med hensyn til formen af sfæroide er celle typen. For eksempel, fibroblaster og cafs danner sfæroider med en næsten sfærisk form, mens aspc-i og Panc-i celler danner en mere sprede aggregat af celler.

Til billeddannelse af sfæroider, kan kryosektioner af faste sfæroider også anvendes, men integriteten af sfæroide kan være kompromitteret ved skæring, afhængigt af celletype og immunofarvning protokol. Alternativt, farvning af hele sfæroide i sin 3D-struktur, viste sig at være en enklere løsning. Erhvervelse af mikroskopiske Z-stablede billeder af sfæroide som en 3D-struktur tager i gennemsnit 5-15 min per sfæroide.

De immunfluorescent signaler i billeder af sfæroider er svære at kvantificere, da de repræsenterer fly af 3D-strukturer. Den anvendte metode var baseret på en tidligere beskrevet en, hvor forfatterne ekstrpolerede og betragtede sfæroide at være en celle14. På denne måde korrigeres fluorescens signalet ved hjælp af ligning 1.

Som baggrund blev den integrerede signal tæthed for en celle fri interesseregion (ROI) fastlagt. Den målte integrerede signal tæthed er summen af intensitetsværdierne for pixels inden for det valgte ROI. Da sfæroider er 3D-strukturer, erhverves konfokale billeder fra forskellige stakke. For at behandle sådanne billeder kan man måle det fluorescerende signal i hver stak enkeltvis eller bruge summen af alle stakke i en Z-projektion. Alle kvantifikationer kan udføres ved hjælp af ImageJ. Den totale korrigerede fluorescens (TCF) af sfæroider bestemmes som den normaliserede tccf, i betragtning af området sfæroide og antallet af stakke, ved hjælp af ligning 2. Dette tegner sig for de varierende størrelser af sfæroider og uoverensstemmelsen i den sfæriske form. Analyse af immunfluorescent farvning af sfæroider ved hjælp af denne metode kan tage op til 5 min per spheroid.

Tilsvarende, invasion af celler fra sfæroider i den omgivende stromale matrix kan analyseres ved forskellige algoritmer. En enkel metode blev tidligere beskrevet af Nowicki et al, hvor de invasive cancerceller blev talt23. For at diskriminere de invasive celler fra dem, der ikke invaderer, er det vigtigt at etablere en geografisk grænse, ud over hvilken cellerne anses for at have forladt sfæroide-strukturen. Derfor er udgangspunktet den grænse, der svarer til omkredsen af de sfæroide-billeder, som er erhvervet ved det første tidspunkt (tid 0), hvor sfæroderne blev indlejret i gelen. Cellen, der invaderer gelen længst betragtes som den maksimale afstand en invasiv celle kan nå, og dermed, det definerer den ydre rand af invasionen regionen. Denne metode tæller de invasive cancerceller, der er til stede i invaderende område, ved hjælp af tælleværktøjet fra ImageJ, og ROI svarende til sfæroide på tidspunktet 0 h er føjet til ROI Manager og derefter omsat til billedet af samme eksakte sfæid erhvervet 48 h eller 72 h senere. Af denne grund er det vigtigt, at sfæroide forbliver så tæt på midten af flyene som muligt, i de forskellige tidspunkter for erhvervelse. Optælling af antallet af celler kan tage op til 5 min per spheroid.

En anden vigtig overvejelse er at skelne mellem de forskellige celletyper i heterospheroid. Dette kan udføres ved hjælp af levende celle fluorescerende farvestoffer, som kan være problematisk, når cellen type har en høj celle division sats, eller hvis forsøget skal udføres i lange perioder. Den mere robuste og pålidelige måde at skelne mellem de to forskellige populationer på er ved at udvikle cellelinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner som mCherry og GFP. Levering af udtryks vektorer kan udføres ved hjælp af lentivirus, hvilket resulterer i stabile udtryk af disse proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Dette materiale afspejler kun forfatterens synspunkter, og den Europæiske Union er ikke ansvarlig for enhver brug, der måtte blive gjort af de deri indeholdte oplysninger.

Acknowledgments

Vi anerkender Barbara Schedding ' s hjælp til at forberede BM2 og lebein-1. Vi anerkender àgnes Noel for at dele sin ekspertise i sfæroide assays. Vi takker Sonja schelhaas og Michael Schäfers for deres hjælp til at håndtere lentiviral transfektering under S2-betingelser. Vi anerkender Sabine von Rüden's assisteni at forberede CAFs fra bugspytkirtel Cancer væv.

Den forskning, som fører til disse resultater, har modtaget støtte fra People-programmet (Marie Curie-aktioner) i eu's syvende rammeprogram for RP7/2007-2013/i henhold til den fælles tilskudsaftale n ◦ (316610) til J.A.E. Desuden blev J.A.E. og A.C.M.C. finansielt støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inden for celle-in-Motion-klynge af topkvalitet (EXC 1003-CiM). Projektet blev også støttet af Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 til J.A.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) SIGMA-ALDRICH D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
Acetone SIGMA-ALDRICH 32201
Albumin Fraction V - BSA AppliChem A1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse Invitrogen A11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit Invitrogen A11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) Santa Cruz sc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 Millipore AB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) SIGMA-ALDRICH C6198
AsPC-1 cell line ATCC Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifuge Fisher Scientific 50-589-620 Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2) Fluka 21074
Centrifuge Thermo Scientific Multifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mL Corning 430290
Collagenase B Roche 11088831001
Collagen-I, rat tail Gibco A10483-01
Confocal microscope Zeiss LSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L) Lonza BE12-604F
Dnase I Roche 10104159001
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCaliburTM
Gelifying matrix ThermoFisher Scientific A1413202 Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotype DAKO X 0907
Horse Serum SIGMA-ALDRICH 12449-C
Human Primary Pancreatic Fibroblasts PELOBiotech PB-H-6201
Incubator Heraeus B6060
Laminin-332 Biolamina LN332
MEM SIGMA-ALDRICH M4655
Microplate, 96 wells, U-bottom Greiner Bio-One 650101
Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Mouse IgG, isotype SIGMA-ALDRICH I8765
Multi axle rotating mixer CAT RM5 80V
PANC-I ATCC Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
Paraformaldehyde Riedel-de Haën 16005
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
QuantiTect Reverse Transcription Kit Qiagen 205310
Rat IgG, isotype Invitrogen 10700
Reaction tubes, 1.5 mL Greiner Bio-One 616201
Real-time PCR cycler Qiagen Rotor-Gene Q
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074
RPMI Lonza BE12-702F Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100 SIGMA-ALDRICH X100RS
Vórtex Scientific Industries Vortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoated Ibidi 81501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

Tags

Kræftforskning sfæroider CAF 3D model differentiering immunfluorescent farvning qPCR flow cytometry invasion ekstracellulær matrix gel
En 3D Spheroid model som et mere fysiologisk system for kræft-associeret fibroblaster differentiering og invasion in vitro undersøgelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D… More

Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (150), e60122, doi:10.3791/60122 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter