Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

Het doel van dit protocol is het kwantificeren van binding van de eukaryotische pathogene menselijke norovirus aan bacteriën. Na het uitvoeren van een eerste virus-bacterie gehechtheid test, flow cytometrie wordt gebruikt om viraal gebonden bacteriën te detecteren binnen de bevolking.

Abstract

Commensale bacteriën zijn goed ingeburgerd om infectie van eukaryotische virussen beïnvloeden. Directe binding tussen de ziekteverwekker en het gastheermicrobioom is verantwoordelijk voor het veranderen van infectie voor veel van deze virussen. Dus, het karakteriseren van de aard van virus-bacteriën binding is een fundamentele stap die nodig is voor het verduidelijken van het mechanisme (en) waardoor bacteriën veranderen virale infectie. Voor menselijke norovirus, commensal bacteriën verbeteren B-cel infectie. Het virus bindt zich direct aan deze bacteriën, wat aangeeft dat deze directe interactie betrokken is bij het mechanisme van infectieverbetering. Een verscheidenheid van technieken kan worden gebruikt om interacties tussen bacteriën en virussen te kwantificeren, waaronder scintillatie tellen van radioactief gelabelde virussen en polymerase kettingreactie (PCR). Beide methoden vereisen het gebruik van levend virus, dat mogelijk in het laboratorium moet worden gegenereerd. Momenteel is geen van de gevestigde in vitro cultuur systemen beschikbaar voor menselijk norovirus zijn robuust genoeg om te kunnen genereren van zeer geconcentreerde virale voorraden. In plaats van levend virus, virus-achtige deeltjes (VLP's) zijn gebruikt om de interacties tussen norovirus en bacteriën te karakteriseren. Hierin wordt een stroomcytometriemethode beschreven met gebruiksvirusspecifieke antilichamen om VLP-binding te kwantificeren tot gramnegatieve en grampositieve bacteriën. Opname van zowel bacteriën alleen en isotype controles toegestaan voor optimalisatie van de test te verminderen achtergrond antilichaam binding en nauwkeurige kwantificering van VLP gehechtheid aan de geteste bacteriën. Hoge VLP:bacterie ratio's resulteren in VLP's binding aan grote percentages van de bacteriële populatie. Echter, wanneer VLP hoeveelheden worden verminderd, het percentage van de bacteriën gebonden ook afneemt. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt in toekomstige experimenten die de specifieke omstandigheden en structurele componenten verduidelijken die norovirus:bacteriële interacties reguleren.

Introduction

Menselijke norovirussen (HuNoVs) zijn de belangrijkste oorzaak van gastro-intestinale ziekte wereldwijd, verantwoordelijk voor 685 miljoen infecties en meer dan 200.000 sterfgevallen per jaar1. Net als bij andere darmvirussen is aangetoond dat de aanwezigheid van commensale bacteriën de infectie van deze ziekteverwekker en het surrogaatvirus, het murine norovirus2,3,verbetert. Er zijn ook tegenstrijdige berichten dat bacteriën infectie door menselijk norovirus4,5,6kunnen remmen. Voor verschillende virussen lijkt directe interactie tussen het virus en bacteriën ten grondslag te liggen aan de mechanismen die van invloed zijn op virale infectie2,7,8,9,10, en het is aangetoond door middel van elektronenmicroscopie dat menselijke norovirussen zich rechtstreeks binden aan de oppervlakken van bacteriën11,12. Daarom is het karakteriseren van deze interacties van cruciaal belang geworden voor het bepalen van de mechanismen waarmee bacteriën een virale infectie beïnvloeden. Deze karakterisering is klassiek begonnen met het kwantificeren van virale binding aan een reeks bacteriële soorten die componenten zijn van het gastheermicrobioom7,12,13. Deze gehechtheid stoomt niet alleen de hoeveelheid virus gebonden aan bacteriën, maar ook hulp bij het bepalen van de impact van deze interactie op virale fitness en overleving.

Om virale gehechtheid te kwantificeren, omvatten traditioneel gebruikte methoden PCR-gebaseerde tests die virale genomenkwantificeren 12 of het genereren van radioactief gelabeld virus en het gebruik van scintillatietelling om virale deeltjes te kwantificeren7,8,9,13. Het gebruik van deze methoden vereist over het algemeen toegang tot hoog-titer virus voorraden en in vitro teelt technieken waarmee ze te genereren. Hoewel verschillende kweeksystemen voor menselijk norovirus nu bestaan2,14,15, geen ondersteuning voor de robuuste replicatie die nodig is om deze sterk geconcentreerde voorraden die beperkt of elimineert het gebruik van PCR en scintillatie tellen om menselijke norovirus / bacteriële interacties te kwantificeren genereren.

Om dit probleem te omzeilen, kunnen virusachtige deeltjes (VLP's) worden gebruikt als een surrogaat om te leven virus om interacties tussen menselijk norovirus en bacteriën16,17te onderzoeken. VLP's zijn niet-besmettelijke deeltjes die sterk lijken op het virus waaruit ze zijn afgeleid. In het geval van menselijk norovirus worden deze deeltjes gegenereerd uit de expressie van het VP1 -eiwit (en soms het VP2)-eiwit, dat zichzelf assembleert om intacte virale capsids te creëren zonder genetisch materiaal (d.w.z. RNA voor norovirussen). Deze VLP's zijn goed gekarakteriseerd, zijn structureel en antigenisch vergelijkbaar met de wilde virussen waaruit ze zijn afgeleid18,19,20,21,22,23. Daarom dienen VLP's als een ideale surrogaat voor het onderzoeken van de oppervlakteinteracties tussen menselijk norovirus en commensale bacteriën. Aangezien VLP's geen genetisch materiaal hebben, kunnen pcr-gebaseerde tests niet worden gebruikt om virale binding te kwantificeren. Een op antilichamen gebaseerde stromingscytometriemethode werd eerder beschreven en in staat om lage niveaus van VLP-binding met bacteriën op een semi-kwantitatieve manier te detecteren16. Deze methode werd geoptimaliseerd om nauwkeurige kwantificering van het menselijk norovirus VLP binding aan zowel gram-negatieve en gram-positieve commensal bacteriën16mogelijk te maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: De bacteriële groeivoorwaarden die in het protocol worden beschreven, zijn standaardkweekcondities voor Enterobacter cloacae en Lactobacillus gasseri. Om de virus:bacteriën gehechtheid test uit te voeren met andere bacteriële soorten, moet de gekozen bacteriën worden gekweekt onder standaard omstandigheden die geschikt zijn voor de bacterie.

1. Voorbereiding van bacteriële groei medium

  1. Enterobacter cloacae groei media
    1. Bereid vloeibaar medium voor door 10 g trypton, 5 g gistextract en 10 g natriumchloride (NaCl) op te lossen in 1 L gedeïoniseerd (DI) water (zie Tabel van materialen). Meng alle media grondig en steriliseren door autoclaving voor 30 min.
    2. Bereid vast medium door het oplossen van 10 g trypton, 5 g gistextract, 10 g NaCl, en 15 g agar in 1 L van DI water. Meng alle media grondig en steriliseren door autoclaving voor 30 min.
  2. Lactobacillus gasseri groei media
    1. Bereid vloeibaar medium door het oplossen van 55 g Van De Man, Rogosa en Sharpe (MRS; zie Tabel van materialen)poeder in 1 L van DI water. Gebruik medium binnen een maand na de voorbereiding. Om te steriliseren, verwarm medium gedurende 15 minuten tot het koken, gevolgd door autoclaven gedurende 15 min.
    2. Bereid vast medium door het oplossen van 55 g MRS poeder en 15 g agar in 1 L van DI water. Om te steriliseren, verwarm medium gedurende 15 minuten tot het koken, gevolgd door autoclaven gedurende 15 min.

2. Vaststelling van een standaardcurve correlerende optische dichtheid (OD) en bacterieconcentratie

  1. Inenting van 5 mL van het juiste vloeibare medium met een enkele, geïsoleerde kolonie van een agarplaat (E. cloacae) of rechtstreeks uit bevroren glycerolvoorraad (L. gasseri).
  2. Laat de bacterie 's nachts groeien, onder goede atmosferische omstandigheden (Enterobacter cloacae: 37 °C met aërobe schudden bij 200 rpm; L. gasseri: 37 °C waterbad zonder schudden in een luchtdichte container).
  3. Breng 2 x 1,3 mL aliquots van 's nachts cultuur in twee afzonderlijke 1,5 mL centrifuge buizen en centrifuge bacteriën op 10.000 x g gedurende 5 min.
  4. Verwijder de supernatant en was monsters met 1 mL steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal deze wasstap voor een totaal van 2 wasbeurten.
  5. Centrifugeer de monsters opnieuw op 10.000 x g gedurende 5 min, verwijder de supernatant en laat de monsters opnieuw opschorten in 1,3 mL steriele 1x PBS.
  6. Te beginnen met 0,5 mL gewassen cultuur, seriële verdunnen van de bacteriën in 1x PBS van 10-1 tot 10-4.
  7. Met behulp van een spectrofotometer meet u de optische dichtheid van de gewassen, onverdunde cultuur en elk van de vier verdunningen op 600 nm (OD600).
  8. Voer 10-voudige seriële verdunningen uit in 1x PBS voor elke verdunning vanaf stap 2.6. Spreadplaat 100 μL van de laatste 3 verdunningen voor elke serie op het juiste vaste medium om het aantal kolonievormende eenheden per milliliter (CFU/mL) van elk monster te bepalen. Verguld elke verdunning in drievoud.
  9. Laat de platen 5 min drogen bij kamertemperatuur. De platen omkeren en incuberen onder de juiste atmosferische omstandigheden (E. cloacae: aërobe bij 37 °C, 's nachts incuberen platen; L. gasseri: anaerobe bij 37 °C, incubeerplaten voor 48 uur in een luchtdichte container met anerobic luchtzakjes (zie Materiaaltafel)).
    LET OP: Gebruik 1 anaerobe luchtzakje per pot van 2,5 L of 3 zakjes per pot van 7,0 L (zie Materiaaltafel).
  10. Gebruik plaattellingen om CFU/mL te bepalen voor elk van de 5 monsters (d.w.z. onverdund, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Genereer een standaardcurve waarbij OD600 vs CFU/mL worden vergeleken. De vergelijking voor deze lijn zal worden gebruikt in VLP-bacteriën bevestiging ssays om CFU / mL te bepalen op basis van OD600.

3. VLP-bacteriën Attachment Assay

LET OP: Human norovirus VPP's zijn een bioveiligheidsniveau (BSL)-2 gevaar en al het werk met vlp's moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast. De voorbereiding van de bacteriële culturen, voorafgaand aan de bevestigingstest, moet worden uitgevoerd met behulp van veiligheidsomstandigheden die geschikt zijn voor het organisme.

  1. Reagensbereiding
    1. 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
      1. Bereid 1 L van 10x PBS door het oplossen van een heel pakket in 1 L DI water.
      2. Autoclave oplossing voor 30 min.
      3. Bereid een 1x oplossing door verdunnen van de bovenstaande oplossing 1:10 in DI water.
      4. Filter steriliseer de oplossing door het passeren van een 0,22 μm filter en op te slaan bij kamertemperatuur.
    2. 5% BSA
      1. Voeg 5 g runderserumalbumine (BSA) poeder toe aan 100 mL PBS om een 5% (w/v) oplossing te genereren.
      2. Meng oplossing door vortexing of op een roerplaat met behulp van een metalen roerstaaf tot klonten zijn opgelost.
      3. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 μm filter.
      4. Bewaar de oplossing op 4 °C.
    3. Flow cytometrie vlek buffer (FCSB)
      1. Filter gekocht FCSB (zie Tabel van materialen) door middel van een 0,22 μm filter.
      2. Bewaar de resterende oplossing bij 4 °C.
    4. 5% Blokkeringsbuffer (BB)
      LET OP: Bereid elke keer vers voor.
      1. Voeg 0,5 g BSA toe tot 10 mL steriele FCSB.
      2. Vortex om monster volledig te mengen en laat op ijs tot gebruik.
  2. Antilichaamvervoeging
    1. Conjugaat menselijk norovirus GII antilichaam (zie Tabel van materialen) met r-phycoerythrin (PE) met behulp van een R-PE antilichaam etikettering kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel van materialen).
    2. Bewaar het geconjugeerde antilichaam in het donker bij 4 °C voor toekomstig gebruik in de Testanalyse van de VLP-bacterie.
      OPMERKING: Het primaire antilichaam moet vóór gebruik in de vlp-bacteriebevestigingstest worden getitreerd om de juiste concentratie te bepalen die nodig is voor de analyse van de cytometrie. Antilichaamtitratie moet worden uitgevoerd elke keer dat de vervoegingsreactie wordt uitgevoerd en voor elke bacterie die in de bevestigingstest wordt gebruikt.
  3. Antilichaam titratie
    1. Verdun het geconjugeerde anti-menselijke norovirus GII-antilichaam 100-voudig, met een beginnende verdunning van 1:100 en een eindigende verdunning van 1:600 (zes verdunningen in totaal).
    2. Voer een virusbevestigingstest uit zoals hieronder beschreven met de volgende uitzondering: in stap 3.5.7 de bacteriële pellet opnieuw opschorten in 350 μL van 5% BB.
    3. Verdeel het monster in zeven aliquots van 50 μL.
    4. Voeg 50 μL van elke verdunning van antilichamen toe aan één buis.
    5. Voeg 50 μL van 5% BB toe aan de zevende buis als onbevlekte controle.
    6. Voercytometrie uit op alle monsters zoals hieronder beschreven.
    7. Vergelijk verdunde antilichamenmonsters met onbevlekte controles en met elkaar. De laagste antilichaamconcentratie die niet leidt tot een afname of verlies van positief signaal moet worden gekozen voor gebruik in de daaropvolgende tests.
  4. Bereiding van bacteriën
    1. Kweek de bacteriën in 40 mL van de juiste vloeibare medium onder de juiste atmosferische omstandigheden totdat de bacteriën in stationaire fase.
      1. Grow E. cloacae culturen aërobe 's nachts in Luria Bouillon op 37 °C, schudden bij 200 rpm te bereiken stationaire fase.
      2. Grow L. gasseri culturen in MRS bouillon in zwarte schroefdop buizen zonder te schudden in een waterbad ingesteld op 37 °C voor 18 uur om stationaire fase te bereiken.
    2. Breng stationaire faseculturen over om 50 mL conische buizen schoon te maken en centrifugemonsters op 2.288 x g gedurende 10 min om de bacteriën te pelleten.
    3. Verwijder de supernatant en resuspend in 13 mL van steriele 1x PBS. Herhaal deze wasstap voor in totaal twee wasbeurten.
    4. Centrifugeer de monsters opnieuw, verwijder de supernatant en schort de monsters opnieuw op in 20 mL van 1x PBS.
      OPMERKING: Als de celpellet klein is, kan het resuspensievolume worden verminderd.
    5. Meet OD600 van de cultuur.
    6. Bepaal met behulp van de eerder geprepareerde standaardcurve de CFU per mL van de gewassen cultuur.
    7. Verdun de bacteriën indien nodig met 1x PBS om de kweekconcentratie aan te passen aan 1 x 108 CFU/mL.
    8. Breng 1 mL van de 1 x 108 CFU/mL bacteriële kweek over op het vereiste aantal centrifugebuizen van 1,5 mL.
    9. Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 5 min.
    10. Resuspend de bacteriële pellet in 1 mL van steriele 5% BSA.
    11. Incubeer de buizen gedurende 1 uur bij 37 °C met constante rotatie.
  5. Virusbijlage
    1. Als u in een BSL-2 bioveiligheidskast werkt, voegt u 10 μg HuNoV VPP (zie Materiaaltafel)toe aan elke buis met bacteriën die in PBS zijn geresuspendeerd en meng grondig door te paien.
      OPMERKING: De VLP-concentratie verschilt per VLP-preparaat. Daarom zal het volume dat aan bacteriën wordt toegevoegd, variëren tussen bereidingspartijen en moet deze neigen worden aangepast, zodat 10 μg aan elke buis in het experiment wordt toegevoegd. Voor alleen bacteriën controles (bijvoorbeeld monsters zonder VLP), voeg een volume van PBS dat gelijk is aan het volume van VLP toegevoegd aan experimentele monsters.
    2. Uitbroedbuizen gedurende 1 uur bij 37 °C met constante rotatie.
      OPMERKING: Een buisrevolver (zie Tabel van materialen)ingesteld op 40 rpm wordt gebruikt tijdens de incubatie.
    3. Centrifugeer de monsters na incubatie op 10.000 x g gedurende 5 min.
    4. Gooi supernatant en resuspend bacteriële pellet in 1 mL van PBS.
    5. Herhaal de wasstappen 3.5.3 en 3.5.4.
    6. Centrifugeer de monsters op 10.000 x g gedurende 5 min.
    7. Gooi supernatant weg en stouw bacteriële pellet in 150 μL van 5% BB.
  6. Antilichaam kleuring
    1. Bereid vers 5% BB.
      OPMERKING: Al het werk met behulp van het fluorescerende gelabelde antilichaam moet in het donker worden uitgevoerd en het antilichaam, BB en FCSB moeten in het ijs worden gehouden.
    2. Verdun menselijk norovirus GII-antilichaam 1:125 voor E. cloacae-monsters en 1:150 voor L. gasseri-monsters in 5% BB, waarbij 50 μL verdund antilichaam per monster wordt voorbereid.
    3. Verdun het isotype-antilichaam op dezelfde manier het menselijk norovirus GII-antilichaam werd voor elke bacterie verdund in 5% BB, waardoor 50 μL verdunde isotypecontrole per monster werd voorbereid.
    4. Verdeel elk bevestigingsmonster van stap 3.3.7 in drie aliquots van 50 μL door ze over te brengen in schone centrifugebuizen van 1,5 mL.
    5. Voeg aan de eerste set monsters 50 μL BB toe. Deze set is de unstained (Uns) controls.
    6. Voeg in de tweede set 50 μL van de GII-antilichaamverdunning toe. Dit resulteert in een laatste antilichaamconcentratie van 1:250 voor E. cloacae en 1:300 voor L. gasseri. Deze monsterset zijn de stalen (AB).
    7. Voeg in de derde set 50 μL van het verdunde isotype-antilichaam toe. Deze set is de isotype controls (IC). Meng goed door pipetteren. Incubeer de monsters op ijs en in het donker gedurende 30 min.
    8. Centrifugeer alle monsters op 10.000 x g gedurende 5 min.
    9. Gooi de supernatant weg en hang de monsters opnieuw op in 100 μL FCSB.
    10. Centrifugeer alle monsters op 10.000 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg en stouw de monsters opnieuw op in 100 μL FCSB.
    11. Centrifugeer alle monsters op 10.000 x g gedurende 5 min.
    12. Gooi de supernatant weg en hang de monsters opnieuw op in 150 μL FCSB.
    13. Breng elk monster over naar een FCSB-buis met 400 μL FCSB-buffer voor een totaal volume van 550 μL.
    14. Bewaar de monsters op 4 °C totdat ze worden geanalyseerd door stroomcytometrie.
      LET OP: Flow cytometrie wordt uitgevoerd binnen 4 uur van antilichaam kleuring.

4. Stroomcytometrie

OPMERKING: De hieronder beschreven spanningsinstellingen zijn gebaseerd op de stroomcytometer en software die in de materiaaltabel worden vermeld en zullen waarschijnlijk variëren met verschillende stroomcytometers. Instellingen moeten worden geoptimaliseerd voor elke bacterie. Zorg ervoor dat de assen voor alle grafieken zich in een biexponentiële fase bevinden.

  1. De werkruimte instellen
    OPMERKING: De set-up voor percelen die worden gebruikt om de werkruimte vast te stellen, verschilt van de standplaatsen die worden gebruikt bij gating en gegevensanalyse. Het doel van het opzetten van de werkruimte is om de celpopulatie te visualiseren, ervoor te zorgen dat er geen overmatige klontering van de bacteriële cellen is die van invloed kunnen zijn op de downstream-analyse en om onderscheid te maken tussen gekleurde en niet-gekleurde cellen terwijl gegevens worden verzameld.
    1. Om ervoor te zorgen bacteriën niet samenklonteren, het opzetten van een reeks dichtheid percelen.
      1. Genereer een voorwaarts strooigebied (FSC-A) versus zijverstrooiingsgebied (SSC-A) om de totale populatie te visualiseren.
      2. Stel percelen in om afzonderlijke cellen versus celklonten te evalueren door twee grafieken te maken die zowel voorwaartse (FSC-W) als zijverstrooibreedte (SSC-W) vergelijken met respectievelijk voorwaartse (FSC-H) als zijverstrooiingshoogte (SSC-H).
      3. Maak een plot dat alleen de PE positieve populatie laat zien (PE-A vs. SSC-A).
    2. Stel de basislijnspanning in op 500 voor E. cloacae en 340 voor L. gasseri. Deze zullen later verder worden aangepast.
    3. Stel het totale aantal gebeurtenissen in op 10.000 gebeurtenissen.
  2. Monsters uitvoeren
    1. Maak drie afzonderlijke histogrampercelen die het aantal tonen dat is uitgezet tegen SSC-A, FSC-A of PE-A.
    2. Plaats een onbevlekt monster op de stroomcytometer en verkrijg de monstergebeurtenissen, zodat de maximale piek op het histogram voor SSC-A binnen 102 tot 103 ligt en de maximale piek op het histogram voor FSC-A tussen 104 en 105 op de x-as ligt. Zo niet, dan vallen pieken niet binnen de opgegeven bereiken, pas dan de FSC- en SSC-spanningen dienovereenkomstig aan.
    3. Plaats een gekleurd monster (AB) op de stroomcytometer en pas de spanning PE om de maximale piek voorbij 103 op de x-as te maken.
    4. Stel op basis van deze metingen de positieve PE-poort in en zet de poort in op de PE-A versus SSC-A dichtheidsgrafiek.
    5. Voer alle monsters uit onder de bepaalde instellingen bij lage of gemiddelde snelheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De gatingstrategieën die worden gebruikt om het menselijk norovirus VLP te kwantificeren dat bindt aan commensale bacteriën, worden weergegeven in figuur 1. Representatieve dichtheidstip geeft een overzicht van hoe monsters werden afgesloten om celafval en celklonters te elimineren, zodat VLP-bevestiging werd bepaald op enkele populaties (figuur 1A). Representatieve histogrammen tonen lage niveaus van anti-norovirus antilichaam signaal in bacteriën alleen monsters ontbreekt norovirus VLP en lage achtergrond signaal van VLP-bacteriën monsters gekleurd met de isotype controle antilichaam (Figuur 1B). Isotype controle pieken ook overlappen met niet-gekleurde monsters, terwijl vlekken van dezelfde monsters met anti-menselijke norovirus GII antilichaam resulteert in significante verschuiving in de piek.

De Overton-methode van histogram aftrekken werd gebruikt om de PE-positief signaal in anti-menselijke norovirus GII antilichaam gekleurdmonsters te vergelijken met de PE-positief signaal van de overeenkomstige isotype controle en bepalen het percentage van de bacteriële populatie gebonden door menselijke norovirus VLPs (Figuur 1B). Na 1 uur incubatie met 10 μg VLP, stroomcytometrie gedetecteerd deeltjesbinding aan zowel E. cloacae en L. gasseri (figuur 2). In feite, hoge niveaus van binding opgetreden onder deze omstandigheden voor beide bacteriën; binding met L. gasseri vond plaats op een iets hoger, maar significant (p < 0,0001), niveaus in vergelijking met E. cloacae. Deze tests tonen aan dat flow cytometrie kan worden gebruikt om menselijke norovirus binding aan zowel Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën op te sporen.

Om de grens van bindende kwantificering voor deze test te bepalen, werd een verdunningsreeks van de VLP's gegenereerd voordat de bacteriën werden toevoeging (figuur 3). Voor beide geslachten van bacteriën, verminderingvan de hoeveelheid VLP toegevoegd aan de bacteriële cultuur resulteerde in overeenkomstige verminderingen van het percentage bacteriën gebonden door VLP. Veranderingen in het percentage van E. cloacae gebonden door het deeltje waren geleidelijker in vergelijking met L. gasseri, maar procent gehechtheid voor beide bacteriën afgevlakt ondanks verdere vermindering van de VLP concentratie. Specifiek, 0,1 μg of minder (gegevens niet weergegeven) van VLP in 108 CFU van bacteriën resulteerde in een plateau van procent en bevestiging gemiddeld tussen 13-19% voor beide bacteriën, wat aangeeft dat dit percentage is de limiet van kwantificering voor deze test.

Figure 1
Figuur 1: Representatieve stroomcytometrische analyse van menselijk norovirus VLP binding. (A) Representatieve stroomcytometrie gating strategie om VLP binding voor bacteriën te kwantificeren. Dichtheid percelen werden gebruikt om de poort uit cellulaire puin, gevolgd door de daaropvolgende dot plot gating om bacteriële doubletten en cellulaire klonten te verwijderen. BB) Representatieve histogrammen tonen een gebrek aan PE-signaal in bacteriële monsters en een verschuiving in pe-signaalintensiteit in VLP:bacteriemonsters in vergelijking met niet-bevlekte en isotypecontroles. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: VLP-bijlage bij E. cloacae en L. gasseri. 's Nachts werden de culturen van E. cloacae (n = 6) en L. gasseri (n = 6) verdund tot 1 x 108 CFU/mL in PBS. De bacteriën werden geïncubeerd met 10 μg GII.4 VLP's voor 1 uur en vervolgens werd VLP-bevestiging gemeten met behulp van flowcytometrie. Een representatief waarnemingspunt is te vinden in figuur 1B. Procent bevestiging werd bepaald met behulp van de Overton methode van histogram aftrekken vergelijken van de PE-positief signaal van de GII Human Norovirus gekleurd monsters aan de PE-positief signaal van de overeenkomstige isotype controle. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde Student's t-test (p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: VLP verdunningsserie voor E. cloacae en L. gasseri. 10 μg GII.4 VLP's werden seriële verdund en de VLP-verdunningen werden elk toegevoegd aan 1 x 108 bacteriën in een eindvolume van 1 mL (n = 3 voor beide bacteriën). De monsters werden gedurende een uur geïncubeerd bij 37 °C. VLP gehechtheid aan de bacteriën werd gemeten met behulp van flow cytometrie. Procent bevestiging werd bepaald met behulp van de Overton methode van histogram aftrekken vergelijken van de PE-positief signaal van de GII Human Norovirus gekleurd monsters aan de PE-positief signaal van de overeenkomstige isotype controle. Het verminderen van inputhoeveelheden van VLP resulteerde in stapsgewijze verlagingen van het percentage bevestiging voor zowel (A) E. cloacae en (B) L. gasseri. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mogelijkheid om de binding van enterische virussen aan bacteriën te kwantificeren is een kritieke eerste stap voor het verduidelijken van de mechanismen waarmee deze bacteriën virale infectie veranderen. De hierbeschreven methoden zijn geoptimaliseerd om menselijke norovirus VLP interacties te meten met zowel E. cloacae (gram-negatieve bacterie) als L. gasseri (een grampositieve bacterie), maar kunnen worden aangepast voor gebruik met elk zoogdiervirus en een bacterie van belang. Terwijl VLP's zijn een ideaal alternatief voor levend virus voor gebruik in gehechtheid assays en deze deeltjes kunnen gemakkelijk worden gekwantificeerd met behulp van flow cytometrie, P-deeltjes zijn ook gebruikt om interacties tussen menselijke norovirussen en bacteriën24te onderzoeken. In deze studie werd de hoeveelheid virus gebonden aan de bacteriën gekwantificeerd in tegenstelling tot de bacteriële populatie, zoals hier wordt gemeld. P-deeltjes bieden een voordeel ten opzichte van VLP's in die tijd dat ze gemakkelijker te produceren zijn en tegelijkertijd antigene gelijkenis bieden met zowel VLP's als wildvirus24,25. Echter, menselijke norovirus VLP's zijn commercieel beschikbaar het verstrekken van een middel voor laboratoria niet de capaciteit om VLP's of P-deeltjes te genereren. P-deeltjes verschillen van VLP's in dat, terwijl VLP's de grootte van een wild-type virale deeltje te handhaven, P-deeltjes zijn kleiner en hebben tetraëder in plaats van icosahedral symmetrie25. De impact van deze kenmerken op interacties met bacteriën zijn niet onderzocht en P-deeltjes kunnen dienen als een levensvatbaar alternatief voor VLP's in het karakteriseren van oppervlakteinteracties tussen menselijk norovirus en bacteriën.

Zoals eerder vermeld, de test hierboven beschreven kan worden gebruikt om verder te karakteriseren interacties tussen de menselijke norovirus VLP's en bacteriën. Onderzoeken naar hoe groeiomstandigheden en veranderingen in bacteriële oppervlaktestructuurexpressie virale binding veranderen, kunnen met behulp van deze techniek worden onderzocht. Bovendien kan deze test ook worden gebruikt om specifieke bacteriële structuren gebonden door het virus te bepalen door middel van concurrerende remming ssays met behulp van bacteriële eiwitten of glycanen, enzymatische behandeling om specifieke oppervlaktestructuren te verwijderen, of incubatie met mutantbacteriële stammen tekort in het bijzonder een structuur. Deze test kan ook worden gebruikt om het vermogen van andere norovirus stammen om te interageren met commensalbacteriën te onderzoeken.

Omdat deze test het aandeel van de bacteriële populatie gebonden door norovirus VLP kwantificeert, is het van cruciaal belang om de correlatie tussen CFU/mL en OD600 nauwkeurig te bepalen, zodat bacteriële kweekconcentratie kan worden gemeten. Fluctuaties in de VLP:bacteriën ratio verandert het percentage van de bacterie populatie gebonden door VLP's en kan leiden tot variabiliteit in de resultaten. Er moet ook voor worden gezorgd dat voldoende hoeveelheden virale deeltjes worden toegevoegd, aangezien de detectiegrens van deze test 0,1 μg VLP/108 CFU aan bacteriën nadert. Ratio's onder deze limiet leverden consequent procenten bevestigingswaarden op van 13-19%; aldus waargenomen bevolkingsgehechtheid bij of onder deze percentages kan niet echt zijn.

Antilichaam titraties werden uitgevoerd voor elk nieuw geconjugeerd antilichaam en tegen elke bacteriële stam voorafgaand aan het gebruik in VLP: bacteriën gehechtheid experimenten. Antilichaam concentraties die nodig zijn voor elke bacterie waren vergelijkbaar, variërend van 1:250 voor E. cloacae en 1:300 voor L. gasseri. De kleine omvang van bacteriën, ten opzichte van de grootte van eukaryotische cellen, vereist zowel spanningsaanpassing als het gebruik van een binomiale verdeling tijdens het verzamelen van gegevens om bacteriën adequaat te scheiden van puin dat in monsters kan worden aangetroffen of in het instrument circuleert. Na het verzamelen van gegevens, een goede gating kan worden gebruikt om verder te verwijderen grotere puin deeltjes en bacteriële klonten, zodat alleen eencellige populaties worden geanalyseerd. Het is ook van cruciaal belang om unieke spanningsinstellingen vast te stellen voor elke geteste bacteriesoort, omdat deze sterk fluctueren, met name tussen gramnegatieve en grampositieve bacteriën.

Het opnemen van de juiste controles, waaronder alleen bacteriën en isotypecontroles, is ook van cruciaal belang voor een nauwkeurige analyse van de gegevens. Beide soorten controles informeren over de niveaus van niet-specifieke antilichaambinding. Onze resultaten tonen aan dat de antilichamen die worden gebruikt om niet-specifiek aan de geteste bacteriesoorten te binden, maar niet-specifieke binding kan veranderen met veranderingen in bacteriële soorten of antilichamen.

De hier gepresenteerde methode kwantificeert menselijk norovirusdeeltje dat bindt aan zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën en is nuttig bij het karakteriseren van virus:bacteriële interacties. Bovendien kan dit basisprotocol gemakkelijk worden geoptimaliseerd voor gebruik met andere genotypen van menselijk norovirus, evenals andere zoogdiervirussen en -bacteriën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

We willen Sutonuka Bhar en Chanel Mosby-Haundrup bedanken voor hun kritische beoordeling van het geschreven manuscript, evenals Alfonso Carrillo voor hulp bij het genereren van bacteriële standaardcurves. Dit werk wordt mede gefinancierd door een subsidie van het National Institute of Health (R21AI140012) en door een seed subsidie van de University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

Tags

Immunologie en infectie nummer 158 menselijk norovirus enterische virusbacteriële interacties commensale bacteriën menselijke norovirus kwantificering menselijke norovirus detectie virus-bacteriën gehechtheid
Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madrigal, J. L., Jones, M. K.… More

Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter