Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת את הכריכה של הפתוגן איקריוטית האנושי הנגיף כדי חיידקים. לאחר ביצוע הראשונית וירוס חיידק הקובץ המצורף, הזרימה cy, לנסות לזהות חיידקים מאוגדים וירברית בתוך האוכלוסייה.

Abstract

חיידקים הקומנדסאל מבוססים היטב כדי להשפיע על זיהום של וירוסים איקריוטית. כריכה ישירה בין הפתוגן לבין microbiome מארח אחראי על שינוי זיהום עבור רבים מווירוסים אלה. כך, אפיון האופי של הכריכה של חיידקים וירוס הוא צעד היסוד הדרוש כדי להבהיר את המנגנון (ים) שבו חיידקים לשנות זיהום נגיפי. בחיידק האדם, חיידקי הקומנדסאל משפרים את הדלקת התאים B. הווירוס נקשר ישירות חיידקים אלה, המציין כי אינטראקציה ישירה זו מעורבת במנגנון של שיפור הזיהום. ניתן להשתמש במגוון טכניקות כדי לכמת את האינטראקציות בין חיידקים ווירוסים, כולל ספירת שרשרת וירוסים ותגובת שרשראות פולימראז (PCR). שתי השיטות מחייבות שימוש בווירוס החי, שייתכן שיהיה צורך ליצור אותם במעבדה. כיום, אף אחד הקים מערכות תרבות מבחנה זמין עבור norovirus אנושי חזקים מספיק כדי לאפשר דור של מניות ויראלי מרוכזת מאוד. במקום וירוס חי, חלקיקים כמו וירוס (האח מים) שימשו כדי לאפיין את האינטראקציות בין norovirus וחיידקים. בזאת שיטת הזרימה cy, מתוארת עם שימושים נוגדנים ספציפיים וירוס כדי לכמת את הכריכה של VIP לחיידקים גראם שליליים וגראם חיוביים. הכללה של שני חיידקים בלבד ו isotype מותר אופטימיזציה של הקביעה כדי להפחית את כריכת נוגדן הרקע וכימות מדויקת של המצורף VIP לחיידקים נבדק. אח מים גבוהה: יחסי חיידק התוצאה בכריכת אחמי ם לאחוזים גדולים של אוכלוסיית החיידקים. עם זאת, כאשר הכמויות של ה-VIP מופחת, אחוז החיידקים מאוגדים גם פוחתת. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה להיות מועסק בניסויים עתידיים להבהיר את התנאים הספציפיים ורכיבים מבניים המסדירים norovirus: אינטראקציות בקטריאלי.

Introduction

האדם noroviruses (HuNoVs) הם הגורם המוביל של מחלת העיכול ברחבי העולם, אחראי על 685,000,000 זיהומים ומעל 200,000 מקרי מוות בכל שנה1. כמו עם וירוסים אחרים חיטוט, הנוכחות של חיידקים המ, הוכח לשפר את הזיהום של הפתוגן הזה, כמו גם וירוס פונדקאית שלה, מורטין norovirus2,3. ישנם גם דיווחים סותרים כי חיידקים עשויים לעכב זיהום על ידי האדם norovirus4,5,6. עבור מספר וירוסים, אינטראקציה ישירה בין הנגיף לבין החיידקים מופיעים באופן מיני המנגנונים המשפיעים על זיהום נגיפי2,7,8,9,10, וזה הוכח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני כי noroviruses אנושיים לאגד ישירות על פני השטח של חיידקים11,12. לכן, אפיון אינטראקציות אלה הפכה לקריטית כדי לקבוע את המנגנונים שבהם החיידק משפיע על זיהום נגיפי. אפיון זה התחיל באופן קלאסי עם כבילה ויראלי הכריכה למערך של מינים חיידקיים, כי הם מרכיבים של המארחים מיקרובידום7,12,13. ההחזקה הזאת טוענת לא רק לחשוף את כמות הווירוס מאוגד חיידקים, אלא גם לסייע בקביעת ההשפעה של האינטראקציה הזאת על כושר והישרדות נגיפי.

כדי לכמת מצורף ויראלי, שיטות מועסקים באופן מסורתי כוללים מבוסס PCR המבוסס איזה מכמת ויראלי גנום12 או הדור של וירוס רדיויניום ושימוש בטעמים שונים לכמת חלקיקים ויראלי7,8,9,13. השימוש בשיטות אלה מחייב בדרך כלל גישה למניות וירוסים באיכות גבוהה ובטכניקות טיפוח-תרגול של מבחנה. בעוד מספר מערכות התרבות עבור norovirus האדם כעת קיימים2,14,15, ללא תמיכה שכפול חזק הנדרש כדי ליצור אלה מניות מרוכז מאוד אשר מגביל או מבטלת את השימוש ב-PCR ו הספירה לספור לכמת האנושית norovirus/אינטראקציות בקטריאלי.

כדי לעקוף בעיה זו, חלקיקים כמו וירוס (אחמי ם) ניתן להשתמש כפונדקאית כדי לחיות וירוס לחקור אינטראקציות בין האדם norovirus וחיידקים16,17. אחמי ם הם חלקיקים לא מדבקים הדומים מאוד לוירוס שממנו הם נגזרים. במקרה של norovirus אנושי, חלקיקים אלה מופקים מן הביטוי של VP1 (ומתישהו VP2) חלבון, אשר להרכיב את עצמי ליצור הקפיסידים ויראלי ללא פגע חסר חומר גנטי (כלומר, RNA עבור norovirus). האח מים האלה היו מאופיינים היטב, הם באופן מבנית ואנטי בדומה וירוסים בסוג פראי מהם הם נגזר18,19,20,21,22,23. לכן, אחמי ם משמשים כתחליף אידיאלי לחקירת האינטראקציות של פני השטח בין חיידקי הנגיף האנושי לבין חיידק הקומנדאני. , בהתחשב בעובדה שאין בנמצא חומר גנטי. מבוסס PCR לא יכול לשמש לכמת כריכה נגיפית מבוסס נוגדן זרימה cy, השיטה תוארה בעבר היה מסוגל לזהות רמות נמוכות של איגוד ה-VIP לחיידקים בדרך חצי כמותית16. שיטה זו היתה ממוטבת כדי לאפשר כימות מדויק של כריכת האח מים של norovirus האנושי לשני גרם שלילי ו גראם בקטריה החיידק16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: תנאי הגדילה החיידקיים המתוארים בפרוטוקול הם תנאי התרבות הסטנדרטיים עבור מתקני הצמיחה של החברה ולקטטבק. Lactobacillus gasseri כדי לבצע את הווירוס: בקטריה מצורף שיטת עם מינים חיידקיים אחרים, החיידקים שנבחרו צריך להיות תרבותי תחת תנאים סטנדרטיים המתאימים לחיידק.

1. הכנת בינונית צמיחה חיידקית

  1. Enterobacter cloacae הצמיחה מדיה
    1. הכנת המדיום הנוזלי על ידי המסת 10 גרם של טריטונים, 5 גרם של תמצית שמרים 10 גרם נתרן כלוריד (הנאל) ב 1 L של המים המאיולים (ראה לוח חומרים). מערבבים את כל המדיה ביסודיות לעקר על ידי אוטוקלינג עבור 30 דקות.
    2. הכנת בינוני מוצק על ידי המסת 10 גרם של טריטונים, 5 גרם של תמצית שמרים, 10 גרם של נרוג, ו 15 גרם של אגר ב 1 L של מים DI. מערבבים את כל המדיה ביסודיות לעקר על ידי אוטוקלינג עבור 30 דקות.
  2. לקטטבק מדיה צמיחה
    1. הכנת בינוני נוזלי על ידי המסת 55 g של דה מאן, רוגוסה ו שארפ (גברת; ראה טבלת חומרים) אבקה 1 L של מים DI. השתמש במדיום תוך חודש של הכנה. כדי לחטא, חום בינוני עבור 15 דקות עד רתיחה ואחריו באמצעות אוטוקלינג עבור 15 דקות.
    2. להכין בינוני מוצק על ידי המסת 55 g של הגברת אבקת ו 15 גרם של אגר ב 1 L של מים DI. כדי לחטא, חום בינוני עבור 15 דקות עד רתיחה ואחריו באמצעות אוטוקלינג עבור 15 דקות.

2. הקמת עקומת סטנדרטי מתייחס לדחיסות אופטית (OD) וחיידקים ריכוז

  1. איחסן 5 מ ל של בינוני נוזלי מתאים עם מושבה אחת, מבודדת מצלחת אגר (E. cloacae) או ישירות מתוך מלאי הגליצרול קפוא (ל. גסרי).
  2. לגדל את החיידק בלילה, תחת תנאים אטמוספריים נאותה (Enterobacter cloacae: 37 ° צ' עם טלטול אירובי ב 200 rpm; ל. גאססרי: 37 מעלות צלזיוס באמבט מים ללא טלטול במכולה אטומה.
  3. העברה 2 x 1.3 mL משנת הלילה של תרבות לילה לשני בנפרד 1.5 mL שפופרות צנטריפוגה וחיידקים צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות.
  4. להסיר את הסופר ולשטוף דגימות עם 1 מ ל של מלוחים סטרילי 1x פוספט מאגור (PBS). חזור על שלב השטיפה עבור סך של 2 שוטף.
  5. צנטריפוגה את הדגימות שוב ב 10,000 x g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש ב 1.3 mL של הPBS 1x מעוקר.
  6. החל מ-0.5 mL של התרבות שטף, לדלל באופן סדרתי את החיידקים ב-1x PBS מן 10-1 עד 10-4.
  7. באמצעות ספקטרוסקופיה, למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות שטף, מדולל כל אחד מארבעת הדילול ב 600 ננומטר (OD600).
  8. בצע מדלל טורי 10 מקפלים ב-1x PBS עבור כל דילול משלב 2.6. התפשטות לוחית 100 μL של 3 הדילול האחרון עבור כל סדרה על המדיום מוצק מתאים כדי לקבוע את מספר היחידות היווצרות המושבה לכל מיליליטר (CFU/mL) של כל מדגם. . לוחית כל דילול בטרילקאט
  9. הרשו ללוחות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. היפוך הצלחות והדגירה תחת תנאים אטמוספריים המתאים (E. cloacae: אירובי ב 37 ° צ', לוחות דגירה לילה; ל. גאססרי: אנאירובי ב 37 ° c, לוחות דגירה עבור 48 h במיכל אטום עם שקיות אוויר anerobic (ראה לוח חומרים)).
    הערה: השתמש 1 אנאירובית אוויר לצנצנת 2.5 L או 3 שקיות לכל 7.0 L צנצנת (ראה לוח חומרים).
  10. השתמש ספירות צלחות כדי לקבוע CFU/mL עבור כל אחד 5 דגימות (כלומר, לא מדולל, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). צור עקומה סטנדרטית בהשוואה ל-OD600 vs cfu/mL. המשוואה עבור הקו הזה ישמש בקטריה-חיידקים מצורף בחני לקבוע cfu/mL מבוסס על OD600.

3. בקטריה-מצורף שיטת הקבצים

התראה: נורווירוס האדם הם ברמת בטיחות (BSL)-2 הסיכון וכל העבודה הכרוכה במעורבות של אחמי ם צריכה להתבצע בארונית ביו-בטיחות. הכנת התרבויות החיידקית, לפני השימוש המצורף, יש לבצע באמצעות תנאי בטיחות המתאימים לאורגניזם.

  1. הכנה מגיב
    1. מתמיסת מלח 1 x פוספט באגירה (PBS)
      1. הכן 1 L של 10x PBS על ידי המסת מנה שלמה ב 1 L של מים DI.
      2. פתרון אוטוקלב עבור 30 דקות.
      3. להכין פתרון 1x ידי לדלל את הפתרון לעיל 1:10 במים DI.
      4. מסנן לחטא את הפתרון על ידי העברת אותו דרך מסנן 0.22 יקרומטר ולאחסן בטמפרטורת החדר.
    2. 5% BSA
      1. להוסיף 5 g של סרום הפרה אלבומין (BSA) אבקה כדי 100 mL של PBS ליצור 5% (w/v) פתרון.
      2. מערבבים פתרון על ידי vortexing או על צלחת מהומה באמצעות בר לערבב מתכת עד הגושים התפרקה.
      3. סנן לעקר באמצעות מסנן יקרומטר 0.22.
      4. אחסן את הפתרון ב-4 ° c.
    3. הזרמת מאגרי כתם (FCSB)
      1. מסננים שנרכשו fcsb (ראה טבלת חומרים) באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
      2. אחסן את הפתרון הנותר ב-4 ° c.
    4. מאגר חסימות של 5% (BB)
      הערה: הכינו טריות בכל פעם.
      1. הוסף 0.5 גרם של BSA ל 10 מ ל של FCSB סטרילי.
      2. מערבולת לערבב לחלוטין לדוגמה ולעזוב על הקרח עד השימוש.
  2. בניין נוגדן
    1. הקשר האנושי המשלים וירוס GII (ראה טבלת חומרים) עם r-phycoerythrin מרין (PE) באמצעות ערכת הנוגדן r-PE תיוג לכל הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
    2. לאחסן את הנוגדן מצובן בחושך ב 4 ° צ' לשימוש עתידי בניתוח שיטת הקבצים המצורפים של אח מים-bacterium.
      הערה: הנוגדן העיקרי צריך להיות טיטרציה לפני השימוש בחיידק האח מים בדיקות מצורף כדי לקבוע את הריכוז המתאים הדרוש לזרימת cy, לנסות לנתח. הנוגדן טיטור יש לבצע בכל פעם את תגובת הקוניוגציה ועבור כל חיידק המשמש את הקובץ המצורף.
  3. נוגדן טיטור
    1. לדלל את מצובת אנטי אנושית norovirus GII הנוגדן 100-קיפול, עם דילול התחלתי של 1:100 ו דילול הסיום של 1:600 (שש מדלל בסך הכל).
    2. לבצע את הקובץ המצורף וירוס כמתואר להלן עם החריג הבא: בשלב 3.5.7 להשעות את הגלולה חיידקים ב 350 μL של 5% BB.
    3. חלק את המדגם לתוך 7 50 μL.
    4. הוסף 50 μL של כל נוגדן דילול לצינור אחד.
    5. הוסף 50 μL של 5% BB לשפופרת השביעית כפקד לא מוכתם.
    6. לבצע זרימה cy, לנסות על כל הדגימות כמתואר להלן.
    7. השוואת דגימות נוגדן מדולל כדי שולטת בלתי מוכתם אחד לשני. ריכוז הנוגדן הנמוך ביותר שאינו גורם לירידה או אובדן של אות חיובית יש לבחור לשימוש בעקבות הבאים.
  4. הכנת חיידקים
    1. לגדל את החיידקים ב 40 mL של מדיום נוזלי המתאים בתנאים אטמוספרי המתאים עד החיידקים הם בשלב נייח.
      1. לגדול E. cloacae תרבויות aerobically לילה בתוך לוריא ציר ב 37 ° c, רועד ב 200 סל ד כדי להגיע לשלב נייח.
      2. הגדל את התרבויות בתוך הגברת ציר בצינורות הברגים השחורים מבלי לרעוד באמבט מים שנקבע ל-37 ° c עבור 18 שעות כדי להגיע לשלב הנייח.
    2. העברת תרבויות הפאזה נייח כדי לנקות 50 mL ודגימות צנטריפוגה ב 2,288 x g עבור 10 דקות כדי הגלולה חיידקים.
    3. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש 13 מ ל של PBS 1 x מעוקר. חזור על שלב זה עבור שטיפת כולל של שתי שטיפות.
    4. צנטריפוגה את הדגימות שוב, להסיר את הסופר ולהשעות דגימות מחדש ב 20 מ ל של 1x PBS.
      הערה: אם הגלולה היא קטנה, נפח ההשעיה ניתן להפחתה.
    5. מדוד את ה-OD600 של התרבות.
    6. באמצעות עקומת התקן הקודם שהוכן, לקבוע את CFU לכל mL של התרבות שטף.
    7. לדלל את החיידקים לפי הצורך עם 1x PBS כדי להתאים ריכוז התרבות ל 1 x 108 cfu/mL.
    8. העבר 1 mL של 1 x 108 cfu/mL התרבות בקטריאלי למספר הדרוש של 1.5 mL שפופרות צנטריפוגה.
    9. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x g עבור 5 דקות.
    10. השהה מחדש את הגלולה החיידקית ב-1 מ ל מעוקר של 5% BSA.
    11. מודאת הצינורות במשך 1 h ב 37 ° צ' עם סיבוב קבוע.
  5. מצורף וירוס
    1. עבודה בתוך הקבינט BSL-2 בטיחות, להוסיף 10 μg של HuNoV אחם (ראה טבלת חומרים) לכל צינור המכיל חיידקים מחדש ב-PBS ולערבב ביסודיות על ידי ליטוף.
      הערה: ריכוז האח מים שונה עם כל הכנה של VIP. לכן, אמצעי האחסון שנוסף לחיידקים ישתנו בין אצוות ההכנה ויש להתאימו בהתאם, כך ש -10 μg יתווסף לכל צינורית בניסוי. עבור חיידקים שולטת רק (למשל, דגימות ללא אח מים), להוסיף נפח של PBS השווה נפח של ה-VIP הוסיף דגימות ניסיוני.
    2. הצינורות מודטים ב37 בגובה ° c עם סיבוב קבוע.
      הערה: אקדח שפופרת (ראה טבלת חומרים) המוגדר ל-40 סל ד משמש במהלך הדגירה.
    3. לאחר דגירה, צנטריפוגה את הדגימות ב 10,000 x g עבור 5 דקות.
    4. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה חיידקים 1 מ ל של PBS.
    5. חזור על שלבי השטיפה ה3.5.3 וה3.5.4.
    6. צנטריפוגה את הדגימות ב 10,000 x g עבור 5 דקות.
    7. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה חיידקים ב 150 μL של 5% BB.
  6. מכתים נוגדנים
    1. הכינו דף חדש של 5% BB.
      הערה: כל העבודה באמצעות נוגדנים מתויג fluorescently יש לבצע בחושך את הנוגדן, BB ו FCSB יש לשמור על הקרח.
    2. לדלל את ה-norovirus האנושית הנוגדן GII 1:125 עבור הדגימות E. cloacae ו 1:150 עבור בדיקות l. gasseri ב 5% BB, הכנת 50 μl של נוגדן מדולל לכל מדגם.
    3. לדלל את הנוגדן isotype באותו אופן הנוגדן האנושי norovirus הנגיף היה מדולל עבור כל חיידק ב 5% BB, הכנת 50 μL של בקרת isotype מדולל לכל מדגם.
    4. לחלק כל מדגם שיטת הקבצים המצורפים משלב 3.3.7 לתוך 3 50 μL ali ts על ידי העברתם לתוך נקי 1.5 mL צנטריפוגה צינורות.
    5. לערכת הדגימות הראשונה, הוסף 50 μL של BB. קבוצה זו תהיה שולטת בלתי מוכתמת (לונים).
    6. לקבוצה השניה, הוסף 50 μL של דילול הנוגדן של GII. זה התוצאות ריכוז נוגדן הסופי של 1:250 עבור E. cloacae ו 1:300 עבור L. gasseri. ערכת דגימה זו תהיה דגימות ויטראז ' (AB).
    7. לקבוצה השלישית, להוסיף 50 μL של נוגדן isotype מדולל. ערכה זו תהיה פקדי isotype (IC). מערבבים היטב על ידי ליטוף. מודקון את הדגימות על קרח ובחשיכה במשך 30 דקות.
    8. צנטריפוגה את כל הדגימות ב 10,000 x g עבור 5 דקות.
    9. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הדגימות ב-100 μL של FCSB.
    10. צנטריפוגה את כל הדגימות ב 10,000 x g עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את דגימות ב 100 μl של FCSB.
    11. צנטריפוגה את כל הדגימות ב 10,000 x g עבור 5 דקות.
    12. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הדגימות ב-150 μL של FCSB.
    13. העבר כל מדגם לשפופרת FCSB המכילה 400 μL של מאגר FCSB עבור נפח כולל של 550 μL.
    14. יש לשמור דגימות ב 4 ° צ' עד שהם נותחו על ידי שהזרים cy, לנסות.
      הערה: cy, הזרימה הציטונסה מבוצעת בתוך 4 שעות של כתמים נוגדן.

4. הזרמה של הציטומה

הערה: הגדרות המתח המתוארות להלן מבוססות על הזרימה של cytometer והתוכנה המפורטת בטבלת החומרים , וסביר להניח שישתנו באמצעות ציטוטומטרים שונים. יש למטב את ההגדרות עבור כל אחד מהחיידקים. ודא שהצירים עבור כל הגרפים נמצאים בשלב ביואקספוננציאלי.

  1. הגדרת סביבת העבודה
    הערה: ההגדרה של מגרשים המשמשים ליצירת סביבת העבודה שונה מאלה הנמצאים בשימוש במהלך בדיקות וניתוח נתונים. המטרה של הקמת סביבת העבודה היא להמחיש את אוכלוסיית התאים, להבטיח שאין הרבה מידע מוגזם של התאים החיידקיים שעלולים להשפיע על ניתוח במורד הזרם ולהבחין בין תאים מוכתמים ובלתי מוכתמים בזמן איסוף הנתונים.
    1. כדי להבטיח שחיידקים לא מתחברים יחד, להקים סדרה של מגרשים צפיפות.
      1. צור אזור פיזור קדמי (FSC-A) לעומת אזור פיזור צדדי (המטה-מע-א) כדי להמחיש את האוכלוסיה הכוללת.
      2. הגדר מגרשים כדי להעריך תאים בודדים לעומת גושי תאים על-ידי יצירת שני גרפים השווים הן קדימה (FSC-W) ורוחב פיזור צדדי (מהאס-בתים לשנייה) לקדימה (FSC-H) וגובה פיזור צדדי (המטה-ממדי), בהתאמה.
      3. צור מזימה המציגה רק את האוכלוסיה החיובית של PE (PE-A לעומת המטה-בי-א).
    2. הגדר מתח בסיסי 500 עבור E. cloacae ו-340 עבור ל. גסרי. . זה יהיה מותאם מאוחר יותר
    3. הגדר את האירועים הכולל שנספרו ל-10,000 אירועים.
  2. דגימות ריצה
    1. צור שלוש חלקות היסטוגרמה נפרדות שיוצרות ספירה המותוות כנגד האס-אס-אס, FSC-a או PE-A.
    2. מניחים דגימה בלתי מוכתמת על cytometer לרכוש את האירועים לדוגמה, להבטיח את השיא המקסימלי על ההיסטוגרמה עבור ה-אס. אס. אס. הוא בתוך 102 עד 103 ואת השיא המקסימלי על ההיסטוגרמה עבור fsc-a היא בין 104 כדי 105 על ציר ה-x. אם לא, פסגות לא נופל בתוך הטווחים שצוינו, להתאים את המתח FSC ו-מהאס-אס בהתאם.
    3. מניחים מדגם מוכתם (AB) על cytometer להתאים את PE מתח כדי להפוך את השיא המקסימלי בעבר 103 על ציר ה-x.
    4. בהתבסס על מדידות אלה, להגדיר את שער PE חיובי ולהגדיר את השער על PE-A לעומת מע-מתחת לגרף הצפיפות.
    5. הפעל את כל הדגימות תחת ההגדרות הנקבעות במהירות נמוכה או בינונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אסטרטגיות האיסוף המשמשות לכמת את כריכת ה-VIP של האדם וירוס לחיידקים הללו מוצגים באיור 1. נקודות צפיפות הנציג מספק סקירה של כיצד דגימות היו מגודרת כדי לחסל את הפסולת הסלולרית והגושים תאים כך המצורף VIP נקבע על סינגתן אוכלוסיות (איור 1א). היסטוריגרמות הנציג להפגין רמות נמוכות של האות נוגדן אנטי norovirus בחיידקים רק דגימות חסר אח מים norovirus ואות רקע נמוך של בקטריה-חיידקים דגימות מוכתם עם נוגדן בקרת isotype (איור 1B). פסגות בקרת איזוטיפ חופפים גם עם דגימות בלתי מוכתמות בעוד כתמים של דגימות זהה עם האנטי-אנושית הנוגדן GII הנגיף תוצאות משמרת משמעותית בשיא.

שיטת Overton של חיסור היסטוגרמה נעשה שימוש כדי להשוות את האות PE-חיוביים ב-אנטי האדם norovirus הנוגדן בדגימות ויטראז לאות PE-חיוביים של בקרת isotype המתאים ולקבוע את אחוז האוכלוסיה החיידקית המאוגד על ידי האדם norovirus אחמי ם (איור 1B). אחרי 1 h של דגירה עם 10 μg של ה-VIP, זרימה cy, לנסות לזהות כריכת חלקיקים ל -e. cloacae ו -ליטר (איור 2). למעשה, רמות גבוהות של הכריכה אירעו בתנאים אלה עבור שני החיידקים; הכריכה ל -L. gasseri התרחשה מעט גבוה יותר, אך משמעותי (p < 0.0001), רמות לעומת E. cloacae. אלה מספר בחני להדגים כי הזרימה cy, לנסות לזהות את הכריכה האנושית של וירוס לחיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים.

כדי לקבוע את המגבלה של כימות הכריכה לצורך בדיקה זו, נוצרה סדרת דילול של האח מים לפני בנוסף לחיידק (איור 3). עבור שני הסוגים של חיידקים, הפחתת כמות האח מים שנוספה לתרבות החיידקית הביאה לצמצום המקביל באחוז החיידקים המאוגדים על ידי ה-VIP. שינויים באחוז ה -e. cloacae המאוגד על-ידי החלקיקים היו הדרגתיים יותר בהשוואה ל -L ' gasseriאבל אחוז ההחזקה לשני החיידקים מפולס למרות הפחתה נוספת בריכוז ה-vip. במיוחד, 0.1 μg או פחות (נתונים לא מוצגים) של ה-VIP ב 108 cfu של חיידקים הביא רמה של אחוז מצורף בממוצע בין 13-19% עבור שני חיידקים, המציין כי אחוז זה הוא גבול של כימות לצורך זה.

Figure 1
איור 1: בדיקת הזרימה הייצוגית של כריכת האח מים של norovirus האנושית. (א) זרם מייצגcy, לנסות את האסטרטגיה לכמת כריכת vip לחיידקים. מגרשים בצפיפות שימשו לשער החוצה פסולת תאית, ואחריו העלילה נקודה העוקבים להסיר doublets חיידקיים וגושים סלולריים. (ב) נציג היסטגרמות מדגימים חוסר של אות pe בדגימות בקטריאלי בלבד ומשמרת בעוצמת האות pe ב-vip: דגימות bacterium בהשוואה לפקדים בלתי מוכתמים ו isotype. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אח מ המצורף ל -E. cloacae ו -ליטר . תרבויות לילה של E. cloacae (n = 6) ו -L. gasseri (n = 6) היו מדוללים עד 1 x 108 CFU/mL ב-PBS. החיידקים היו מודבטים עם 10 μg של GII. 4 אחמי ם עבור 1 h אז המצורף vip נמדד באמצעות cy, הזרמת לנסות. ניתן למצוא מגרש מייצג באיור 1B. אחוז מצורף נקבע באמצעות שיטת Overton של חיסור היסטוגרמה השוואת האות PE-חיוביים של מוכתם האדם וירוס האנושית של GII לאות PE-חיוביים של פקד isotype המתאים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t של סטודנט שאינו משויך (p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הסדרת דילול VIP עבור E. cloacae ו -ליטר . 10 μg של GII. 4 אח מים היה מדולל באופן סדרתי ואת הדילול vip כל אחד התווסף 1 x 108 חיידקים בנפח הסופי של 1 mL (n = 3 עבור שני חיידקים). הדגימות הודערו למשך שעה אחת ב 37 ° c. האח מים המצורף לחיידק נמדד באמצעות הזרימה cy, try. אחוז מצורף נקבע באמצעות שיטת Overton של חיסור היסטוגרמה השוואת האות PE-חיוביים של מוכתם האדם וירוס האנושית של GII לאות PE-חיוביים של פקד isotype המתאים. הפחתת כמויות הקלט של אח מים הביאה להפחתת הפחתה באחוזים עבור שניהם (א) E. cloacae ו-(ב) ל. גרגסרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היכולת לכמת כריכת וירוסים לחיידקים מהווה צעד ראשון קריטי להסבר המנגנונים שבהם חיידקים אלה משנים זיהום נגיפי. השיטות המתוארות במסמך זה היו ממוטבות למדוד אינטראקציות אנושיות של ה-VIP של האדם עם שניהם E. cloacae (חיידק גראם שלילי) ו -L. gasseri (חיידק גרם-חיובי), אבל יכול להיות מותאם לשימוש עם כל וירוס היונקים והחיידק של הריבית. בעוד שאחם הם חלופה אידיאלית לחיות וירוס לשימוש בקובץ מצורף מספר וחלקיקים אלה ניתן לכמת בקלות באמצעות cy, שימוש בזרימה, חלקיקים P השתמשו גם כדי לבחון את האינטראקציות בין האדם noroviruses וחיידקים24. במחקר זה, כמות הווירוס המאוגד לחיידקים היה כימות בניגוד לאוכלוסיית חיידקי, כפי שדווח כאן. חלקיקי P מספקים יתרון על אחמי ם בכך שהם קלים יותר לייצור תוך מתן דמיון אנטיגניים לשני הווירוסים ולסוג הפראי וירוס24,25. עם זאת, norovirus האדם הם הזמינים מסחרית לספק אמצעים עבור מעבדות חסר יכולת ליצור או חלקיקים P. חלקיקי p שונים מאחמי ם בכך, בעוד שאיש-המים שומר על גודל של חלקיק ויראלי פראי, חלקיקי P קטנים יותר ויש להם טטרלדרלית ולא סימטריה בלתי-מישור25. ההשפעה של מאפיינים אלה על אינטראקציות עם חיידקים לא נחקרו ו-P חלקיקים יכולים לשמש חלופה קיימא לאחמי ם באפיון אינטראקציות פני השטח בין norovirus אנושי וחיידקים.

כפי שהוזכר קודם לכן, ניתן להשתמש באותה שיטת הגומלין המתוארת לעיל כדי לאפיין עוד יותר את האינטראקציות בין אחמי ם ובקטריה של האדם. חקירות על איך הצמיחה התנאים והשינויים ביטוי מבנה המשטח חיידקי לשנות את הכריכה ויראלי ניתן לחקור באמצעות טכניקה זו. בנוסף, שיטת זה יכול לשמש גם כדי לקבוע מבנים בקטריאליים מסוימים המאוגדים על ידי הנגיף באמצעות מעכבות תחרותי בחני השימוש בחלבונים או גליקנים בקטריאלי, טיפול אנזימטי להסרת מבנים משטח ספציפי, או דגירה עם זנים חיידקיים מוטציה לקויה בפרט מבנה. שיטת זה יכולה גם להיות מועסק כדי לחקור את היכולת של זנים norovirus אחרים לתקשר עם חיידקים המוסל.

מכיוון שניתן לכמת את היחס בין האוכלוסיה החיידקית המאוגדת על-ידי ה-VIP של norovirus, הוא קריטי לקבוע במדויק את הקורלציה בין CFU/mL ו-OD600 כך שניתן יהיה למדוד את ריכוז התרבות החיידקית. תנודות ב-VIP: יחס החיידק משנה את האחוז מאוכלוסיית החיידקים המאוגדים על ידי אחמי ם ויכול להוביל לשונות בתוצאות. הטיפול צריך גם להיות לקחת כדי להוסיף כמויות מספיקות של חלקיקים ויראלי, כגבול של זיהוי של הגישה הזאת גישות 0.1 μg של VIP/108 cfu של חיידקים. היחסים שמתחת למגבלה זו הניבו בעקביות ערכים באחוזים מצורפים של 13 – 19%; לפיכך, ייתכן שההחזקה באוכלוסייה באחוזים אלה או מתחתיה לא תהיה אמיתית.

חדירות הנוגדן בוצעו עבור כל נוגדן לאחרונה מצוואת נגד כל זן חיידקי לפני השימוש ב-VIP: חיידקים מצורף ניסויים. ריכוזי הנוגדן הדרושים עבור כל חיידק היו דומים החל מ 1:250 עבור E. cloacae ו 1:300 עבור L. gasseri. בגודל קטן של חיידקים, ביחס לגודל של תאים איקריוטית, דורש הן התאמת מתח, כמו גם את השימוש בהתפלגות בינומית במהלך איסוף הנתונים כדי להפריד באופן כראוי חיידקים מפסולת שניתן למצוא דגימות או במחזור בתוך המכשיר. לאחר איסוף הנתונים, ניתן להשתמש בסדר הנכון כדי להסיר עוד חלקיקי פסולת גדולים וגושים חיידקיים כך שרק אוכלוסיות תא יחיד מנותח. זה גם קריטי להקים הגדרות מתח ייחודי עבור כל מינים חיידקיים נבדק כמו אלה להשתנות באופן נרחב, במיוחד בין גרם שלילי גראם חיידקים גראם חיוביים.

הכללה של פקדים נאותים כולל חיידקים בלבד ופקדי isotype הם גם קריטיים לניתוח מדויק של הנתונים. שני סוגי הפקדים מודיעים ביחס לרמות של איגוד נוגדנים שאינו ספציפי. התוצאות שלנו להפגין כי הנוגדנים המשמשים לא לאגד לא במיוחד את המינים חיידקי נבדק, אבל האיגוד שאינו ספציפי יכול להשתנות עם שינויים במין חיידקי או נוגדן.

השיטה המוצגת כאן מכמת את כריכת חלקיקי הנגיף האנושי לחיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים ושימושית באפיון וירוס: אינטראקציות בקטריאליות. יתר על כן, פרוטוקול בסיס זה ניתן למטב בקלות לשימוש עם גנוסוגים אחרים של norovirus אנושי, כמו גם וירוסים ווירוסים אחרים וחיידקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

היינו רוצים להודות לסוטונקה בהאר ולשנל מוסבי-רדיפות על הסקירה הקריטית של כתב היד הכתוב, כמו גם אלפונסו קאריו לסיוע ביצירת עקומות סטנדרטיות חיידקית. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מענק מן המכון הלאומי לבריאות (R21AI140012) ועל ידי מענק זרע מאוניברסיטת פלורידה, המכון למזון ומדעי החקלאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 158 האדם norovirus בידור וירוס בקטריאלי אינטראקציות בקטריה הקומנדציה כימות האדם norovirus זיהוי האדם norovirus וירוס בקטריה מצורף
כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madrigal, J. L., Jones, M. K.… More

Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter