Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifisere humant norovirus viruslignende partikler binding til commensal bakterier ved hjelp av flow cytometri

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

Målet med denne protokollen er å kvantifisere binding av eukaryyotisk patogen humant norovirus til bakterier. Etter å ha utført en innledende virus-bakterie vedlegg analyse, flyt cytometri brukes til å oppdage viralt bundet bakterier i befolkningen.

Abstract

Commensal bakterier er godt etablert for å påvirke infeksjon av eukaryyotiske virus. Direkte binding mellom patogenet og vertsmikrobiomet er ansvarlig for å endre infeksjon for mange av disse virusene. Dermed er det å karakterisere arten av virus-bakterier binding et grunnleggende skritt som trengs for å belyse mekanismen(e) som bakterier endrer virusinfeksjon. For humant norovirus forbedrer kommensale bakterier B-celleinfeksjon. Viruset binder seg direkte til disse bakteriene, noe som indikerer at denne direkte interaksjonen er involvert i mekanismen for infeksjonsforbedring. En rekke teknikker kan brukes til å kvantifisere interaksjoner mellom bakterier og virus, inkludert scintillation telling av radiomerkede virus og polymerase kjedereaksjon (PCR). Begge metodene krever bruk av levende virus, som kan måtte genereres i laboratoriet. For tiden er ingen av de etablerte in vitro kultursystemene som er tilgjengelige for humant norovirus, robuste nok til å tillate generering av svært konsentrerte virusbestander. I stedet for levende virus har viruslignende partikler (VLPs) blitt brukt til å karakterisere interaksjonene mellom norovirus og bakterier. Her i en flow cytometri metode er beskrevet med bruker virus spesifikke antistoffer for å kvantifisere VLP binding til gram-negative og gram-positive bakterier. Inkludering av både bakterier og isotypekontroller tillatt for optimalisering av analysen for å redusere bakgrunnsantistoffbinding og nøyaktig kvantifisering av VLP-vedlegg til bakteriene som er testet. Høye VLP:bakterieforhold resulterer i at VLPs binding til store prosenter av bakteriepopulasjonen. Men når VLP-mengder reduseres, reduseres også prosentandelen av bakterier som er bundet. Til syvende og sist kan denne metoden brukes i fremtidige eksperimenter som belyser de spesifikke forholdene og strukturelle komponentene som regulerer norovirus:bakterielle interaksjoner.

Introduction

Humane norovirus (HuNoVs) er den ledende årsaken til gastrointestinal sykdom over hele verden, ansvarlig for 685 millioner infeksjoner og over 200.000 dødsfall hvert år1. Som med andre enteriske virus, har tilstedeværelsen av kommensale bakterier vist seg å forbedre infeksjon en av dette patogenet, samt surrogatviruset, murine norovirus2,3. Det er også motstridende rapporter om at bakterier kan hemme infeksjon av humant norovirus4,5,6. For flere virus ser direkte interaksjon mellom viruset og bakteriene ut til å ligge til grunn for mekanismene som påvirker virusinfeksjon2,,7,8,9,10, og det har blitt vist gjennom elektronmikroskopi at humane norovirus binder seg direkte til overflatene av bakterier11,12. Derfor har karakterisering av disse interaksjonene blitt avgjørende for å bestemme mekanismene som bakterier påvirker virusinfeksjon. Denne karakteriseringen har klassisk begynt med kvantifiserende viral binding til en rekke bakterielle arter som er komponenter i verten mikrobiome7,,12,13. Disse vedleggsanalysene avslører ikke bare mengden virus som er bundet til bakterier, men også bidrar til å bestemme virkningen av denne interaksjonen på viral kondisjon og overlevelse.

For å kvantifisere viral vedlegg, tradisjonelt brukte metoder inkluderer PCR-baserte analyser som kvantifiserer virale genomer12 eller generering av radiomerket virus og bruk av scintillation telling for å kvantifisere viruspartikler7,,8,9,13. Bruken av disse metodene krever vanligvis tilgang til høytiterviruslagre og in vitro dyrkingsteknikker som å generere dem. Mens flere kultursystemer for humant norovirus nå eksisterer2,14,15, støtter ingen den robuste replikeringen som kreves for å generere disse svært konsentrerte bestandene som begrenser eller eliminerer bruken av PCR og scintillation telling for å kvantifisere menneskelig norovirus / bakterielle interaksjoner.15

For å omgå dette problemet, virus-lignende partikler (VLPs) kan brukes som et surrogat for å leve virus for å undersøke interaksjoner mellom menneskelig norovirus og bakterier16,17. VLPs er ikke-smittsomme partikler som ligner viruset som de er avledet fra. Når det gjelder humant norovirus, genereres disse partiklene fra uttrykket av VP1 (og en gang VP2)-proteinet, som selv monterer for å skape intakte virale capsids som mangler genetisk materiale (dvs. RNA for norovirus). Disse VLPs har vært godt preget, er strukturelt og antigenically lik vill-type virus som de er avledet18,,19,20,21,22,23. Derfor fungerer VLPs som et ideelt surrogat for å undersøke overflateinteraksjonene mellom humant norovirus og komstaserende bakterier. Gitt at VLPs mangler genetisk materiale, PCR-baserte analyser kan ikke brukes til å kvantifisere viral binding. En antistoffbasert flow cytometrimetode ble tidligere beskrevet og i stand til å oppdage lave nivåer av VLP binding til bakterier på en semi-kvantitativ måte16. Denne metoden ble optimalisert for å tillate nøyaktig kvantifisering av humant norovirus VLP binding til både gram-negative og gram-positive commensal bakterier16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Bakterievekstforholdene som er skissert i protokollen er standard kulturforhold for Enterobacter cloacae og Lactobacillus gasseri. For å utføre viruset:bakterier vedlegg analyse med andre bakterielle arter, bør de valgte bakteriene dyrkes under standardforhold som passer for bakterien.

1. Forbereder bakteriell vekst medium

  1. Enterobacter cloacae vekst media
    1. Forbered væskemediet ved å oppløse 10 g tryptone, 5 g gjærekstrakt og 10 g natriumklorid (NaCl) i 1 l av de-ionisert (DI) vann (se materialtabellen). Bland alle medier grundig og steriliser ved autoklaving i 30 min.
    2. Forbered solid medium ved å oppløse 10 g tryptone, 5 g gjærekstrakt, 10 g NaCl og 15 g agar i 1 l DI-vann. Bland alle medier grundig og steriliser ved autoklaving i 30 min.
  2. Lactobacillus gasseri vekst media
    1. Forbered væskemediet ved å oppløse 55 g De Man, Rogosa og Sharpe (MRS; se Materialbrev) pulver i 1 l di vann. Bruk medium innen en måned etter forberedelse. For å sterilisere, varme medium i 15 min til koking etterfulgt av autoklaving i 15 min.
    2. Forbered solid medium ved å oppløse 55 g MRS pulver og 15 g agar i 1 L di vann. For å sterilisere, varme medium i 15 min til koking etterfulgt av autoklaving i 15 min.

2. Etablere en standard kurve korrelerende optisk tetthet (OD) og bakterier konsentrasjon

  1. Inokulere 5 ml passende væskemedium med en enkelt, isolert koloni fra en agarplate (E. cloacae) eller direkte fra frossen glyserollager (L. gasseri).
  2. Vokse bakterien over natten, under riktige atmosfæriske forhold (Enterobacter cloacae: 37 °C med aerob risting ved 200 rpm; L. gasseri: 37 °C vannbad uten risting i en lufttett beholder).
  3. Overfør 2 x 1,3 ml aliquots av overnattingskultur til to separate 1,5 ml sentrifugerør og sentrifugebakterier ved 10.000 x g i 5 min.
  4. Fjern supernatanten og vask prøvene med 1 ml steril tfosfat bufret saltvann (PBS). Gjenta dette vasketrinnet for totalt 2 vasker.
  5. Sentrifuge prøvene igjen på 10.000 x g i 5 min, fjern supernatant og resuspend i 1,3 ml steril 1x PBS.
  6. Fra og med 0,5 ml vasket kultur fortynner serially bakteriene i 1x PBS fra 10-1 til 10-4.
  7. Ved hjelp av et spektrotometer måler du den optiske tettheten til den vaskede, ufortynnede kulturen og hver av de fire fortynningene ved 600 nm (OD600).
  8. Utfør 10 ganger seriefortynninger i 1x PBS for hver fortynning fra trinn 2.6. Spreplate 100 μL av de siste 3 fortynningene for hver serie på egnet solid medium for å bestemme antall kolonidannende enheter per milliliter (CFU/ml) av hver prøve. Plate hver fortynning i triplicate.
  9. La platene tørke ved romtemperatur i 5 min. Inverter platene og inkuber under de aktuelle atmosfæriske forholdene (E. cloacae: aerob ved 37 °C, inkuber plater over natten; L. gasseri: anaerob ved 37 °C, inkubatorplater i 48 timer i en lufttett beholder med anerobic luftposer (se materialtabellen)).
    MERK: Bruk 1 anaerob luftpose per 2,5 l krukke eller 3 poser per 7,0 l krukke (se Materialtabellen).
  10. Bruk platetellinger til å bestemme CFU/ml for hver av de 5 prøvene (dvs. ufortynnet, 10-1,10-2,10-3,10-4). Generer en standardkurve som sammenligner OD600 vs CFU/ml. Ligningen for denne linjen vil bli brukt i VLP-bakterier vedlegg analyser for å bestemme CFU / ml basert på OD600.

3. VLP-bakterier Vedlegg Analyse

FORSIKTIG: Humannorovirus VLPs er et biosikkerhetsnivå (BSL)-2 fare og alt arbeid som involverer VLPs bør utføres i et biosikkerhetsskap. Utarbeidelse av bakteriekulturene, før vedleggsanalysen, bør utføres ved hjelp av sikkerhetsforhold som passer for organismen.

  1. Forberedelse av reagens
    1. 1x fosfat bufret saltvann (PBS)
      1. Forbered 1 L av 10x PBS ved å oppløse en hel pakke i 1 l DI vann.
      2. Autoklavløsning i 30 min.
      3. Forbered en 1x løsning ved å fortynne ovennevnte oppløsning 1:10 i DI vann.
      4. Filtrer steriliser oppløsningen ved å sende den gjennom et 0,22 μm filter og oppbevar ved romtemperatur.
    2. 5 % BSA
      1. Tilsett 5 g storfe serum albumin (BSA) pulver til 100 ml PBS for å generere en 5% (w / v) løsning.
      2. Bland oppløsningen ved å virvle eller på en røreplate ved hjelp av en metallrørstang til klumpene er oppløst.
      3. Filtrer steriliser med et filter på 0,22 μm.
      4. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C.
    3. Flow cytometri flekkbuffer (FCSB)
      1. Filter kjøpt FCSB (se materialtabellen) gjennom et filter på 0,22 μm.
      2. Oppbevar gjenværende oppløsning ved 4 °C.
    4. 5 % blokkeringsbuffer (BB)
      MERK: Forbered deg frisk hver gang.
      1. Tilsett 0,5 g BSA til 10 ml steril FCSB.
      2. Vortex å blande prøve fullt ut og la stå på is til bruk.
  2. Antistoffbøyning
    1. Konjugerhumant norovirus GII antistoff (se materialtabellen) med r-phycoerythrin (PE) ved hjelp av et R-PE antistoffmerkingssett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabellen).
    2. Oppbevar det konjugerte antistoffet i mørket ved 4 °C for fremtidig bruk i VLP-bakterievedleggsanalyse.
      MERK: Det primære antistoffet skal titreres før bruk i VLP-bakterievedleggsanalysen for å bestemme riktig konsentrasjon som er nødvendig for flow cytometrianalyse. Antistofftitrering bør utføres hver gang konjugeringsreaksjonen utføres og for hver bakterie som brukes i vedleggsanalysen.
  3. Antistofftitrering
    1. Fortynn det konjugerte anti-humant norovirus GII antistoff 100 ganger, med en startfortynning på 1:100 og en sluttfortynning på 1:600 (seks fortynninger totalt).
    2. Utfør en virusvedleggsanalyse som beskrevet nedenfor med følgende unntak: i trinn 3.5.7 resuspendere bakteriell pellet i 350 μL på 5% BB.
    3. Del prøven i syv 50 μL aliquots.
    4. Tilsett 50 μL av hvert antistofffortynning i ett rør.
    5. Tilsett 50 μL 5% BB til det syvende røret som en ufarget kontroll.
    6. Utfør flow cytometri på alle prøver som beskrevet nedenfor.
    7. Sammenlign fortynnede antistoffprøver med ufargede kontroller og med hverandre. Den laveste antistoffkonsentrasjonen som ikke resulterer i en reduksjon eller tap av positivt signal, bør velges for bruk i påfølgende analyser.
  4. Fremstilling av bakterier
    1. Dyrke bakteriene i 40 ml passende væskemedium under passende atmosfæriske forhold til bakteriene er i stasjonær fase.
      1. Grow E. cloacae kulturer aerobt over natten i Luria Broth på 37 ° C, risting på 200 rpm for å nå stasjonær fase.
      2. Grow L. gasseri kulturer i MRS kjøttkraft i svart skrukork rør uten risting i et vannbad satt til 37 °C for 18 h for å nå stasjonær fase.
    2. Overfør stasjonære fasekulturer for å rengjøre 50 ml koniske rør og sentrifugeprøver på 2288 x g i 10 minutter for å pellet bakteriene.
    3. Fjern supernatanten og resuspend i 13 ml steril 1x PBS. Gjenta dette vasketrinnet for totalt to vasker.
    4. Sentrifugerprøvene igjen, fjern supernatanten og resuspender prøvene i 20 ml 1x PBS.
      MERK: Hvis cellepelleten er liten, kan resuspensjonsvolumet reduseres.
    5. Mål OD600 av kulturen.
    6. Ved hjelp av den tidligere forberedte standardkurven, bestem CFU per ml av den vaskede kulturen.
    7. Fortynn bakteriene etter behov med 1x PBS for å justere kulturkonsentrasjonen til 1 x 108 CFU/ml.
    8. Overfør 1 ml av 1 x 108 CFU/ml bakteriekultur til ønsket antall 1,5 ml sentrifugerør.
    9. Sentrifugerrørene ved 10.000 x g i 5 min.
    10. Resuspender bakteriell pellet i 1 ml steril 5% BSA.
    11. Inkuber rørene i 1 time ved 37 °C med konstant rotasjon.
  5. Virus vedlegg
    1. Ved å arbeide inne i et BIOSIKKERHETSSKAP på BSL-2, tilsett 10 μg HuNoV VLPs (se materialtabellen) til hvert rør som inneholder bakterier som er suspendert i PBS, og bland grundig ved pipettering.
      MERK: VLP-konsentrasjonen er forskjellig fra hvert VLP-preparat. Derfor vil volumet som legges til bakterier variere mellom forberedelsesgrupper og bør justeres tilsvarende slik at 10 μg legges til hvert rør i forsøket. For bakterier bare kontroller (f.eks. prøver uten VLP), legge til et volum av PBS som tilsvarer volumet av VLP lagt til eksperimentelle prøver.
    2. Inkuber rør i 1 time ved 37 °C med konstant rotasjon.
      MERK: En rørrevolver (se materialtabellen) satt til 40 rpm brukes under inkubasjon.
    3. Etter inkubasjon, sentrifugerprøvene på 10.000 x g i 5 min.
    4. Kast supernatant og resuspender bakteriell pellet i 1 ml PBS.
    5. Gjenta vasketrinnene 3,5,3 og 3,5,4.
    6. Sentrifugerprøvene på 10.000 x g i 5 min.
    7. Kast supernatant og resuspender bakteriell pellet i 150 μL på 5% BB.
  6. Antistofffarging
    1. Forbered frisk 5% BB.
      MERK: Alt arbeid med fluorescerende merket antistoff skal utføres i mørket og antistoffet, BB og FCSB skal holdes på is.
    2. Fortynn humant norovirus GII antistoff 1:125 for E. cloacae prøver og 1:150 for L. gasseri prøver i 5% BB, forbereder 50 μL av fortynnet antistoff per prøve.
    3. Fortynn isotypeantistoffet på samme måte som det humane norovirus GII-antistoffet ble fortynnet for hver bakterie i 5 % BB, og preparater50 μL fortynnet isotypekontroll per prøve.
    4. Del hver vedleggsanalyseprøve fra trinn 3,3,7 i tre 50 μL aliquots ved å overføre dem til rene 1,5 ml sentrifugerør.
    5. Til det første settet med prøver, tilsett 50 μL bb. Dette settet vil være kontrollene ufarget (Uns).
    6. Til det andre settet legger du til 50 μL av GII-antistofffortynningen. Dette resulterer i en endelig antistoffkonsentrasjon på 1:250 for E. cloacae og 1:300 for L. gasseri. Dette prøvesettet vil være de beiste (AB)-prøvene.
    7. Til det tredje settet tilsett 50 μL av det fortynnede isotypeantistoffet. Dette settet vil være isotypekontrollene (IC). Bland godt ved pipettering. Inkuber prøvene på is og i mørket i 30 min.
    8. Sentrifuge alle prøver på 10.000 x g i 5 min.
    9. Kast supernatanten og resuspendprøvene i 100 μL fcsb.
    10. Sentrifuge alle prøver på 10.000 x g i 5 min. Kast supernatanten og resuspendprøvene i 100 μL av FCSB.
    11. Sentrifuge alle prøver på 10.000 x g i 5 min.
    12. Kast supernatanten og resuspendprøvene i 150 μL fcsb.
    13. Overfør hver prøve til et FCSB-rør som inneholder 400 μL FCSB-buffer for et totalt volum på 550 μL.
    14. Hold prøvene ved 4 °C til de analyseres ved strømningscytometri.
      MERK: Flow cytometri utføres innen 4 timer med antistofffarging.

4. Flyt Cytometri

MERK: Spenningsinnstillingene som er beskrevet nedenfor, er basert på strømningscytometeret og programvaren som er oppført i materialtabellen, og vil sannsynligvis variere med forskjellige strømningscytometre. Innstillingene bør optimaliseres for hver bakterie. Sørg for at aksene for alle grafer er i biexponential fase.

  1. Konfigurere arbeidsområdet
    MERK: Oppsettet for plott som brukes til å opprette arbeidsområdet, er forskjellig fra de som brukes i gating og dataanalyse. Formålet med å sette opp arbeidsområdet er å visualisere cellepopulasjonen, sikre at det ikke er noen overdreven klumping av bakteriecellene som kan påvirke nedstrømsanalyse og å skille mellom fargede og ufargede celler mens data samles inn.
    1. For å sikre at bakterier ikke klumper seg sammen, sett opp en rekke tetthetsplott.
      1. Generer et fremadgående scatterområde (FSC-A) kontra sidespredningsområde (SSC-A) for å visualisere den totale populasjonen.
      2. Definer plott for å evaluere enkeltceller kontra celleklumper ved å opprette to grafer som sammenligner både fremover (FSC-W) og sidescatterbredde (SSC-W) for å videresende (FSC-H) og sidespredningshøyde (SSC-H), henholdsvis.
      3. Opprett et plott som bare viser pe positiv populasjon (PE-A vs. SSC-A).
    2. Sett baselinespenning til 500 for E. cloacae og 340 for L. gasseri. Disse vil bli ytterligere justert senere.
    3. Angi totalt antall hendelser som telles til 10 000 hendelser.
  2. Kjøre prøver
    1. Opprett tre separate histogrammetplott som viser antall et plott mot SSC-A, FSC-A eller PE-A.
    2. Plasser en ufarget prøve på strømningscytometeret og skaffe prøvehendelsene, slik at maksimal topp på histogrammet for SSC-A er innenfor 102 til 103 og maksimal topp på histogrammet for FSC-A er mellom 104 til 105 på x-aksen. Hvis ikke, topper ikke faller innenfor de angitte områdene, justere FSC og SSC spenninger tilsvarende.
    3. Plasser en farget prøve (AB) på strømningscytometeret og juster spenningen PE for å gjøre maksimal topp forbi 103 på x-aksen.
    4. Basert på disse målingene, sett den positive PE-porten og sett porten på PE-A versus SSC-A tetthetsgrafen.
    5. Kjør alle prøvene under de bestemte innstillingene med lav eller middels hastighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gatingstrategiene som brukes til å kvantifisere humant norovirus VLP-binding til komserbakterier, vises i figur 1. Representativ tetthetdot gir en oversikt over hvordan prøver ble inngjerdet for å eliminere cellulær rusk og celleklumper, slik at VLP-vedlegg ble bestemt på singletpopulasjoner (figur 1A). Representative histogrammer viser lave nivåer av anti-norovirus antistoffsignal hos bakterier bare prøver som mangler norovirus VLP og lavt bakgrunnssignal av VLP-bakterier prøver farget med isotype kontroll antistoff (Figur 1B). Isotype kontroll topper også overlappe med ufargede prøver mens farging av de samme prøvene med anti-humant norovirus GII antistoff resulterer i betydelig endring i toppen.

Overton-metoden for histogramsubtraksjon ble brukt til å sammenligne PE-positivt signal i anti-humant norovirus GII antistofffargede prøver med PE-positivt signal av tilsvarende isotypekontroll og bestemme prosentandelen av bakteriepopulasjonen bundet av humane norovirus VLPs (figur 1B). Etter 1 t inkubasjon med 10 μg VLP, oppdaget flow cytometri partikkelbinding til både E. cloacae og L. gasseri (figur 2). Faktisk oppstod høye nivåer av binding under disse forholdene for begge bakteriene; binding til L. gasseri skjedde på litt høyere, men signifikant (p < 0,0001), nivåer sammenlignet med E. cloacae. Disse analysene viser at flytcytometri kan brukes til å oppdage humant norovirus som binder seg til både Gram-positive og Gram-negative bakterier.

For å bestemme grensen for bindende kvantifisering for denne analysen, ble det generert en fortynningsserie av VLPer før tillegg til bakteriene (figur 3). For begge bakteriegener resulterte reduksjoner i mengden VLP som ble lagt til bakteriekulturen, tilsvarende reduksjoner i prosentandelen av bakterier bundet av VLP. Endringer i prosentandelen av E. cloacae bundet av partikkelen var mer gradvis sammenlignet med L. gasseri, men prosent vedlegg for begge bakteriene flatet ut til tross for ytterligere reduksjoner i VLP konsentrasjon. Spesielt 0,1 μg eller mindre (data ikke vist) av VLP i 108 CFU av bakterier resulterte i et platå med prosent vedlegg i snitt mellom 13-19% for begge bakterier, noe som indikerer at denne prosentandelen er grensen for kvantifisering for denne analysen.

Figure 1
Figur 1: Representativ flytcytometrisk analyse av humant norovirus VLP-binding. (A) Representativ flyt cytometri gating strategi for å kvantifisere VLP binding til bakterier. Tetthettomter ble brukt til å gate ut cellulær rusk, etterfulgt av påfølgende dot plot gating for å fjerne bakterielle doublets og cellulære klumper. (B) Representative histogrammer viser mangel på PE-signal i bakterielle bare prøver og et skifte i PE-signalintensitet i VLP:bacterium-prøver sammenlignet med ufargede og isotypekontroller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: VLP-feste til E. cloacae og L. gasseri. Over natten ble kulturer av E. cloacae (n = 6) og L. gasseri (n = 6) fortynnet til 1 x 108 CFU/ml i PBS. Bakteriene ble inkubert med 10 μg GII.4 VLPs for 1 h da VLP vedlegg ble målt ved hjelp av flow cytometri. En representativ tomt finnes i figur 1B. Prosentvedlegg ble bestemt ved hjelp av Overton-metoden for histogramsubtraksjon som sammenlignet det PE-positive signalet fra GII Human Norovirus-fargede prøver med PE-positive signalet til den tilsvarende isotypekontrollen. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en uparet students t-test (p < 0.0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: VLP-fortynningsserie for E. cloacae og L. gasseri. 10 μg GII.4 VLPs ble seriefortynnet og VLP-fortynningene ble hver lagt til 1 x 108 bakterier i et endelig volum på 1 ml (n = 3 for begge bakteriene). Prøvene ble inkubert i en time ved 37 °C. VLP vedlegg til bakteriene ble målt ved hjelp av flow cytometri. Prosentvedlegg ble bestemt ved hjelp av Overton-metoden for histogramsubtraksjon som sammenlignet det PE-positive signalet fra GII Human Norovirus-fargede prøver med PE-positive signalet til den tilsvarende isotypekontrollen. Reduksjon av inngangsmengder av VLP resulterte i trinnvise reduksjoner i prosentfeste for begge (A) E. cloacae og (B) L. gasseri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til å kvantifisere binding av enteriske virus til bakterier er et kritisk første skritt for å belyse mekanismene som disse bakteriene endrer virusinfeksjon. Metodene som er beskrevet her, er optimalisert for å måle humant norovirus VLP-interaksjoner med både E. cloacae (gram-negativ bakterie) og L. gasseri (en grampositiv bakterie), men kan tilpasses for bruk med ethvert pattedyrvirus og bakterie av interesse. Mens VLPs er et ideelt alternativ til levende virus for bruk i vedleggsanalyser, og disse partiklene kan lett kvantifiseres ved hjelp av flow cytometri, har P-partikler også blitt brukt til å undersøke interaksjoner mellom humane norovirus og bakterier24. I denne studien ble mengden virus bundet til bakteriene kvantifisert i motsetning til bakteriepopulasjonen, som det rapporteres her. P partikler gir en fordel over VLPs ved at de er lettere å produsere samtidig som de gir antigen likhet med både VLPs og wild-type virus24,,25. Men, menneskelige norovirus VLPs er kommersielt tilgjengelig gir et middel for laboratorier som mangler kapasitet til å generere VLPs eller P partikler. P partikler skiller seg fra VLPs i det, mens VLPs opprettholder størrelsen på en villtype viral partikkel, partikler er mindre og har tetrahedral i stedet for icosahedral symmetri25. Virkningen av disse egenskapene på interaksjoner med bakterier har ikke blitt utforsket, og P-partikler kan tjene som et levedyktig alternativ til VLPs i å karakterisere overflateinteraksjoner mellom humant norovirus og bakterier.

Som nevnt tidligere, analysen beskrevet ovenfor kan brukes til å ytterligere karakterisere interaksjoner mellom humane norovirus VLPs og bakterier. Undersøkelser av hvordan vekstforhold og endringer i bakteriell overflatestrukturuttrykk endrer virusbinding kan utforskes ved hjelp av denne teknikken. I tillegg kan denne analysen også brukes til å bestemme spesifikke bakterielle strukturer bundet av viruset gjennom konkurransehemmingsanalyser ved hjelp av bakterielle proteiner eller glykaner, enzymatisk behandling for å fjerne spesifikke overflatestrukturer eller inkubasjon med muterte bakterielle stammer som er mangelfulle spesielt en struktur. Denne analysen kan også brukes til å undersøke evnen til andre norovirus stammer for å samhandle med kommensale bakterier.

Fordi denne analysen kvantifiserer andelen av bakteriepopulasjonen bundet av norovirus VLP, er det avgjørende å nøyaktig bestemme sammenhengen mellom CFU/ml og OD600 slik at bakteriell kulturkonsentrasjon kan måles. Svingninger i VLP:bakterieforholdet endrer prosentandelen av bakteriepopulasjonen bundet av VLPs og kan føre til variasjon i resultater. Det bør også utvises forsiktighet for å legge til tilstrekkelige mengder viruspartikler, da grensen for påvisning av denne analysen nærmer seg 0,1 μg VLP/108 CFU av bakterier. Forhold under denne grensen ga konsekvent prosentvedleggsverdier på 13–19 %; det kan derfor ikke være reelt å observere populasjonsvedlegg ved eller under disse prosentene.

Antistofftitrering ble utført for hvert nylig konjugerte antistoff og mot hver bakteriell belastning før bruk i VLP:bacteria vedleggseksperimenter. Antistoffkonsentrasjoner som kreves for hver bakterie var lik fra 1:250 for E. cloacae og 1:300 for L. gasseri. Den lille størrelsen på bakterier, i forhold til størrelsen på eukaryyotiske celler, krever både spenningsjustering samt bruk av en binomial fordeling under datainnsamling for å tilstrekkelig skille bakterier fra rusk som finnes i prøver eller sirkulerer i instrumentet. Etter datainnsamling kan riktig gating brukes til å fjerne større ruskpartikler og bakterielle klumper ytterligere, slik at bare enkeltcellepopulasjoner analyseres. Det er også avgjørende å etablere unike spenningsinnstillinger for hver bakterielle art som testes, da disse svinger mye, spesielt mellom gramnegative og grampositive bakterier.

Inkludering av riktige kontroller, inkludert kun bakterier og isotypekontroller, er også avgjørende for nøyaktig analyse av dataene. Begge typer kontroller informerer om nivåer av ikke-spesifikk antistoffbinding. Våre resultater viser at antistoffene som brukes til å ikke binde ikke-spesifikt til bakterieartene som er testet, men ikke-spesifikk binding kan endres med endringer i bakterielle arter eller antistoff.

Metoden som presenteres her kvantifiserer humant norovirus partikkelbinding til både gram-positive og gram-negative bakterier og er nyttig i å karakterisere virus: bakterielle interaksjoner. Videre kan denne basisprotokollen lett optimaliseres for bruk med andre genotyper av humant norovirus, samt andre pattedyrvirus og bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Sutonuka Bhar og Chanel Mosby-Haundrup for deres kritiske gjennomgang av det skriftlige manuskriptet, samt Alfonso Carrillo for hjelp med å generere bakterielle standardkurver. Dette arbeidet er delvis finansiert av et stipend fra National Institute of Health (R21AI140012) og av et frøstipend fra University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 158 Humant norovirus enteriske virus-bakterielle interaksjoner komsimensale bakterier humant noroviruskvantifisering human togvirusdeteksjon resistens av virusbakterier
Kvantifisere humant norovirus viruslignende partikler binding til commensal bakterier ved hjelp av flow cytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madrigal, J. L., Jones, M. K.… More

Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter