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Immunology and Infection

Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

O objetivo deste protocolo é quantificar a ligação do norovírus humano eucaiótico às bactérias. Após a realização de um teste inicial de fixação vírus-bactéria, a citometria de fluxo é usada para detectar bactérias viralmente ligadas à população.

Abstract

As bactérias commensal são bem estabelecidas para impactar a infecção de vírus eucaióticos. A ligação direta entre o patógeno e o microbioma hospedeiro é responsável por alterar a infecção para muitos desses vírus. Assim, caracterizar a natureza da ligação vírus-bactérias é um passo fundamental necessário para elucidar os mecanismos pelos quais as bactérias alteram a infecção viral. Para norovírus humano, bactérias commensal aumentam a infecção celular B. O vírus se liga diretamente a essas bactérias, indicando que essa interação direta está envolvida no mecanismo de aumento da infecção. Uma variedade de técnicas pode ser usada para quantificar interações entre bactérias e vírus, incluindo a contagem de cintilação de vírus rotulados por radiorótulos e reação em cadeia de polimerase (PCR). Ambos os métodos requerem o uso de vírus vivo, que pode precisar ser gerado em laboratório. Atualmente, nenhum dos sistemas de cultura in vitro estabelecidos disponíveis para norovírus humano são robustos o suficiente para permitir a geração de estoques virais altamente concentrados. Em vez de vírus vivos, partículas semelhantes a vírus (VLPs) têm sido usadas para caracterizar as interações entre norovírus e bactérias. Aqui, um método de citometria de fluxo é descrito com o uso de anticorpos específicos do vírus para quantificar a ligação VIP a bactérias gram-negativas e gram-positivas. A inclusão de controles apenas de bactérias e isótipo permitiu a otimização do ensaio para reduzir a ligação de anticorpos de fundo e a quantificação precisa do apego VIP às bactérias testadas. Altas relações de VLP:bactérias resultam em VLPs vinculando-se a grandes percentuais da população bacteriana. No entanto, quando as quantidades de VIP são diminuídas, o percentual de bactérias ligadas também diminui. Em última análise, esse método pode ser empregado em experimentos futuros elucidando as condições específicas e componentes estruturais que regulam o norovírus: interações bacterianas.

Introduction

Os norovírus humanos (HuNoVs) são a principal causa de doenças gastrintestinais em todo o mundo, responsáveis por 685 milhões de infecções e mais de 200.000 mortes a cada ano1. Assim como outros vírus entéricos, a presença de bactérias commensal tem sido demonstrada para aumentar a infecção deste patógeno, bem como seu vírus substituto, murine norovirus2,3. Há também relatos conflitantes de que as bactérias podem inibir a infecção por norovírus humano4,5,6. Para vários vírus, a interação direta entre o vírus e as bactérias parecem estar por trás dos mecanismos que impactam a infecção viral2,7,8,9,10, e tem sido mostrado através da microscopia eletrônica que os norovírus humanos se ligam diretamente às superfícies das bactérias11,12. Portanto, caracterizar essas interações tornou-se fundamental para determinar os mecanismos pelos quais as bactérias impactam a infecção viral. Essa caracterização começou de forma clássica com a quantificação da ligação viral a uma matriz de espécies bacterianas componentes do microbioma hospedeiro7,,12,13. Esses ensaios de apego não apenas revelam a quantidade de vírus ligado às bactérias, mas também ajudam a determinar o impacto dessa interação na aptidão viral e na sobrevivência.

Para quantificar o apego viral, os métodos tradicionalmente utilizados incluem ensaios baseados em PCR que quantificam genomas virais12 ou a geração de vírus rotulados por radiovém e o uso da contagem de cintilação para quantificar partículas virais7,,8,9,13. O uso desses métodos geralmente requer acesso a estoques de vírus de alto título e técnicas de cultivo in vitro com as quais gerá-los. Embora existam agora vários sistemas de cultura para norovírus humano2,14,15, nenhum suporta a replicação robusta necessária para gerar esses estoques altamente concentrados que restringe ou elimina o uso de PCR e contagem de cintilação para quantificar as interações norovírus/bacterianas humanas.

Para contornar esse problema, partículas semelhantes a vírus (VLPs) podem ser usadas como substituto para o vírus vivo para investigar interações entre norovírus humano e bactérias16,17. VIPs são partículas não infecciosas que se assemelham ao vírus do qual são derivados. No caso do norovírus humano, essas partículas são geradas a partir da expressão da proteína VP1 (e às vezes a VP2), que se auto-monta para criar capsídeos virais intactos sem material genético (ou seja, RNA para norovírus). Estes VIPs têm sido bem caracterizados, são estruturalmente e antígenicamente semelhantes aos vírus do tipo selvagem dos quais são derivados18,,19,20,21,22,23. Portanto, os VIPs servem como substituto ideal para investigar as interações superficiais entre norovírus humano e bactérias commensal. Dado que os VIPs não possuem material genético, os ensaios baseados em PCR não podem ser usados para quantificar a ligação viral. Um método de citometria de fluxo baseado em anticorpos foi previamente descrito e capaz de detectar baixos níveis de ligação VIP a bactérias de forma semi-quantitativa16. Este método foi otimizado para permitir a quantificação precisa da ligação vip de norovírus humano tanto para as bactérias gram-negativas quanto gram-positivas16.

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Protocol

NOTA: As condições de crescimento bacteriano descritas no protocolo são condições de cultura padrão para Enterobacter cloacae e Lactobacillus gasseri. Para realizar o ensaio de apego de bactérias com outras espécies bacterianas, as bactérias escolhidas devem ser cultivadas em condições padrão adequadas para a bactéria.

1. Preparando o meio de crescimento bacteriano

  1. Enterobacter cloacae mídia de crescimento
    1. Preparar o meio líquido dissolvendo 10 g de tripptone, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio (NaCl) em 1 L de água desionizada (DI) (ver Tabela de Materiais). Misture todas as mídias cuidadosamente e esterilize por autoclaving por 30 min.
    2. Prepare o meio sólido dissolvendo 10 g de tripptone, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água DI. Misture todas as mídias cuidadosamente e esterilize por autoclaving por 30 min.
  2. Mídia de crescimento lactobacillus gasseri
    1. Prepare o meio líquido dissolvendo 55 g de De Man, Rogosa e Sharpe (MRS; ver Tabela de Materiais) em pó em 1 L de água DI. Use o meio dentro de um mês de preparação. Para esterilizar, aqueça médio por 15 min até ferver seguido de autoclaving por 15 min.
    2. Prepare o meio sólido dissolvendo 55 g de pó de MRS e 15 g de ágar em 1 L de água DI. Para esterilizar, aqueça médio por 15 min até ferver seguido de autoclaving por 15 min.

2. Estabelecer uma curva padrão correlacionando densidade óptica (OD) e concentração de bactérias

  1. Inoculados 5 mL de meio líquido apropriado com uma única colônia isolada a partir de uma placa de ágar(E. cloacae) ou diretamente do estoque de glicerol congelado(L. gasseri).
  2. Cultivar a bactéria durante a noite, em condições atmosféricas adequadas (Enterobacter cloacae: 37 °C com agitação aeróbica a 200 rpm; L. gasseri: Banho de água de 37 °C sem tremer em um recipiente hermético).
  3. Transfira as alíquotas de 2 x 1,3 mL da cultura noturna em dois tubos de centrífuga separados de 1,5 mL e bactérias centrífugas a 10.000 x g por 5 min.
  4. Remova o sobrenadante e lave as amostras com 1 mL de soro tampão de fosfato estéril de 1x (PBS). Repita esta etapa de lavagem para um total de 2 lavos.
  5. Centrifugar as amostras novamente a 10.000 x g por 5 min, remover o sobrenadante e resuspender em 1,3 mL de 1x PBS estéril.
  6. Começando com 0,5 mL de cultura lavada, diluir seriamente as bactérias em 1x PBS de 10-1 a 10-4.
  7. Utilizando um espectrofotômetro, meça a densidade óptica da cultura lavada e não diluída e cada uma das quatro diluições a 600 nm (OD600).
  8. Realize diluições seriais de 10 vezes em 1x PBS para cada diluição a partir do passo 2.6. Espalhe a placa 100 μL das últimas 3 diluições para cada série em meio sólido apropriado para determinar o número de unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/mL) de cada amostra. Emplacacada diluição em triplicado.
  9. Deixe as placas secarem à temperatura ambiente por 5 min. Inverta as placas e incuba-se sob as condições atmosféricas adequadas (E. cloacae: aeróbica a 37 °C, incubar placas durante a noite; L. gasseri: anaeróbico a 37 °C, incubar placas por 48 h em um recipiente hermético com sachês de ar anerobico (ver Tabela de Materiais)).
    NOTA: Use 1 sachê de ar anaeróbico por frasco de 2,5 L ou 3 sachês por frasco de 7,0 L (ver Tabela de Materiais).
  10. Contagem de placas de uso para determinar CFU/mL para cada uma das 5 amostras (ou seja, não diluídas, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Gerar uma curva padrão comparando OD600 vs CFU/mL. A equação para esta linha será usada em ensaios de fixação de bactérias VIP para determinar CFU/mL com base em OD600.

3. Ensaio de fixação de bactérias VIP

ATENÇÃO: Os VIPs de norovírus humanos são um nível de biossegurança (BSL)-2 de risco e todo o trabalho envolvendo VIPs deve ser realizado em um gabinete de biossegurança. A preparação das culturas bacterianas, antes do ensaio de fixação, deve ser realizada utilizando condições de segurança adequadas ao organismo.

  1. Preparação de reagente
    1. 1x solução tamponada de fosfato (PBS)
      1. Prepare 1 L de 10x PBS dissolvendo um pacote inteiro em 1 L de água DI.
      2. Solução autoclave para 30 min.
      3. Prepare uma solução 1x diluindo a solução acima 1:10 em água DI.
      4. O filtro esteriliza a solução passando-a através de um filtro de 0,22 μm e armazena a temperatura ambiente.
    2. 5% BSA
      1. Adicione 5 g de pó de albumina de soro bovino (BSA) a 100 mL de PBS para gerar uma solução de 5% (w/v).
      2. Misture a solução por vórtice ou em uma placa de agitação usando uma barra de agitação metálica até que as aglomerações tenham dissolvido.
      3. Filtrar o filtro utilizando um filtro de 0,22 μm.
      4. Armazene a solução a 4 °C.
    3. Tampão de mancha de citometria de fluxo (FCSB)
      1. Filtro comprado FCSB (ver Tabela de Materiais) através de um filtro de 0,22 μm.
      2. Armazene a solução restante a 4 °C.
    4. Buffer de bloqueio de 5% (BB)
      NOTA: Prepare-se fresco cada vez.
      1. Adicione 0,5 g de BSA a 10 mL de FCSB estéril.
      2. Vórtice para misturar totalmente a amostra e deixar no gelo até o uso.
  2. Conjugação de anticorpos
    1. Conjugar anticorpo de norovírus humano GII (ver Tabela de Materiais) com r-phycoeryrin (PE) usando um kit de rotulagem de anticorpos R-PE de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    2. Armazene o anticorpo conjugado no escuro a 4 °C para uso futuro na análise de ensaio de fixação de bactéria VLP.
      NOTA: O anticorpo primário deve ser titulado antes de ser usado no ensaio de fixação de bactérias VIP para determinar a concentração adequada necessária para a análise da citometria do fluxo. A titulação de anticorpos deve ser realizada toda vez que a reação de conjugação é realizada e para cada bactéria usada no ensaio de fixação.
  3. Titulação de anticorpos
    1. Diluir o anticorpo xiovírus gii conjugado 100 vezes, com uma diluição inicial de 1:100 e uma diluição final de 1:600 (seis diluições no total).
    2. Realizar um ensaio de fixação de vírus conforme descrito abaixo com a seguinte exceção: na etapa 3.5.7 resuspender a pelota bacteriana em 350 μL de 5% BB.
    3. Divida a amostra em sete alíquotas de 50 μL.
    4. Adicione 50 μL de cada diluição de anticorpos a um tubo.
    5. Adicione 50 μL de 5% bb ao sétimo tubo como um controle não manchado.
    6. Realize citometria de fluxo em todas as amostras conforme descrito abaixo.
    7. Compare amostras de anticorpos diluídos com controles não manchados e entre si. A menor concentração de anticorpos que não resulta em diminuição ou perda de sinal positivo deve ser escolhida para uso em ensaios subsequentes.
  4. Preparação de bactérias
    1. Cultivar as bactérias em 40 mL de meio líquido apropriado em condições atmosféricas apropriadas até que as bactérias estejam em fase estacionária.
      1. Cultivar culturas E. cloacae aerobicamente durante a noite em Luria Broth a 37 °C, agitando a 200 rpm para chegar à fase estacionária.
      2. Cultivar culturas L. gasseri em caldo MRS em tubos de tampa de parafuso preto sem tremer em um banho de água definido para 37 °C por 18 horas para chegar à fase estacionária.
    2. Transfira culturas de fase estacionária para limpar tubos cônicos de 50 mL e amostras de centrífuga a 2.288 x g por 10 min para pellet as bactérias.
    3. Remova o sobrenadante e resuspenda em 13 mL de 1x PBS estéril. Repita esta etapa de lavagem para um total de duas laves.
    4. Centrifugar novamente as amostras, remover o sobrenadante e resuspender amostras em 20 mL de 1x PBS.
      NOTA: Se a pelota celular for pequena, o volume de resuspensão pode ser reduzido.
    5. Meça oOD 600 da cultura.
    6. Utilizando a curva padrão previamente preparada, determine o FUPor mL da cultura lavada.
    7. Diluir as bactérias conforme necessário com 1x PBS para ajustar a concentração de cultura a 1 x 108 UFC/mL.
    8. Transfira 1 mL da cultura bacteriana 1 x 108 CFU/mL para o número necessário de tubos de centrífuga de 1,5 mL.
    9. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 5 min.
    10. Ressuspensão da pelota bacteriana em 1 mL de BSA estéril de 5%.
    11. Incubar os tubos por 1 h a 37 °C com rotação constante.
  5. Anexo de vírus
    1. Trabalhando dentro de um gabinete de biossegurança BSL-2, adicione 10 μg de VIPs HuNoV (ver Tabela de Materiais) a cada tubo contendo bactérias resuspensas em PBS e misture completamente por pipetting.
      NOTA: A concentração de VIP difere de cada preparação VIP. Portanto, o volume adicionado às bactérias variará entre os lotes de preparação e deve ser ajustado de acordo para que 10 μg sejam adicionados a cada tubo no experimento. Para controles de bactérias apenas (por exemplo, amostras sem VIP), adicione um volume de PBS que equivale ao volume de VIP adicionado às amostras experimentais.
    2. Incubar tubos por 1 h a 37 °C com rotação constante.
      NOTA: Um revólver de tubo (ver Tabela de Materiais) definido a 40 rpm é usado durante a incubação.
    3. Após a incubação, centrifugar as amostras a 10.000 xg por 5 min.
    4. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota bacteriana em 1 mL de PBS.
    5. Repita os passos de lavagem 3.5.3 e 3.5.4.
    6. Centrifugar as amostras a 10.000 xg por 5 min.
    7. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota bacteriana em 150 μL de 5% BB.
  6. Coloração de anticorpos
    1. Prepare fresco 5% BB.
      NOTA: Todo o trabalho utilizando o anticorpo marcado fluorescentemente deve ser realizado no escuro e o anticorpo, BB e FCSB devem ser mantidos no gelo.
    2. Diluir o anticorpo GII de norovírus humano 1:125 para amostras de E. cloacae e 1:150 para amostras de L. gasseri em 5% BB, preparando 50 μL de anticorpo diluído por amostra.
    3. Diluir o anticorpo isótipo da mesma forma que o anticorpo gii norovírus humano foi diluído para cada bactéria em 5% BB, preparando 50 μL de controle de isótipo diluído por amostra.
    4. Divida cada amostra de ensaio de anexo do passo 3.3.7 em três alíquotas de 50 μL, transferindo-as para tubos de centrífuga de 1,5 mL limpos.
    5. Ao primeiro conjunto de amostras, adicione 50 μL de BB. Este conjunto será o controle não manchado (Uns).
    6. Ao segundo conjunto, adicione 50 μL da diluição do anticorpo GII. Isso resulta em uma concentração final de anticorpos de 1:250 para E. cloacae e 1:300 para L. gasseri. Este conjunto de amostras serão as amostras manchadas (AB).
    7. Ao terceiro conjunto, adicione 50 μL do anticorpo isótipo diluído. Este conjunto será os controles de isótipo (IC). Misture bem por pipetting. Incubar as amostras no gelo e no escuro por 30 min.
    8. Centrifugar todas as amostras a 10.000 xg por 5 min.
    9. Descarte o sobrenadante e resuspenda as amostras em 100 μL de FCSB.
    10. Centrifugar todas as amostras a 10.000 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e resuspenda as amostras em 100 μL de FCSB.
    11. Centrifugar todas as amostras a 10.000 xg por 5 min.
    12. Descarte o sobrenadante e resuspenda as amostras em 150 μL de FCSB.
    13. Transfira cada amostra para um tubo FCSB contendo 400 μL de tampão FCSB para um volume total de 550 μL.
    14. Mantenha as amostras a 4 °C até que sejam analisadas por citometria de fluxo.
      NOTA: A citometria de fluxo é realizada dentro de 4h de coloração de anticorpos.

4. Citometria do fluxo

NOTA: As configurações de tensão descritas abaixo são baseadas no citómetro de fluxo e software listados na Tabela de Materiais e provavelmente variarão com diferentes citómetros de fluxo. As configurações devem ser otimizadas para cada bactéria. Certifique-se de que os eixos para todos os gráficos estão em fase biexponencial.

  1. Configuração do espaço de trabalho
    NOTA: A configuração para parcelas utilizadas para estabelecer o espaço de trabalho difere das utilizadas no gating e na análise de dados. O objetivo da criação do espaço de trabalho é visualizar a população celular, garantir que não haja desintegração excessiva das células bacterianas que possam impactar a análise a jusante e distinguir entre células manchadas e não manchadas enquanto os dados são coletados.
    1. Para garantir que as bactérias não se agrupe, configure uma série de parcelas de densidade.
      1. Gerar uma área de dispersão para frente (FSC-A) versus área de dispersão lateral (SSC-A) para visualizar a população total.
      2. Configure plots para avaliar células individuais versus aglomerados de células, criando dois gráficos que comparam tanto a largura de dispersão para a frente (FSC-W) quanto a largura de dispersão lateral (SSC-W) para a frente (FSC-H) e a altura de dispersão lateral (SSC-H), respectivamente.
      3. Criar um gráfico que mostre apenas a população pe positiva (PE-A vs. SSC-A).
    2. Coloque a tensão da linha de base para 500 para E. cloacae e 340 para L. gasseri. Estes serão ajustados mais tarde.
    3. Definir o total de eventos contados para 10.000 eventos.
  2. Executando amostras
    1. Crie três tramas histogramas separadas que mostram a contagem plotada contra SSC-A, FSC-A ou PE-A.
    2. Coloque uma amostra não manchada no citómetro de fluxo e adquira os eventos amostrais, garantindo que o pico máximo no histograma para SSC-A esteja dentro de 102 a 103 e o pico máximo no histograma para FSC-A esteja entre 104 e 105 no eixo x. Caso não, os picos não se enquadram nas faixas especificadas, ajuste as tensões FSC e SSC em conformidade.
    3. Coloque uma amostra manchada (AB) no citómetro de fluxo e ajuste a tensão PE para fazer o pico máximo após 103 no eixo x.
    4. Com base nessas medidas, defina o portão PE positivo e defina o portão no gráfico de densidade PE-A versus SSC-A.
    5. Execute todas as amostras sob as configurações determinadas em baixa ou média velocidade.

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Representative Results

As estratégias de gating utilizadas para quantificar a ligação do norovírus humano à bactéria commensal são mostradas na Figura 1. O ponto de densidade representativa fornece uma visão geral de como as amostras foram fechadas para eliminar detritos celulares e aglomerados celulares para que o anexo VIP fosse determinado em populações únicas(Figura 1A). Histogramas representativos demonstram baixos níveis de sinal de anticorpo anti-norovírus em bactérias apenas amostras sem norovírus VLP e baixo sinal de fundo de amostras de bactérias VIP manchadas com o anticorpo de controle de isótipo(Figura 1B). Os picos de controle de isótipo também se sobrepõem a amostras não manchadas, enquanto a coloração das mesmas amostras com anticorpos anti-norovírus GII resulta em mudança significativa no pico.

O método Overton de subtração do histograma foi utilizado para comparar o sinal PE positivo em anticorpos anti-norovírus GII anti-humanos manchados de amostras com o sinal PE positivo do controle do isótipo correspondente e determinar a porcentagem da população bacteriana vinculada por VLPs de norovírus humanos(Figura 1B). Após 1h de incubação com 10 μg de VLP, a citometria de fluxo detectou a ligação de partículas tanto para E. cloacae quanto para L. gasseri (Figura 2). De fato, ocorreram altos níveis de ligação nessas condições para ambas as bactérias; vinculação a L. gasseri ocorreu em níveis ligeiramente mais elevados, mas significativos (p < 0,0001), em comparação com E. cloacae. Esses ensaios demonstram que a citometria de fluxo pode ser usada para detectar norovírus humano ligado saqueado tanto para bactérias Gram-positivas quanto gram-negativas.

Para determinar o limite de quantificação vinculante para este ensaio, foi gerada uma série de diluição dos VIPs antes da adição à bactéria(Figura 3). Para ambos os gêneros de bactérias, reduções na quantidade de VIP adicionada à cultura bacteriana resultaram em reduções correspondentes no percentual de bactérias ligadas pelo VIP. As alterações no percentual de E. cloacae ligadas pela partícula foram mais graduais em comparação com L. gasseri,mas a fixação percentual para ambas as bactérias nivelou-se apesar de novas reduções na concentração DE PS. Especificamente, 0,1 μg ou menos (dados não mostrados) de VIP em 108 UFC de bactérias resultou em um platô de ligação percentual em média entre 13-19% para ambas as bactérias, indicando que esse percentual é o limite de quantificação para este ensaio.

Figure 1
Figura 1: Análise citométrica de fluxo representativo da ligação VIP do norovírus humano. (A) Estratégia representativa de gating de citometria de fluxo para quantificar a ligação VIP às bactérias. Parcelas de densidade foram usadas para portar detritos celulares, seguidos de subseqüentes gráficos de dot gating para remover doublets bacterianos e aglomerados celulares. (B) Os histogramas representativos demonstram a falta de sinal de Pe em amostras apenas bacterianas e uma mudança na intensidade do sinal de PE em amostras de bactérias VIP em comparação com os controles não manchados e isótipo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Anexo VIP a E. cloacae e L. gasseri. As culturas noturnas de E. cloacae (n = 6) e L. gasseri (n = 6) foram diluídas para 1 x 108 UFC/mL na PBS. As bactérias foram incubadas com 10 μg de GII.4 VLPs por 1h e, em seguida, o acessório VIP foi medido utilizando citometria de fluxo. Um lote representativo pode ser encontrado na Figura 1B. A fixação por cento foi determinada utilizando-se o método Overton de subtração do histograma comparando o sinal PE-positivo das amostras manchadas de Norovírus Humano GII com o sinal PE positivo do controle de isótipo correspondente. A análise estatística foi realizada por meio de teste t de aluno não pareado (p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Série de diluição VIP para E. cloacae e L. gasseri. 10 μg de GII.4 VLPs foram diluídos seriamente e as diluições VIP foram adicionadas a 1 x 108 bactérias em um volume final de 1 mL (n = 3 para ambas as bactérias). As amostras foram incubadas por uma hora a 37 °C. O apego VIP à bactéria foi medido por citometria de fluxo. A fixação por cento foi determinada utilizando-se o método Overton de subtração do histograma comparando o sinal PE-positivo das amostras manchadas de Norovírus Humano GII com o sinal PE positivo do controle de isótipo correspondente. A redução das quantidades de insumos de VLP resultou em reduções de grau de fixação percentual para ambos(A) E. cloacae e (B) L. gasseri. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A capacidade de quantificar a ligação de vírus entéricos às bactérias é um primeiro passo crítico para elucidar os mecanismos pelos quais essas bactérias alteram a infecção viral. Os métodos descritos aqui foram otimizados para medir as interações do norovírus humano COM e. cloacae (bactéria gram-negativa) e L. gasseri (uma bactéria gram-positiva), mas podem ser adaptados para uso com qualquer vírus mamífero e bactéria de interesse. Embora os VIPs sejam uma alternativa ideal para o vírus vivo para uso em ensaios de apego e essas partículas podem ser facilmente quantificadas usando citometria de fluxo, partículas P também têm sido usadas para examinar interações entre norovírus humanos e bactérias24. Neste estudo, a quantidade de vírus ligada à bactéria foi quantificada em oposição à população bacteriana, como é relatado aqui. As partículas P fornecem uma vantagem sobre os VIPs na forma de serem mais fáceis de produzir, proporcionando similaridade antigênica tanto aos VIPs quanto ao vírus do tipo selvagem24,25. No entanto, os VIPs de norovírus humanos estão comercialmente disponíveis, fornecendo um meio para laboratórios sem capacidade de gerar VIPs ou partículas P. As partículas P diferem dos VIPs na medida em que, enquanto os VIPs mantêm o tamanho de uma partícula viral do tipo selvagem, as partículas P são menores e têm tetraédrico em vez de simetria icosaédrica25. O impacto dessas características nas interações com bactérias não foram explorados e as partículas P podem servir como uma alternativa viável aos VIPs na caracterização das interações superficiais entre norovírus humano e bactérias.

Como mencionado anteriormente, o ensaio descrito acima pode ser usado para caracterizar ainda mais as interações entre os VIPs de norovírus humanos e bactérias. Investigações sobre como as condições de crescimento e mudanças na expressão da estrutura da superfície bacteriana alteram a ligação viral usando essa técnica. Além disso, este ensaio também pode ser usado para determinar estruturas bacterianas específicas ligadas pelo vírus através de ensaios de inibição competitivos usando proteínas bacterianas ou glicanos, tratamento enzimático para remover estruturas de superfície específicas, ou incubação com cepas bacterianas mutantes deficientes em particular uma estrutura. Este ensaio também pode ser usado para investigar a capacidade de outras cepas de norovírus interagirem com bactérias commensal.

Como este ensaio quantifica a proporção da população bacteriana vinculada pelo norovírus VIP, é fundamental determinar com precisão a correlação entre UFC/mL eOD 600 para que a concentração da cultura bacteriana possa ser medida. As flutuações na proporção VIP:bactérias alteram a porcentagem da população de bactérias vinculadas por VIPs e podem levar à variabilidade nos resultados. Deve-se tomar também cuidado para adicionar quantidades suficientes de partículas virais, uma vez que o limite de detecção deste ensaio se aproxima de 0,1 μg de VLP/108 UFC de bactérias. Os índices abaixo desse limite consistentemente renderam valores de fixação percentual de 13-19%; assim, o apego populacional observado a ou abaixo desses percentuais pode não ser real.

As titulações de anticorpos foram realizadas para cada anticorpo recém-conjugado e contra cada cepa bacteriana antes de ser usada em experimentos de apego de bactérias. As concentrações de anticorpos necessárias para cada bactéria foram semelhantes, variando de 1:250 para E. cloacae e 1:300 para L. gasseri. O pequeno tamanho das bactérias, em relação ao tamanho das células eucaóticas, requer tanto o ajuste de tensão quanto o uso de uma distribuição binomial durante a coleta de dados para separar adequadamente as bactérias dos detritos que podem ser encontrados em amostras ou circulando dentro do instrumento. Após a coleta de dados, o gating adequado pode ser usado para remover ainda mais partículas de detritos maiores e aglomerados bacterianos para que apenas populações de células únicas sejam analisadas. Também é fundamental estabelecer configurações de tensão únicas para cada espécie bacteriana testada, pois estas flutuam amplamente, particularmente entre bactérias gram-negativas e gram-positivas.

A inclusão de controles adequados, incluindo apenas bactérias e controles de isótipo, também são fundamentais para a análise precisa dos dados. Ambos os tipos de controles informam sobre níveis de ligação de anticorpos não específicos. Nossos resultados demonstram que os anticorpos usados para não se ligar não especificamente às espécies bacterianas testadas, mas a ligação não específica pode mudar com alterações em espécies bacterianas ou anticorpos.

O método aqui apresentado quantifica a ligação de partículas de norovírus humanos a bactérias gram-positivas e gram-negativas e é útil na caracterização do vírus:interações bacterianas. Além disso, este protocolo base pode ser facilmente otimizado para uso com outros genótipos de norovírus humano, bem como outros vírus e bactérias mamíferos.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Sutonuka Bhar e Chanel Mosby-Haundrup por sua revisão crítica do manuscrito escrito, bem como A favor de Alfonso Carrillo pela assistência na geração de curvas padrão bacterianas. Este trabalho é financiado em parte por uma bolsa do Instituto Nacional de Saúde (R21AI140012) e por uma bolsa semente da Universidade da Flórida, Instituto de Ciências Alimentares e Agrícolas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

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References

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

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Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo
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Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

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