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Immunology and Infection

Quantifizierung der menschlichen Norovirus-Virus-ähnlichen Partikelbindung an commensale Bakterien mittels Durchflusszytometrie

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/61048
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, die Bindung des eukaryotischen Erregers humanes Norovirus an Bakterien zu quantifizieren. Nach der Durchführung eines ersten Virus-Bakterium-Anhang-Assays wird die Durchflusszytometrie verwendet, um viral gebundene Bakterien in der Population zu erkennen.

Abstract

Commensal Bakterien sind gut etabliert, um Infektion von eukaryotischen Viren zu beeinflussen. Die direkte Bindung zwischen dem Erreger und dem Wirtsmikrobiom ist für die Veränderung der Infektion für viele dieser Viren verantwortlich. Daher ist die Charakterisierung der Natur der Virus-Bakterien-Bindung ein grundlegender Schritt, der notwendig ist, um den Mechanismus(n) aufzuklären, durch den Bakterien eine Virusinfektion verändern. Für menschliche norovirus, kommensale Bakterien verbessern B-Zell-Infektion. Das Virus bindet direkt an diese Bakterien, was darauf hindeutet, dass diese direkte Interaktion in den Mechanismus der Infektion Verbesserung beteiligt ist. Eine Vielzahl von Techniken kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Viren zu quantifizieren, einschließlich Szintillationszählung von radioaktiv markierten Viren und Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Beide Methoden erfordern die Verwendung von live-Virus, die möglicherweise im Labor erzeugt werden müssen. Derzeit ist keines der etablierten In-vitro-Kultursysteme, die für humane Noroviren verfügbar sind, robust genug, um die Erzeugung hochkonzentrierter Virusbestände zu ermöglichen. Anstelle von lebenden Viren wurden virusähnliche Partikel (VLPs) verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Norovirus und Bakterien zu charakterisieren. Hierbei wird eine Durchflusszytometriemethode mit virusspezifischen Antikörpern beschrieben, um die VLP-Bindung an gramnegative und grampositive Bakterien zu quantifizieren. Die Einbeziehung sowohl von Bakterien als auch isotypischer Kontrollen ermöglichte die Optimierung des Assays, um die Hintergrundantikörperbindung und die genaue Quantifizierung der VLP-Bindung an die getesteten Bakterien zu reduzieren. Hohe VLP:Bakterien-Verhältnisse führen dazu, dass VLPs an große Prozentsätze der Bakterienpopulation binden. Wenn jedoch die VLP-Mengen verringert werden, nimmt auch der Anteil der gebundenen Bakterien ab. Letztlich kann diese Methode in zukünftigen Experimenten verwendet werden, um die spezifischen Bedingungen und strukturellen Komponenten zu klären, die norovirus regulieren: bakterielle Wechselwirkungen.

Introduction

Humane Noroviren (HuNoVs) sind die Hauptursache für Magen-Darm-Erkrankungen weltweit, verantwortlich für 685 Millionen Infektionen und über 200.000 Todesfälle pro Jahr1. Wie bei anderen enterischen Viren, das Vorhandensein von kommensalen Bakterien hat gezeigt, dass die Infektion dieses Erregers sowie sein Ersatzvirus, murines Norovirus2,3zu verbessern. Es gibt auch widersprüchliche Berichte, dass Bakterien infektiondurch menschliche sonrovirushemmenkönnen 4,5,6. Bei mehreren Viren scheint die direkte Interaktion zwischen dem Virus und Bakterien den Mechanismen zugrunde zu liegen, die dieVirusinfektion2,7,8,9,10, und es wurde durch Elektronenmikroskopie gezeigt, dass menschliche Noroviren direkt an die Oberflächen von Bakterien binden11,12. Daher ist die Charakterisierung dieser Wechselwirkungen entscheidend für die Bestimmung der Mechanismen geworden, durch die Bakterien die Virusinfektion beeinflussen. Diese Charakterisierung hat klassisch mit der Quantifizierung der viralen Bindung an eine Reihe von Bakterienarten begonnen, die Bestandteile des Wirtsmikrobioms7,12,13sind. Diese Anhang Assays offenbaren nicht nur die Menge an Virus an Bakterien gebunden, sondern auch helfen bei der Bestimmung der Auswirkungen dieser Interaktion auf virale Fitness und Überleben.

Zur Quantifizierung der viralen Anhaftung umfassen traditionell verwendete Methoden PCR-basierte Assays, die virale Genome12 oder die Erzeugung von radioaktiv markierten Viren quantifizieren, und die Verwendung von Szintillationszählungen zur Quantifizierung viraler Teilchen7,8,9,13. Die Anwendung dieser Methoden erfordert in der Regel den Zugang zu Beständen mit hohem Titervirus und In-vitro-Anbautechniken, mit denen sie erzeugt werden können. Während mehrere Kultursysteme für menschliches Norovirus jetzt2,14,15, keines unterstützt die robuste Replikation erforderlich, um diese hochkonzentrierten Bestände zu generieren, die die Verwendung von PCR und Szintillationszählung begrenzt oder eliminiert, um menschliche Norovirus/Bakterien-Wechselwirkungen zu quantifizieren.

Um dieses Problem zu umgehen, können virusähnliche Partikel (VLPs) als Ersatz für lebende Viren verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Noroviren und Bakterien zu untersuchen16,17. VLPs sind nicht-infektiöse Partikel, die dem Virus, von dem sie abgeleitet werden, sehr ähnlich sind. Beim menschlichen Norovirus werden diese Teilchen aus der Expression des VP1-Proteins (und irgendwann des VP2-Proteins) erzeugt, das sich selbst zusammensetzt, um intakte virale Kapsiden ohne genetisches Material (d.h. RNA für Noroviren) zu erzeugen. Diese VLPs sind gut charakterisiert, sind strukturell und antigen ähnlich wie die Wildtypviren, von denen sie abgeleitet sind18,19,20,21,22,23. Daher dienen VLPs als ideales Ersatzfürst, um die Oberflächenwechselwirkungen zwischen humanen Noroviren und Kommensalen zu untersuchen. Da VLPs an genetischem Material fehlen, können PCR-basierte Assays nicht zur Quantifizierung der viralen Bindung verwendet werden. Eine Antikörper-basierte Durchflusszytometrie-Methode wurde zuvor beschrieben und konnte niedrige KONZENTRATIONen von VLP-Bindung an Bakterien semiquantitativ erkennen16. Diese Methode wurde optimiert, um eine genaue Quantifizierung der menschlichen Norovirus-VLP-Bindung an gramnegative und grampositive Commensalbakterien zu ermöglichen16.

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Protocol

HINWEIS: Die im Protokoll beschriebenen bakteriellen Wachstumsbedingungen sind Standardkulturbedingungen für Enterobacter cloacae und Lactobacillus gasseri. Um das Virus durchzuführen: Bakterien-Anhang assay mit anderen Bakterienarten, sollten die ausgewählten Bakterien unter Standardbedingungen für das Bakterium geeignet kultiviert werden.

1. Vorbereitung bakterielles Wachstumsmedium

  1. Enterobacter cloacae Wachstumsmedien
    1. Bereiten Sie flüssiges Medium durch Auflösen von 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid (NaCl) in 1 L entionisiertem (DI) Wasser (siehe Materialtabelle). Mischen Sie alle Medien gründlich und sterilisieren durch Autoklavieren für 30 min.
    2. Bereiten Sie festes Medium durch Auflösen von 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 15 g Agar in 1 L DI-Wasser vor. Mischen Sie alle Medien gründlich und sterilisieren durch Autoklavieren für 30 min.
  2. Lactobacillus gasseri Wachstumsmedien
    1. Bereiten Sie flüssiges Medium durch Auflösen von 55 g De Man, Rogosa und Sharpe (MRS; siehe Tabelle der Materialien) Pulver in 1 L DI-Wasser. Verwenden Sie Medium innerhalb eines Monats nach der Vorbereitung. Zum Sterilisieren, Erhitzen Medium für 15 min bis zum Kochen gefolgt von Autoklavierung für 15 min.
    2. Bereiten Sie festes Medium durch Auflösen von 55 g MRS-Pulver und 15 g Agar in 1 L DI-Wasser vor. Zum Sterilisieren, Erhitzen Medium für 15 min bis zum Kochen gefolgt von Autoklavierung für 15 min.

2. Ermittlung einer Standardkurve, die optische Dichte (OD) und Bakterienkonzentration korreliert

  1. 5 ml des geeigneten flüssigen Mediums mit einer einzigen, isolierten Kolonie aus einer Agarplatte (E. cloacae) oder direkt aus gefrorenem Glycerinbestand (L. gasseri) impfen
  2. Das Bakterium über Nacht unter den richtigen atmosphärischen Bedingungen anbauen (Enterobacter cloacae: 37 °C mit aerobem Schütteln bei 200 U/min; L. gasseri: 37 °C Wasserbad ohne Schütteln in einem luftdichten Behälter).
  3. 2 x 1,3 ml Aliquots der Nachtkultur in zwei separate 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und Zentrifugenbakterien bei 10.000 x g für 5 min übertragen.
  4. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie Proben mit 1 ml steriler 1x Phosphatgepufferter Saline (PBS). Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt 2 Wäschen.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben für 5 min wieder bei 10.000 x g, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie sie in 1,3 ml sterilem 1x PBS wieder auf.
  6. Beginnend mit 0,5 ml gewaschener Kultur, verdünnen Sie die Bakterien in 1x PBS von 10-1 bis 10-4.
  7. Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte der gewaschenen, unverdünnten Kultur und jede der vier Verdünnungen bei 600 nm (OD600).
  8. Führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen in 1x PBS für jede Verdünnung ab Schritt 2.6 durch. Verteilen Sie die Platte 100 l der letzten 3 Verdünnungen für jede Serie auf geeignetes Festmedium, um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) jeder Probe zu bestimmen. Platte jede Verdünnung in Dreifache.
  9. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur für 5 min trocknen. Invertieren Sie die Platten und inkubieren Sie unter den entsprechenden atmosphärischen Bedingungen (E. cloacae: aerobic bei 37 °C, Brutplatten über Nacht; L. gasseri: anaerobe bei 37 °C, Inkubationsplatten für 48 h in einem luftdichten Behälter mit anerobischen Luftbeuteln (siehe Materialtabelle)).
    HINWEIS: Verwenden Sie 1 anaerobe Luftbeutel pro 2,5 L Glas oder 3 Beutel pro 7,0 l Glas (siehe Tabelle der Materialien).
  10. Verwenden Sie Plattenzahlen, um CFU/ml für jede der 5 Proben zu bestimmen (d. h. unverdünnt, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Generieren Sie eine Standardkurve, die OD600 vs CFU/mL vergleicht. Die Gleichung für diese Linie wird in VLP-Bakterien-Anhangassays verwendet, um CFU/mL basierend auf OD600zu bestimmen.

3. VLP-Bakterien Attachment Assay

VORSICHT: Humane Norovirus-VLPs sind eine Biosicherheitsstufe (BSL)-2-Gefahr, und alle Arbeiten mit VLPs sollten in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Vorbereitung der Bakterienkulturen sollte vor dem Anhaftungstest unter den für den Organismus geeigneten Sicherheitsbedingungen durchgeführt werden.

  1. Reagenz-Präparation
    1. 1x Phosphat gepufferte Saline (PBS)
      1. Bereiten Sie 1 L 10x PBS vor, indem Sie ein ganzes Paket in 1 L DI-Wasser auflösen.
      2. Autoklavlösung für 30 min.
      3. Bereiten Sie eine 1x Lösung vor, indem Sie die oben genannte Lösung 1:10 in DI-Wasser verdünnen.
      4. Filter sterilisieren die Lösung, indem sie durch einen 0,22 m Filter geleitet und bei Raumtemperatur gelagert werden.
    2. 5% BSA
      1. Fügen Sie 5 g Rinderserumalbumin (BSA) Pulver zu 100 ml PBS hinzu, um eine 5% (w/v) Lösung zu erzeugen.
      2. Mischen Sie die Lösung durch Wirbeln oder auf einer Rührplatte mit einem Metallrührstab, bis sich die Klumpen aufgelöst haben.
      3. Filter sterilisieren mit einem 0,22 m Filter.
      4. Bewahren Sie die Lösung bei 4 °C auf.
    3. Durchflusszytometrie-Fleckenpuffer (FCSB)
      1. Filter kaufte FCSB (siehe Tabelle der Materialien) durch einen 0,22 m Filter.
      2. Restlösung bei 4 °C lagern.
    4. 5% Blockierpuffer (BB)
      HINWEIS: Bereiten Sie jedes Mal frisch vor.
      1. Fügen Sie 0,5 g BSA auf 10 ml sterilen FCSB hinzu.
      2. Wirbel, um Probe vollständig zu mischen und auf Eis lassen, bis zum Gebrauch.
  2. Antikörperkonjugation
    1. Konjugieren Sie den humanen Norovirus-GII-Antikörper (siehe Materialtabelle) mit R-Phycoerythrin (PE) unter Verwendung eines R-PE-Antikörper-Etikettierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Bewahren Sie den konjugierten Antikörper im Dunkeln bei 4 °C für die zukünftige Verwendung in der VLP-Bakterium-Anhangs-Assay-Analyse auf.
      HINWEIS: Der primäre Antikörper sollte vor der Verwendung im VLP-Bakterien-Anhangstest titriert werden, um die richtige Konzentration zu bestimmen, die für die Durchflusszytometrieanalyse erforderlich ist. Die Antikörpertitration sollte jedes Mal durchgeführt werden, wenn die Konjugationsreaktion durchgeführt wird, und für jedes Bakterium, das in der Anhaftungs-Assay verwendet wird.
  3. Antikörpertitration
    1. Verdünnen Sie den konjugierten antihumanen Norovirus-GII-Antikörper 100-fach, mit einer Beginnenverdünnung von 1:100 und einer Endverdünnung von 1:600 (insgesamt sechs Verdünnungen).
    2. Führen Sie einen Virusanhangstest durch, wie unten beschrieben, mit der folgenden Ausnahme: In Schritt 3.5.7 setzen Sie das bakterielle Pellet in 350 l von 5% BB wieder auf.
    3. Teilen Sie die Probe in sieben 50-L-Aliquots auf.
    4. Fügen Sie 50 l jeder Antikörperverdünnung zu einem Röhrchen hinzu.
    5. Fügen Sie dem siebten Rohr 50 l von 5 % BB als unbefleckte Steuerung hinzu.
    6. Führen Sie die Durchflusszytometrie für alle Proben wie unten beschrieben durch.
    7. Vergleichen Sie verdünnte Antikörperproben mit ungefärbten Kontrollen und miteinander. Die niedrigste Antikörperkonzentration, die nicht zu einer Abnahme oder einem Verlust des positiven Signals führt, sollte für die Verwendung in nachfolgenden Assays gewählt werden.
  4. Herstellung von Bakterien
    1. Wachsen Sie die Bakterien in 40 ml des geeigneten flüssigen Mediums unter geeigneten atmosphärischen Bedingungen, bis die Bakterien in der stationären Phase sind.
      1. Wachsen Sie E. Cloacae Kulturen aerob über Nacht in Luria Broth bei 37 °C, schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute, um stationäre Phase zu erreichen.
      2. L. Gasseri-Kulturen in MRS-Brühe in schwarzen Schraubverschlussrohren ohne Schütteln in einem Auf 37 °C eingestellten Wasserbad für 18 h wachsen, um die stationäre Phase zu erreichen.
    2. Übertragen Sie stationäre Phasenkulturen, um 50 ml konische Rohre und Zentrifugenproben bei 2.288 x g für 10 min zu reinigen, um die Bakterien zu pellet.
    3. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 13 ml steriler 1x PBS wieder auf. Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt zwei Wäschen.
    4. Zentrifugieren Sie die Proben erneut, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Proben in 20 ml 1x PBS wieder auf.
      HINWEIS: Wenn das Zellpellet klein ist, kann das Resuspensionsvolumen verringert werden.
    5. Messen Sie die OD600 der Kultur.
    6. Bestimmen Sie anhand der zuvor vorbereiteten Standardkurve die CFU pro ml der gewaschenen Kultur.
    7. Verdünnen Sie die Bakterien nach Bedarf mit 1x PBS, um die Kulturkonzentration auf 1 x 108 KBE/ml anzupassen.
    8. Übertragen Sie 1 ml der 1 x 108 KBE/ml-Bakterienkultur auf die erforderliche Anzahl von 1,5 ml Zentrifugenrohren.
    9. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 10.000 x g für 5 min.
    10. Setzen Sie das bakterielle Pellet in 1 ml steriler 5% BSA aus.
    11. Inkubieren Sie die Rohre für 1 h bei 37 °C mit konstanter Drehung.
  5. Virus-Anhang
    1. Wenn Sie in einem BSL-2-Biosicherheitsschrank arbeiten, fügen Sie jedem Rohr, das In PBS resuspendierte Bakterien enthält, 10 g HuNoV VLPs (siehe Materialtabelle)hinzufügen und gründlich durch Pipettieren mischen.
      HINWEIS: Die VLP-Konzentration unterscheidet sich mit jedem VLP-Präparat. Daher variiert das Denkobakterien zugesetzte Volumen zwischen den Zubereitungschargen und sollte entsprechend angepasst werden, so dass jeder Röhre im Experiment 10 g zugesetzt werden. Nur für Bakterienkontrollen (z. B. Proben ohne VLP) fügen Sie ein PBS-Volumen hinzu, das dem Volumen von VLP entspricht, das experimentellen Proben hinzugefügt wird.
    2. Röhren für 1 h bei 37 °C bei konstanter Drehung inkubieren.
      HINWEIS: Ein Rohrrevolver (siehe Materialtabelle)mit 40 U/min wird während der Inkubation verwendet.
    3. Zentrifugieren Sie die Proben nach der Inkubation 5 min bei 10.000 x g.
    4. Überstand entsorgen und bakterielles Pellet in 1 ml PBS wieder aufsetzen.
    5. Wiederholen Sie die Waschschritte 3.5.3 und 3.5.4.
    6. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 5 min.
    7. Verwerfen Sie Überstand und setzen Sie bakteriellepellet in 150 l von 5% BB aus.
  6. Antikörperfärbung
    1. Bereiten Sie frische 5% BB.
      HINWEIS: Alle Arbeiten mit dem fluoreszierend markierten Antikörper sollten im Dunkeln durchgeführt werden und der Antikörper, BB und FCSB sollten auf Eis gehalten werden.
    2. Verdünnung des humanen Norovirus-GII-Antikörpers 1:125 für E. Cloacae-Proben und 1:150 für L. Gasseri-Proben in 5% BB, wodurch 50 l verdünnter Antikörper pro Probe hergestellt werden.
    3. Verdünnen Sie den Isotyp-Antikörper auf die gleiche Weise, wie der humane Norovirus GII Antikörper für jedes Bakterium in 5% BB verdünnt wurde, wodurch 50 l verdünnte Isotypkontrolle pro Probe hergestellt wurden.
    4. Teilen Sie jede Befestigungsprobe aus Schritt 3.3.7 in drei 50 L-Aliquots auf, indem Sie sie in saubere 1,5 ml Zentrifugenrohre übertragen.
    5. Fügen Sie dem ersten Satz von Proben 50 L BB hinzu. Dieser Satz wird die unbefleckte (Uns) Steuerung sein.
    6. Zum zweiten Satz 50 l der GII-Antikörperverdünnung hinzufügen. Dies führt zu einer endgültigen Antikörperkonzentration von 1:250 für E. cloacae und 1:300 für L. gasseri. Bei diesem Mustersatz handelt es sich um die gebeizten (AB) Proben.
    7. Zum dritten Satz 50 l des verdünnten Isotyp-Antikörpers hinzufügen. Dieser Satz ist die Isotype-Steuerung (IC). Durch Pipettieren gut mischen. Inkubieren Sie die Proben auf Eis und im Dunkeln für 30 min.
    8. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 x g für 5 min.
    9. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Proben in 100 l DES FCSB wieder aus.
    10. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Proben in 100 l FCSB wieder aus.
    11. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 x g für 5 min.
    12. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Proben in 150 l DES FCSB wieder aus.
    13. Übertragen Sie jede Probe in ein FCSB-Rohr, das 400 l FCSB-Puffer für ein Gesamtvolumen von 550 l enthält.
    14. Halten Sie die Proben bei 4 °C, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert werden.
      HINWEIS: Die Durchflusszytometrie wird innerhalb von 4 h der Antikörperfärbung durchgeführt.

4. Durchflusszytometrie

HINWEIS: Die unten beschriebenen Spannungseinstellungen basieren auf dem Durchflusszytometer und der Software, die in der Materialtabelle aufgeführt sind, und variieren wahrscheinlich mit verschiedenen Durchflusszytometern. Die Einstellungen sollten für jedes Bakterium optimiert werden. Stellen Sie sicher, dass sich die Achsen für alle Diagramme in der biexponentiellen Phase befinden.

  1. Einrichten des Arbeitsbereichs
    HINWEIS: Die Einrichtung für Diagramme, die zum Einrichten des Arbeitsbereichs verwendet werden, unterscheidet sich von denen, die bei der Gating- und Datenanalyse verwendet werden. Der Zweck der Einrichtung des Arbeitsbereichs besteht darin, die Zellpopulation zu visualisieren, sicherzustellen, dass es keine übermäßige Verklumpung der Bakterienzellen gibt, die die nachgelagerte Analyse beeinflussen könnte, und zwischen gefärbten und ungefärbten Zellen zu unterscheiden, während Daten gesammelt werden.
    1. Um sicherzustellen, dass Bakterien nicht zusammenklumpen, richten Sie eine Reihe von Dichtediagrammen ein.
      1. Generieren Sie einen Vorwärtsstreubereich (FSC-A) im Vergleich zu einem Side Scatter Area (SSC-A), um die Gesamtpopulation zu visualisieren.
      2. Richten Sie Diagramme ein, um einzelne Zellen im Vergleich zu Zellklumpen auszuwerten, indem Sie zwei Diagramme erstellen, die sowohl vorwärts (FSC-W) als auch eine Seitenstreubreite (SSC-W) nach vorne (FSC-H) bzw. Seitenstreuhöhe (SSC-H) vergleichen.
      3. Erstellen Sie ein Diagramm, das nur die PE-positive Population (PE-A vs. SSC-A) anzeigt.
    2. Legen Sie die Ausgangsspannung auf 500 für E. cloacae und 340 für L. gasserifest. Diese werden später weiter angepasst.
    3. Legen Sie die Gesamtzahl der gezählten Ereignisse auf 10.000 Ereignisse fest.
  2. Laufproben
    1. Erstellen Sie drei separate Histogrammdiagramme, die die Anzahl der Gegentore zu SSC-A, FSC-A oder PE-A anzeigen.
    2. Legen Sie eine unbefleckte Probe auf das Durchflusszytometer und erfassen Sie die Probenereignisse, um sicherzustellen, dass die maximale Spitze auf dem Histogramm für SSC-A innerhalb von 102 bis 103 liegt und die maximale Spitze auf dem Histogramm für FSC-A zwischen 104 und 105 auf der x-Achse liegt. Ist dies nicht der Fall, liegen die Spitzen nicht innerhalb der angegebenen Bereiche, passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen entsprechend an.
    3. Legen Sie eine gebeizte Probe (AB) auf das Durchflusszytometer und passen Sie die Spannung PE an, um die maximale Spitze über 103 auf der x-Achse zu machen.
    4. Basierend auf diesen Messungen, stellen Sie das positive PE-Gate und das Tor auf dem PE-A versus SSC-A Dichtegraph.
    5. Führen Sie alle Samples unter den festgelegten Einstellungen mit niedriger oder mittlerer Geschwindigkeit aus.

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Representative Results

Die Gating-Strategien zur Quantifizierung der menschlichen Norovirus-VLP-Bindung an commensale Bakterien sind in Abbildung 1dargestellt. Repräsentativer Dichtepunkt bietet einen Überblick darüber, wie Proben abgezäutt wurden, um Zellablagerungen und Zellklumpen zu beseitigen, so dass die VLP-Befestigung auf Singlet-Populationen bestimmt wurde (Abbildung 1A). Repräsentative Histogramme zeigen niedrige Konzentrationen von Anti-Norovirus-Antikörpersignal in Bakterien nur Proben ohne Norovirus VLP und niedriges Hintergrundsignal von VLP-Bakterienproben mit dem Isotyp-Kontrollantikörper gefärbt (Abbildung 1B). Isotyp-Kontrollspitzen überlappen sich auch mit ungefärbten Proben, während die Färbung der gleichen Proben mit antihumanen Norovirus-GII-Antikörpern zu einer signifikanten Verschiebung des Peaks führt.

Die Overton-Methode der Histogrammsubtraktion wurde verwendet, um das PE-positive Signal in antihumanen Norovirus-GII-Antikörper-Gefärbten mit dem PE-positiven Signal der entsprechenden Isotypkontrolle zu vergleichen und den Prozentsatz der bakteriellen Population zu bestimmen, der durch menschliche Norovirus-VLPs gebunden ist (Abbildung 1B). Nach 1 h Inkubation mit 10 g VLP wurde durch die Durchflusszytometrie partikelbindend sowohl an E. cloacae als auch an L. gasseri (Abbildung 2). In der Tat, hohe Konzentrationen der Bindung trat unter diesen Bedingungen für beide Bakterien; Bindung an L. gasseri trat bei etwas höheren, aber signifikanten (p < 0.0001), Niveaus im Vergleich zu E. cloacae. Diese Assays zeigen, dass die Durchflusszytometrie verwendet werden kann, um menschliche Norovirus-Bindung an Gram-positive und Gram-negative Bakterien zu erkennen.

Um die Grenze der Bindungsquantifizierung für diesen Test zu bestimmen, wurde vor der Zugabe zu den Bakterien eine Verdünnungsreihe der VLPs erzeugt (Abbildung 3). Bei beiden Gattungen von Bakterien führte die Verringerung der VLP-Menge, die der Bakterienkultur zugesetzt wurde, zu einer entsprechenden Verringerung des Prozentsatzes der durch VLP gebundenen Bakterien. Veränderungen im Prozentsatz der E. Cloacae durch das Teilchen gebunden waren allmählicher im Vergleich zu L. gasseri, aber Prozent Anhaftung für beide Bakterien abgeflacht trotz weiterer Verringerung der VLP-Konzentration. Insbesondere ergaben 0,1 g oder weniger (daten nicht gezeigt) von VLP in 108 KBE von Bakterien ein Plateau von prozentigen Anhaftungsdurchschnitten zwischen 13 und 19% für beide Bakterien, was darauf hindeutet, dass dieser Prozentsatz die Grenze der Quantifizierung für diesen Test ist.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative zytometrische Analyse der menschlichen Norovirus-VLP-Bindung. (A) Repräsentative Flusszytometrie-Gating-Strategie zur Quantifizierung der VLP-Bindung an Bakterien. Dichteplots wurden verwendet, um zelluläre Trümmer auszukleben, gefolgt von nachfolgenden Punktplot-Gating, um bakterielle Doublets und Zellklumpen zu entfernen. (B) Repräsentative Histogramme zeigen einen Mangel an PE-Signal in bakteriellen Proben und eine Verschiebung der PE-Signalintensität in VLP:Bakteriumproben im Vergleich zu ungefärbten und Isotypkontrollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: VLP-Befestigung an E. cloacae und L. gasseri. Die Nachtkulturen von E. cloacae (n = 6) und L. gasseri (n = 6) wurden in PBS auf 1 x 108 KBE/ml verdünnt. Die Bakterien wurden mit 10 g GII.4 VLPs für 1 h inkubiert, dann wurde die VLP-Befestigung mittels Durchflusszytometrie gemessen. Ein repräsentatives Diagramm finden Sie in Abbildung 1B. Die prozentuale Anhaftung wurde mit der Overton-Methode der Histogrammsubtraktion bestimmt, die das PE-positive Signal der GII Human Norovirus-gefärbten Proben mit dem PE-positiven Signal der entsprechenden Isotypkontrolle vergleicht. Die statistische Analyse wurde mit einem ungepaarten Schüler-T-Test (p < 0.0001) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: VLP-Verdünnungsserie für E. cloacae und L. gasseri. 10 g GII.4 VLPs wurden seriell verdünnt und die VLP-Verdünnungen wurden jeweils 1 x 108 Bakterien in einem Endvolumen von 1 ml (n = 3 für beide Bakterien) zugesetzt. Die Proben wurden eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die VLP-Anhaftung an den Bakterien wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die prozentuale Anhaftung wurde mit der Overton-Methode der Histogrammsubtraktion bestimmt, die das PE-positive Signal der GII Human Norovirus-gefärbten Proben mit dem PE-positiven Signal der entsprechenden Isotypkontrolle vergleicht. Die Reduzierung der VLP-Eingangsmengen führte zu schrittweisen Reduzierungen der prozentualen Bindung sowohl für (A) E. cloacae als auch (B) L. gasseri. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Fähigkeit, die Bindung von enterischen Viren an Bakterien zu quantifizieren, ist ein entscheidender erster Schritt, um die Mechanismen aufzuklären, mit denen diese Bakterien eine Virusinfektion verändern. Die hier beschriebenen Methoden wurden optimiert, um menschliche Norovirus-VLP-Wechselwirkungen mit E. cloacae (gramnegatives Bakterium) und L. gasseri (ein grampositives Bakterium) zu messen, können aber für die Verwendung mit jedem Säugetiervirus und Bakterium von Interesse angepasst werden. Während VLPs eine ideale Alternative zu lebenden Viren für den Einsatz in Attachment-Assays sind und diese Partikel leicht mit Durchflusszytometrie quantifiziert werden können, wurden P-Partikel auch verwendet, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Noroviren und Bakterien zu untersuchen24. In dieser Studie wurde die Menge des an die Bakterien gebundenen Viruses im Gegensatz zur Bakterienpopulation quantifiziert, wie hier berichtet wird. P-Partikel bieten einen Vorteil gegenüber VLPs, da sie leichter zu produzieren sind, während sie antigene Ähnlichkeiten mit VLPs und Wildtyp-Viren24,25bieten. Menschliche Norovirus-VLPs sind jedoch kommerziell verfügbar und bieten ein Mittel für Laboratorien, die nicht in der Lage sind, VLPs oder P-Partikel zu erzeugen. P-Partikel unterscheiden sich von VLPs dadurch, dass VLPs die Größe eines viralen Wildpartikels beibehalten, P-Partikel kleiner sind und eher tetraeder als ikosaedrale Symmetrie25aufweisen. Die Auswirkungen dieser Eigenschaften auf Wechselwirkungen mit Bakterien wurden nicht untersucht, und P-Partikel können als praktikable Alternative zu VLPs bei der Charakterisierung von Oberflächeninteraktionen zwischen menschlichen Noroviren und Bakterien dienen.

Wie bereits erwähnt, kann der oben beschriebene Assay verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Norovirus-VLPs und Bakterien weiter zu charakterisieren. Mit dieser Technik können Untersuchungen untersucht werden, wie Wachstumsbedingungen und Veränderungen der bakteriellen Oberflächenstrukturexpression die virale Bindung verändern. Darüber hinaus kann dieser Assay auch verwendet werden, um bestimmte bakterielle Strukturen zu bestimmen, die durch das Virus durch Wettbewerbsinhibitionstests mit bakteriellen Proteinen oder Glykanen, enzymatische Behandlung zur Entfernung spezifischer Oberflächenstrukturen oder Inkubation mit mutierten Bakterienstämmen, die insbesondere eine Struktur aufweisen, gebunden sind. Dieser Assay kann auch verwendet werden, um die Fähigkeit anderer Norovirus-Stämme zu untersuchen, mit kommensalen Bakterien zu interagieren.

Da dieser Test den Anteil der bakteriellen Population quantifiziert, die durch Norovirus VLP gebunden ist, ist es wichtig, die Korrelation zwischen CFU/mL und OD600 genau zu bestimmen, damit die Konzentration der Bakterienkultur gemessen werden kann. Schwankungen im VLP:Bakterien-Verhältnis verändern den Prozentsatz der Bakterienpopulation, die an VLPs gebunden sind, und können zu Variabilität der Ergebnisse führen. Es sollte auch darauf geachtet werden, ausreichende Mengen an Viruspartikeln hinzuzufügen, da sich die Nachweisgrenze dieses Assays 0,1 g VLP/108 KBE von Bakterien nähert. Die Werte unterhalb dieser Grenze ergaben durchweg prozentuale Bindungswerte von 13–19 %; daher kann die beobachtete Bevölkerungsbindung an oder unter diesen Prozentsätzen möglicherweise nicht real sein.

Antikörpertitrationen wurden für jeden neu konjugierten Antikörper und gegen jeden Bakterienstamm vor der Verwendung in VLP:bacteria-Anhangsexperimenten durchgeführt. Die für jedes Bakterium erforderlichen Antikörperkonzentrationen reichten von 1:250 für E. cloacae und 1:300 für L. gasseri. Die geringe Größe von Bakterien, relativ zur Größe der eukaryotischen Zellen, erfordert sowohl eine Spannungsanpassung als auch die Verwendung einer Binomialverteilung während der Datenerfassung, um Bakterien angemessen von Schmutz zu trennen, die in Proben gefunden werden können oder innerhalb des Instruments zirkulieren. Nach der Datenerfassung kann das richtige Gating verwendet werden, um größere Schmutzpartikel und bakterielle Klumpen weiter zu entfernen, sodass nur Einzelzellpopulationen analysiert werden. Es ist auch wichtig, einzigartige Spannungseinstellungen für jede getestete Bakterienart festzulegen, da diese stark schwanken, insbesondere zwischen gramnegativen und grampositiven Bakterien.

Die Einbeziehung ordnungsgemäßer Kontrollen, einschließlich nur Bakterien und Isotypkontrollen, ist ebenfalls entscheidend für eine genaue Analyse der Daten. Beide Arten von Kontrollen informieren über die Konzentrationen der nicht spezifischen Antikörperbindung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich die Antikörper, die nicht spezifisch an die getesteten Bakterienarten binden, sondern die unspezifische Bindung mit Veränderungen bei Bakterienarten oder Antikörpern ändern können.

Die hier vorgestellte Methode quantifiziert die Bindung menschlicher Noroviruspartikel an grampositive und gramnegative Bakterien und ist nützlich bei der Charakterisierung von Virus:bakteriellen Wechselwirkungen. Darüber hinaus kann dieses Basisprotokoll leicht für die Verwendung mit anderen Genotypen des menschlichen Norovirus sowie anderen Säugetierviren und Bakterien optimiert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir danken Sutonuka Bhar und Chanel Mosby-Haundrup für ihre kritische Überprüfung des schriftlichen Manuskripts sowie Alfonso Carrillo für die Unterstützung bei der Erzeugung bakterieller Standardkurven. Diese Arbeit wird zum Teil durch ein Stipendium des National Institute of Health (R21AI140012) und durch ein Saatgutstipendium der University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap Corning 352235 After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar Sigma A7002 Used for media preparation
AnaeroPack Thermo Scientific R681001 Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1605 Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) BD Biosciences 554657 Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience Thermo Fisher Scientific 12473281 Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder BD Biosciences 288130 Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) Thermo Fisher Scientific MA5-18241 Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP Creative Biostructure CBS-V700 human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X Fisher Bioreagents BP665 Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit Thermo Fisher Scientific S10467 Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Used for media preparation
Tryptone Oxoid LP0042 Used for media preparation
Tube Revolver ThermoFisher Scientific 88881001 Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract BD Biosciences 212750 Used for media preparation

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References

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

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Madrigal, J. L., Jones, M. K. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (158), e61048, doi:10.3791/61048 (2020).

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