Summary
El objetivo de este protocolo es cuantificar la unión del norovirus humano del patógeno eucariota a las bacterias. Después de realizar un ensayo inicial de apego a la bacteria del virus, la citometría de flujo se utiliza para detectar bacterias ligadas viralmente dentro de la población.
Abstract
Las bacterias commensales están bien establecidas para afectar la infección de los virus eucariotas. La unión directa entre el patógeno y el microbioma huésped es responsable de alterar la infección de muchos de estos virus. Por lo tanto, caracterizar la naturaleza de la unión virus-bacteria es un paso fundamental necesario para esclarecer el mecanismo o mecanismos por los cuales las bacterias alteran la infección viral. Para el norovirus humano, las bacterias commensales mejoran la infección de la célula B. El virus se une directamente a estas bacterias, lo que indica que esta interacción directa está implicada en el mecanismo de mejora de la infección. Se pueden utilizar diversas técnicas para cuantificar las interacciones entre bacterias y virus, incluido el recuento de centelleo de virus radiomarcados y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ambos métodos requieren el uso de virus vivos, que puede necesitar ser generado en el laboratorio. Actualmente, ninguno de los sistemas de cultivo in vitro establecidos disponibles para el norovirus humano es lo suficientemente robusto como para permitir la generación de poblaciones virales altamente concentradas. En lugar de virus vivos, se han utilizado partículas similares a virus (VLP) para caracterizar las interacciones entre el norovirus y las bacterias. Aquí se describe un método de citometría de flujo con los usos de anticuerpos específicos del virus para cuantificar la unión de VLP a bacterias gramnegativas y gram-positivas. La inclusión de los controles de bacterias solamente y de isotipo permitió la optimización del ensayo para reducir la unión de anticuerpos de fondo y la cuantificación precisa de la fijación de VLP a las bacterias probadas. Las altas relaciones VLP:bacterium dan como resultado la unión de los VLP a grandes porcentajes de la población bacteriana. Sin embargo, cuando las cantidades de VLP se disminuyen, el porcentaje de bacterias unidas también disminuye. En última instancia, este método se puede emplear en futuros experimentos que aclaran las condiciones específicas y los componentes estructurales que regulan el norovirus: interacciones bacterianas.
Introduction
Los norovirus humanos (HuNoV) son la principal causa de enfermedad gastrointestinal en todo el mundo, responsable de 685 millones de infecciones y más de 200.000 muertes cada año1. Al igual que con otros virus entéricos, se ha demostrado que la presencia de bacterias comensales mejora la infección de este patógeno, así como su virus sustituto, norovirus murino2,3. También hay informes contradictorios de que las bacterias pueden inhibir la infección por norovirus humano4,5,6. Para varios virus, la interacción directa entre el virus y las bacterias parece subyacen a los mecanismos que afectan la infección viral2,7,8,9,10, y se ha demostrado a través de microscopía electrónica que los norovirus humanos se unen directamente a las superficies de las bacterias11,,12. Por lo tanto, caracterizar estas interacciones se ha vuelto fundamental para determinar los mecanismos por los cuales las bacterias afectan la infección viral. Esta caracterización ha comenzado clásicamente con la cuantificación de la unión viral7a una serie de especies bacterianas que son componentes del microbioma huésped7,12,,13. Estos ensayos de apego no sólo revelan la cantidad de virus ligados a las bacterias, sino que también ayudan a determinar el impacto de esta interacción en la aptitud viral y la supervivencia.
Para cuantificar el apego viral, los métodos tradicionalmente empleados incluyen ensayos basados en PCR que cuantifican los genomas virales12 o la generación de virus radiomarcados y el uso de recuento de centelleo para cuantificar partículas virales7,,8,9,13. El uso de estos métodos generalmente requiere el acceso a las poblaciones de virus de alto valor y a las técnicas de cultivo in vitro con las que generarlos. Mientras que varios sistemas de cultivo para el norovirus humano existen ahora2,14,15, ninguno apoya la replicación robusta necesaria para generar estas poblaciones altamente concentradas que restringe o elimina el uso de PCR y recuento de centelleo para cuantificar las interacciones norovirus humanos / bacterianas.
Para evitar este problema, las partículas similares a virus (VLP) se pueden utilizar como sustituto del virus vivo para investigar las interacciones entre el norovirus humano y las bacterias16,17. Los VLP son partículas no infecciosas que se asemejan mucho al virus del que se derivan. En el caso del norovirus humano, estas partículas se generan a partir de la expresión de la proteína VP1 (y en algún momento del VP2), que se autoensamblan para crear cápsides virales intactos que carecen de material genético (es decir, ARN para norovirus). Estos VLP han sido bien caracterizados, son estructural y antígenos similares a los virus de tipo salvaje de los que se derivan18,,19,,20,,21,,22,,23. Por lo tanto, los VLP sirven como un sustituto ideal para investigar las interacciones superficiales entre el norovirus humano y las bacterias comensales. Dado que los VLP carecen de material genético, los ensayos basados en PCR no pueden utilizarse para cuantificar la unión viral. Anteriormente se describió un método de citometría de flujo basado en anticuerpos que era capaz de detectar niveles bajos de unión de VLP a las bacterias de manera semicuantitativa16. Este método fue optimizado para permitir la cuantificación precisa de la unión de Norovirus humano VLP a bacterias commensalgramas gramnegativas y gram-positivas16.
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Protocol
NOTA: Las condiciones de crecimiento bacteriano descritas en el protocolo son condiciones de cultivo estándar para Enterobacter cloacae y Lactobacillus gasseri. Para realizar el virus:ensayo de unión bacteriana con otras especies bacterianas, las bacterias elegidas deben ser cultivadas bajo condiciones estándar apropiadas para la bacteria.
1. Preparación del medio de crecimiento bacteriano
-
Medios de crecimiento enterobacter cloacae
- Preparar el medio líquido disolviendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro de sodio (NaCl) en 1 L de agua desionizada (DI) (ver Tabla de Materiales). Mezclar todos los medios a fondo y esterilizar mediante autoclave durante 30 min.
- Preparar un medio sólido disolviendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl y 15 g de agar en 1 L de agua DI. Mezclar todos los medios a fondo y esterilizar mediante autoclave durante 30 min.
-
Lactobacillus gasseri medios de crecimiento
- Preparar el medio líquido disolviendo 55 g de De Man, Rogosa y Sharpe (MRS; ver Tabla de Materiales)en polvo en 1 L de agua DI. Utilizar un medio dentro de un mes de preparación. Para esterilizar, caliente el medio durante 15 minutos hasta que hierva seguido de autoclave durante 15 min.
- Preparar un medio sólido disolviendo 55 g de polvo MRS y 15 g de agar en 1 L de agua DI. Para esterilizar, caliente el medio durante 15 minutos hasta que hierva seguido de autoclave durante 15 min.
2. Establecimiento de una curva estándar que correla la densidad óptica (OD) y la concentración de bacterias
- Inocular 5 ml de medio líquido adecuado con una sola colonia aislada de una placa de agar (E. cloacae) o directamente de la población de glicerol congelado (L. gasseri).
- Cultivar la bacteria durante la noche, en condiciones atmosféricas adecuadas (Enterobacter cloacae: 37 oC con agitación aeróbica a 200 rpm; L. gasseri: Baño de agua de 37oC sin temblores en un recipiente hermético).
- Transfiera 2 alícuotas de 1,3 ml de cultivo nocturno en dos tubos de centrífuga separados de 1,5 ml y bacterias centrífugas a 10.000 x g durante 5 min.
- Retire las muestras de sobrenadante y lave con 1 ml de solución salina tamponada de fosfato 1x estéril (PBS). Repita este paso de lavado para un total de 2 lavados.
- Centrifugar las muestras de nuevo a 10.000 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender en 1,3 ml de 1x PBS estéril.
- A partir de 0,5 ml de cultivo lavado, diluir en serie las bacterias en 1x PBS de 10-1 a 10-4.
- Utilizando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica del cultivo lavado y sin diluir y cada una de las cuatro diluciones a 600 nm (OD600).
- Realice diluciones seriales de 10 veces en 1x PBS por cada dilución del paso 2.6. Extienda la placa 100 l de las últimas 3 diluciones para cada serie en un medio sólido adecuado para determinar el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (CFU/ml) de cada muestra. Placar cada dilución en triplicado.
- Dejar que las placas se sequen a temperatura ambiente durante 5 min. Invierta las placas e incubar en las condiciones atmosféricas adecuadas (E. cloacae: aeróbico a 37 oC, incubar las placas durante la noche; L. gasseri: anaeróbico a 37oC, incubar placas durante 48 h en un recipiente hermético con sobres de aire anerobóbico (ver Tabla de Materiales)).
NOTA: Utilice 1 sobre de aire anaeróbico por frasco de 2,5 L o 3 sobres por frasco de 7,0 L (ver Tabla de Materiales). - Utilice recuentos de placas para determinar CFU/ml para cada una de las 5 muestras (es decir, sin diluir, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Genere una curva estándar comparando OD600 frente a CFU/mL. La ecuación para esta línea se utilizará en los ensayos de fijación de bacterias VLP para determinar CFU/ml basado en OD600.
3. Ensayo de accesorios VLP-bacteria
ADVERTENCIA: Los VLP de norovirus humanos son un peligro de nivel de bioseguridad (BSL)-2 y todo el trabajo relacionado con los VLP debe realizarse en un gabinete de bioseguridad. La preparación de los cultivos bacterianos, antes del ensayo de fijación, debe realizarse utilizando condiciones de seguridad adecuadas para el organismo.
- Preparación de reactivos
- 1x salina tamponada de fosfato (PBS)
- Prepare 1 L de 10PBS disolviendo un paquete entero en 1 L de agua DI.
- Solución de autoclave durante 30 min.
- Prepare una solución 1x diluyendo la solución anterior 1:10 en agua DI.
- El filtro esteriliza la solución pasándola a través de un filtro de 0,22 m y guárdela a temperatura ambiente.
- 5% BSA
- Añadir 5 g de albúmina sérica bovina (BSA) en polvo a 100 ml de PBS para generar una solución del 5% (p/v).
- Mezcle la solución vórtice o en una placa de agitación utilizando una barra de agitación metálica hasta que los grumos se hayan disuelto.
- El filtro esteriliza con un filtro de 0,22 m.
- Conservar la solución a 4oC.
- Búfer de manchas de citometría de flujo (FCSB)
- Filtrar FCSB comprado (ver Tabla de Materiales) a través de un filtro de 0,22 m.
- Conservar la solución restante a 4oC.
- 5% Búfer de bloqueo (BB)
NOTA: Prepárese fresco cada vez.- Añadir 0,5 g de BSA a 10 ml de FCSB estéril.
- Vórtice para mezclar completamente la muestra y dejar sobre hielo hasta su uso.
- 1x salina tamponada de fosfato (PBS)
- Conjugación de anticuerpos
- Conjugar el anticuerpo GII de norovirus humano (ver Tabla de Materiales)con r-ficoerythrina (PE) utilizando un kit de etiquetado de anticuerpos R-PE según las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).
- Almacene el anticuerpo conjugado en la oscuridad a 4 oC para su uso futuro en el análisis de ensayo de fijación de VLP-bacteria.
NOTA: El anticuerpo primario debe ser valorado antes de su uso en el ensayo de fijación VLP-bacterias para determinar la concentración adecuada necesaria para el análisis de citometría de flujo. La valoración de los anticuerpos debe realizarse cada vez que se realiza la reacción de conjugación y para cada bacteria utilizada en el ensayo de fijación.
- Valoración de anticuerpos
- Diluir el anticuerpo GII anti-humano conjugado 100 veces, con una dilución inicial de 1:100 y una dilución final de 1:600 (seis diluciones en total).
- Realice un ensayo de enlace de virus como se describe a continuación con la siguiente excepción: en el paso 3.5.7 resuspenda el pellet bacteriano en 350 ml de 5% BB.
- Divida la muestra en siete alícuotas de 50 s.
- Añadir 50 l de dilución de cada anticuerpo a un tubo.
- Añadir 50 s de 5% BB al séptimo tubo como un control sin mancha.
- Realice la citometría de flujo en todas las muestras como se describe a continuación.
- Compare las muestras de anticuerpos diluidos con los controles no manchados y entre sí. Se debe elegir la concentración más baja de anticuerpos que no resulte en una disminución o pérdida de señal positiva para su uso en ensayos posteriores.
- Preparación de bacterias
- Cultivar las bacterias en 40 ml de medio líquido adecuado en condiciones atmosféricas adecuadas hasta que las bacterias estén en fase estacionaria.
- Cultivar cultivos de E. cloacae aeróbicamente durante la noche en caldo de Luria a 37 oC, agitando a 200 rpm para alcanzar la fase estacionaria.
- Cultivar cultivos de L. gasseri en caldo MRS en tubos de tapa de tornillo negro sin agitar en un baño de agua ajustado a 37 oC durante 18 h para alcanzar la fase estacionaria.
- Transfiera cultivos de fase estacionaria para limpiar tubos cónicos de 50 ml y muestras de centrífuga a 2.288 x g durante 10 minutos para peletizar las bacterias.
- Retire el sobrenadante y resuspenda en 13 ml de PBS estéril 1x. Repita este paso de lavado para un total de dos lavados.
- Centrifugar las muestras de nuevo, retirar el sobrenadante y resuspender las muestras en 20 ml de 1x PBS.
NOTA: Si el pellet de celda es pequeño, el volumen de resuspensión puede disminuir. - Mida la OD600 de la cultura.
- Usando la curva estándar previamente preparada, determine la CFU por ml del cultivo lavado.
- Diluir las bacterias según sea necesario con 1x PBS para ajustar la concentración de cultivo a 1 x 108 CFU/ml.
- Transfiera 1 ml del cultivo bacteriano de 1 x 108 CFU/ml al número requerido de tubos centrífugos de 1,5 ml.
- Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 5 min.
- Resuspender el pellet bacteriano en 1 ml de BSA estéril 5%.
- Incubar los tubos durante 1 h a 37oC con rotación constante.
- Cultivar las bacterias en 40 ml de medio líquido adecuado en condiciones atmosféricas adecuadas hasta que las bacterias estén en fase estacionaria.
- Archivo de virus
- Trabajando dentro de un gabinete de bioseguridad BSL-2, agregue 10 g de HuNoV VLP (ver Tabla de Materiales)a cada tubo que contenga bacterias resuspendidas en PBS y mezcle bien pipeteando.
NOTA: La concentración de VLP difiere con cada preparación de VLP. Por lo tanto, el volumen añadido a las bacterias variará entre los lotes de preparación y se debe ajustar en consecuencia para que se añadan 10 g a cada tubo en el experimento. Para los controles de bacterias solamente (por ejemplo, muestras sin VLP), agregue un volumen de PBS que sea igual al volumen de VLP agregado a las muestras experimentales. - Incubar tubos durante 1 h a 37oC con rotación constante.
NOTA: Durante la incubación se utiliza un revólver de tubo (ver Tabla de Materiales)ajustado a 40 rpm. - Después de la incubación, centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet bacteriano en 1 ml de PBS.
- Repita los pasos de lavado 3.5.3 y 3.5.4.
- Centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el gránulo bacteriano en 150 ml de 5% BB.
- Trabajando dentro de un gabinete de bioseguridad BSL-2, agregue 10 g de HuNoV VLP (ver Tabla de Materiales)a cada tubo que contenga bacterias resuspendidas en PBS y mezcle bien pipeteando.
- Tinción de anticuerpos
- Preparar fresco 5% BB.
NOTA: Todo el trabajo con el anticuerpo fluorescentemente etiquetado debe realizarse en la oscuridad y el anticuerpo, BB y FCSB deben mantenerse en hielo. - Diluir el anticuerpo GII de norovirus humano 1:125 para muestras de E. cloacae y 1:150 para muestras de L. gasseri en 5% BB, preparando 50 ml de anticuerpo diluido por muestra.
- Diluir el anticuerpo isotipo de la misma manera que el anticuerpo norovirus humano GII se diluyó para cada bacteria en 5% BB, preparando 50 s de control de isotipo diluido por muestra.
- Divida cada muestra de ensayo de fijación del paso 3.3.7 en tres alícuotas de 50 l transfiriéndolas a tubos de centrífuga limpios de 1,5 ml.
- Al primer conjunto de muestras, añada 50 sl de BB. Este conjunto será el control sin conservar (Uns).
- Al segundo conjunto, añada 50 s de la dilución de anticuerpos GII. Esto da como resultado una concentración final de anticuerpos de 1:250 para E. cloacae y 1:300 para L. gasseri. Este conjunto de muestras será las muestras manchadas (AB).
- Al tercer conjunto, añadir 50 s de anticuerpo isotipo diluido. Este conjunto será el isotipo de controles (IC). Mezcle bien pipeteando. Incubar las muestras sobre hielo y en la oscuridad durante 30 min.
- Centrifugar todas las muestras a 10.000 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda las muestras en 100 s de FCSB.
- Centrifugar todas las muestras a 10.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda las muestras en 100 s de FCSB.
- Centrifugar todas las muestras a 10.000 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda las muestras en 150 s de FCSB.
- Transfiera cada muestra a un tubo FCSB que contenga 400 ml de búfer FCSB para un volumen total de 550 ml.
- Mantener las muestras a 4 oC hasta que se analicen mediante citometría de flujo.
NOTA: La citometría de flujo se realiza dentro de las 4 h de la tinción de anticuerpos.
- Preparar fresco 5% BB.
4. Citometría de flujo
NOTA: Los ajustes de voltaje descritos a continuación se basan en el citometro de flujo y el software enumerados en la Tabla de materiales y probablemente variarán con diferentes citometros de flujo. Los ajustes deben optimizarse para cada bacteria. Asegúrese de que los ejes de todos los gráficos están en fase biexponencial.
- Configuración del espacio de trabajo
NOTA: La configuración de las gráficas utilizadas para establecer el espacio de trabajo difiere de las utilizadas en el análisis de datos y gating. El propósito de configurar el espacio de trabajo es visualizar la población celular, asegurarse de que no hay un aglutinamiento excesivo de las células bacterianas que podría afectar al análisis aguas abajo y distinguir entre las células manchadas y no manchadas mientras se recopilan datos.- Con el fin de garantizar que las bacterias no se agrupen, configure una serie de parcelas de densidad.
- Generar un área de dispersión hacia adelante (FSC-A) frente al área de dispersión lateral (SSC-A) para visualizar la población total.
- Configure trazados para evaluar celdas individuales frente a grupos de células mediante la creación de dos gráficos que comparan el ancho de dispersión hacia delante (FSC-W) y el lado (SSC-W) con el avance (FSC-H) y la altura de dispersión lateral (SSC-H), respectivamente.
- Cree una gráfica que muestre solo la población positiva de PE (PE-A frente a SSC-A).
- Ajuste la tensión de línea base a 500 para E. cloacae y 340 para L. gasseri. Estos se ajustarán más adelante.
- Establezca el total de eventos contados en 10.000 eventos.
- Con el fin de garantizar que las bacterias no se agrupen, configure una serie de parcelas de densidad.
- Ejecución de muestras
- Cree tres gráficas de histograma independientes que muestren el recuento trazado con SSC-A, FSC-A o PE-A.
- Coloque una muestra no manchada en el citómetro de flujo y adquiera los eventos de la muestra, asegurándose de que el pico máximo en el histograma para SSC-A está dentro de 102 a 103 y el pico máximo en el histograma para FSC-A está entre 104 a 105 en el eje X. Si no es así, los picos no entran dentro de los rangos especificados, ajuste las tensiones FSC y SSC en consecuencia.
- Coloque una muestra manchada (AB) en el citometro de flujo y ajuste el PE de tensión para hacer el pico máximo más allá de 103 en el eje X.
- Sobre la base de estas medidas, fije la puerta fijada PE y fije la puerta en el gráfico de densidad PE-A versus SSC-A.
- Ejecute todas las muestras bajo los ajustes determinados a baja o media velocidad.
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Representative Results
Las estrategias de gating utilizadas para cuantificar la unión de VLP de norovirus humanos a las bacterias commensales se muestran en la Figura 1. Punto de densidad representativa proporciona una visión general de cómo se encerradon las muestras para eliminar los desechos celulares y los grumos celulares, por lo que se determinó la conexión de VLP en las poblaciones de singlete(Figura 1A). Los histogramas representativos demuestran niveles bajos de señal de anticuerpos antinovirus en bacterias que sólo carecen de norovirus VLP y baja señal de fondo de muestras de bacterias VLP manchadas con el anticuerpo de control de isotipo(Figura 1B). Los picos de control de isotipos también se superponen con muestras no retenidas, mientras que la tinción de las mismas muestras con anticuerpos GII de norovirus antihumanos produce un cambio significativo en el pico.
El método Overton de resta del histograma se utilizó para comparar la señal PE positiva en muestras manchadas de anticuerpos GII de norovirus antihumanos con la señal PE positiva del control de isotipo correspondiente y determinar el porcentaje de la población bacteriana enlazada por los VLP de norovirus humanos(Figura 1B). Después de 1 h de incubación con 10 g de VLP, la citometría de flujo detectó la unión de partículas a E. cloacae y L. gasseri (Figura 2). De hecho, se produjeron altos niveles de unión en estas condiciones para ambas bacterias; la unión a L. gasseri se produjo a niveles ligeramente más altos, pero significativos (p < 0.0001), en comparación con E. cloacae. Estos ensayos demuestran que la citometría de flujo se puede utilizar para detectar la unión del norovirus humano a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
Para determinar el límite de cuantificación de unión para este ensayo, se generó una serie de dilución de los VLP antes de la adición a la bacteria(Figura 3). Para ambos géneros de bacterias, las reducciones en la cantidad de VLP añadidas al cultivo bacteriano resultaron en reducciones correspondientes en el porcentaje de bacterias unidas por VLP. Los cambios en el porcentaje de E. cloacae unido por la partícula fueron más graduales en comparación con L. gasseri, pero la unión porcentual para ambas bacterias se niveló a pesar de nuevas reducciones en la concentración de VLP. Específicamente, 0.1 g o menos (datos no mostrados) de VLP en 108 Ufc de bacterias dio lugar a una meseta de por ciento de apego promedio entre 13-19% para ambas bacterias, lo que indica que este porcentaje es el límite de cuantificación para este ensayo.
Figura 1: Análisis citométrico de flujo representativo de la unión por VLP de norovirus humano. (A) Estrategia representativa de la citometría de flujo para cuantificar la unión de VLP a las bacterias. Las gráficas de densidad se utilizaron para eliminar los desechos celulares, seguidos de la posterior gráfica de puntos para eliminar dobletes bacterianos y grumos celulares. (B) Los histogramas representativos demuestran una falta de señal de PE en muestras bacterianas solamente y un cambio en la intensidad de la señal PE en las muestras VLP:bacterium en comparación con los controles no manchados y los controles isotipos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fijación de VLP a E. cloacae y L. gasseri. Los cultivos nocturnos de E. cloacae (n.o 6) y L. gasseri (n.o 6) se diluyeron a 1 x 108 CFU/ml en PBS. Las bacterias se incubaron con 10 g de VIP GII.4 durante 1 h y luego se midió la fijación de VLP utilizando citometría de flujo. Puede encontrar una gráfica representativa en la Figura 1B. El porcentaje de apego se determinó utilizando el método Overton de resta del histograma comparando la señal PE positiva del GII Human Norovirus stained samples con la señal PE positiva del control de isotipo correspondiente. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de un estudiante no emparejado (p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Serie de dilución VLP para E. cloacae y L. gasseri. 10 g de VIP GII.4 se diluyeron en serie y las diluciones de VLP se añadieron cada una a 1 x 108 bacterias en un volumen final de 1 ml (n a 3 para ambas bacterias). Las muestras se incubaron durante una hora a 37 oC. La fijación de la VLP a la bacteria se midió utilizando citometría de flujo. El porcentaje de apego se determinó utilizando el método Overton de resta del histograma comparando la señal PE positiva del GII Human Norovirus stained samples con la señal PE positiva del control de isotipo correspondiente. La reducción de las cantidades de entrada de VLP dio lugar a reducciones escalonadas en la conexión porcentual para ambos (A) E. cloacae y (B) L. gasseri. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La capacidad de cuantificar la unión de los virus entéricos a las bacterias es un primer paso crítico para esclarecer los mecanismos por los cuales estas bacterias alteran la infección viral. Los métodos descritos en este documento se han optimizado para medir las interacciones de VLP de norovirus humanos con E. cloacae (bacteria gramnegativa) y L. gasseri (una bacteria grampositiva), pero pueden adaptarse para su uso con cualquier virus de mamífero y bacteria de interés. Mientras que los VLP son una alternativa ideal al virus vivo para su uso en ensayos de apego y estas partículas se pueden cuantificar fácilmente utilizando citometría de flujo, las partículas P también se han utilizado para examinar las interacciones entre los norovirus humanos y las bacterias24. En este estudio, la cantidad de virus ligados a la bacteria se cuantificó en comparación con la población bacteriana, como se informa aquí. Las partículas P proporcionan una ventaja sobre los VLP, ya que son más fáciles de producir al tiempo que proporcionan similitud antigénica tanto a los VLP como al virus de tipo salvaje24,25. Sin embargo, los VLP de norovirus humanos están disponibles comercialmente, proporcionando un medio para laboratorios que carecen de la capacidad de generar VLP o partículas P. Las partículas P difieren de los VLP en que, mientras que los VLP mantienen el tamaño de una partícula viral de tipo salvaje, las partículas P son más pequeñas y tienen simetría tetraédrica en lugar de icosahedral25. El impacto de estas características en las interacciones con las bacterias no se ha explorado y las partículas P pueden servir como una alternativa viable a los VLP en la caracterización de las interacciones superficiales entre el norovirus humano y las bacterias.
Como se mencionó anteriormente, el ensayo descrito anteriormente se puede utilizar para caracterizar aún más las interacciones entre los VLP de norovirus humanos y las bacterias. Las investigaciones sobre cómo las condiciones de crecimiento y los cambios en la expresión de la estructura de la superficie bacteriana alteran la unión viral se pueden explorar utilizando esta técnica. Además, este ensayo también se puede utilizar para determinar estructuras bacterianas específicas unidas por el virus a través de ensayos de inhibición competitivos utilizando proteínas bacterianas o glicanos, tratamiento enzimático para eliminar estructuras superficiales específicas, o incubación con cepas bacterianas mutantes deficientes en particular una estructura. Este ensayo también se puede emplear para investigar la capacidad de otras cepas de norovirus para interactuar con bacterias comensales.
Debido a que este ensayo cuantifica la proporción de la población bacteriana unida por norovirus VLP, es fundamental determinar con precisión la correlación entre CFU/ml y OD600 para medir la concentración de cultivo bacteriano. Las fluctuaciones en la relación VLP:bacterias altera el porcentaje de la población bacteriana unida por los VLP y puede conducir a la variabilidad en los resultados. También se debe tener cuidado de añadir cantidades suficientes de partículas virales, ya que el límite de detección de este ensayo se acerca a 0,1 g de VLP/108 Ufc de bacterias. Las proporciones por debajo de este límite produjeron consistentemente valores de datos adjuntos porcentuales de 13-19%; por lo tanto, el apego poblacional observado en o por debajo de estos porcentajes puede no ser real.
Se realizaron valoraciones de anticuerpos para cada anticuerpo recién conjugado y contra cada cepa bacteriana antes de su uso en experimentos de fijación vLP:bacteria. Las concentraciones de anticuerpos necesarias para cada bacteria fueron similares que van desde 1:250 para E. cloacae y 1:300 para L. gasseri. El pequeño tamaño de las bacterias, en relación con el tamaño de las células eucariotas, requiere tanto el ajuste de voltaje como el uso de una distribución binomial durante la recopilación de datos para separar adecuadamente las bacterias de los desechos que se pueden encontrar en las muestras o circulando dentro del instrumento. Después de la recopilación de datos, se puede utilizar el gating adecuado para eliminar aún más las partículas de escombros más grandes y los grumos bacterianos para que solo se analicen las poblaciones de células individuales. También es fundamental establecer ajustes de voltaje únicos para cada especie bacteriana probada, ya que estos fluctúan ampliamente, particularmente entre bacterias gramnegativas y gram-positivas.
La inclusión de controles adecuados, incluidos solo bacterias y controles de isotipos, también es fundamental para un análisis preciso de los datos. Ambos tipos de controles informan con respecto a los niveles de unión de anticuerpos no específicos. Nuestros resultados demuestran que los anticuerpos utilizados para no unirse no específicamente a las especies bacterianas probadas, pero la unión no específica podría cambiar con cambios en las especies bacterianas o anticuerpos.
El método presentado aquí cuantifica la unión de partículas de norovirus humanos a bacterias grampositivas y gramnegativas y es útil para caracterizar virus:interacciones bacterianas. Además, este protocolo base se puede optimizar fácilmente para su uso con otros genotipos de norovirus humano, así como con otros virus y bacterias de mamíferos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Sutonuka Bhar y Chanel Mosby-Haundrup por su revisión crítica del manuscrito escrito, así como a Alfonso Carrillo por su ayuda con la generación de curvas estándar bacterianas. Este trabajo se financia en parte con una subvención del Instituto Nacional de Salud (R21AI140012) y con una subvención de semillas de la Universidad de Florida, Instituto de Ciencias Alimentarias y Agrícolas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
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