Summary
Nous présentons ici un protocole amélioré pour la préparation et l’immunomarquage de tout-monture des testicules de drosophile, adapté à la microscopie confocale et permettant également un étiquetage reproductible et fiable. Nous illustrant ce protocole par la représentation 3D et la quantification des expériences de colocalisation sur les grands spermatocytes S4-S5.
Abstract
Les testicules de drosophile sont un système modèle puissant pour l’étude des processus biologiques, y compris la biologie des cellules souches, l’architecture nucléaire, la méiose et le développement des spermatozoïdes. Cependant, l’immunomarquage de l’ensemble du testicule de drosophile est souvent associé à une non-uniformité significative de la coloration due à la pénétration des anticorps. Les préparations écrasées ne surmontent que partiellement le problème car elles diminuent la qualité 3D des analyses. Ci-dessus, nous décrivons un protocole de tout-montage utilisant NP40 et heptane pendant la fixation ainsi que l’immunolabeling dans les milieux liquides. Il préserve le volume adapté à la microscopie confocale ainsi qu’un étiquetage reproductible et fiable. Nous montrons différents exemples de reconstitution 3D de noyaux de spermatocytes à partir de sections confocales. La reproductibilité intra- et inter-testicules permet la quantification 3D et la comparaison de la fluorescence entre des cellules individuelles de différents génotypes. Nous avons utilisé différents composants de la structure MINT intranucléaire (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) ainsi que deux composants associés au complexe de pores nucléaires pour illustrer ce protocole et ses applications sur les plus grandes cellules du testicule, les spermatocytes S4-S5.
Introduction
Les testicules de drosophile sont un modèle précieux pour l’étude de l’architecture nucléaire. Dans les cellules spermatogoniales mitotiques, le volume nucléaire est largement occupé par la chromatine. Ces cellules subissent quatre cycles de division, produisant un kyste de 16 spermatocytes primaires. Au cours des jours suivants, les spermatocytes passent par 6 stades de développement (S1-S6), augmentant considérablement en volume, approximativement 20 fois1,2. Ils modifient également leur morphologie nucléaire. Le contour du noyau, révélé par la lamine Dm0, devient irrégulier et montre des invaginations profondes1,3. Ceci s’accompagne de changements importants de l’expression génique et de modifications dans l’organisation de la chromatine1,4,5,6,7. Les chromosomes interphase sont bien définis au stade S4-S5, formant trois masses distinctes correspondant aux 2 principaux autosomes bivalents et à la paire X-Y amarrés au nucléole.
Mad1 a été isolé à l’origine en tant qu’élément clé du point de contrôle mitotique (examiné en8). En interphase, il est décrit comme situé principalement au niveau de l’enveloppe nucléaire mais aussi dans le nucléoplasme 9,10,11. Dans le testicule de drosophile, nous avons rapporté que Mad1 est en avant dans le nucléoplasme, intimement associé aux deux masses autosomal importantes de chromatine et dans une moindre mesure à la chromatine DE X/Y. Nous avons défini cette structure associée à la chromatine comme MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Quatre autres protéines ont été associées aux MINTs dans les spermatocytes : la nucléoporine Mtor/Tpr, la peptidase SUMO Ulp1, la protéine de point de contrôle mitotique Mad2 et une sous-unité d’un complexe de type Polycomb Raf212.
Pour compléter la description des MINTs, nous avons dû employer des anticorps et avons été confrontés aux problèmes techniques généralement rencontrés avec immunostaining dans le testicule : une perméabilité pauvre ayant pour résultat une non-uniformité significative de souillure dans la profondeur du testicule, en particulier dans les grands spermatocytes. Lespréparations annulées ont augmenté l’accès aux anticorps mais ont conduit à des images compressées, limitant les analyses 3D et empêchant la mesure de la fluorescence quantitative, y compris la colocalisation. Le problème de la pénétration d’anticorps a également pu être adressé par des agents perméabilisants tels que le désoxycholate 13 de Nade 0,3%,mais ce procédé n’a pas dans nos mains donné des résultats reproductibles. Parce que nous avons effectué de nombreuses expériences de co-étiquetage, nous avons cherché à améliorer le protocole de perméabilisation. La combinaison de 1% NP40 plus heptane a entraîné plus de reproductibilité, en particulier dans l’étude des grands spermatocytes.
Ce protocole effectue la fixation et l’immunomarquage des testicules en suspension, améliorant la qualité de l’échantillon ainsi que la reproductibilité, et le rendant approprié pour la microscopie confocale. Nous avons utilisé le protocole pour mieux définir les relations spatiales de certaines protéines de l’enveloppe nucléaire avec les structures nucléoplasmiques de grands spermatocytes. Cette méthode permettra de mieux enquêter sur les changements qui accompagnent le développement des spermatocytes, par exemple les changements structurels dynamiques du noyau, y compris la chromatine, le nucléoplasme et les pores nucléaires.
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Protocol
1. Collecte de testicules de drosophile
REMARQUE : Les jeunes mâles (0 à 15 h après l’éclosion) sont nécessaires pour examiner les cellules germinales diploïdes (c.-à-d. spermatogonie et spermatocytes).
- Sélectionnez les jeunes mouches autant que possible pour minimiser les interférences des spermatides en développement.
- Anesthésier les mouches par brève exposition au dioxyde de carbone et les transférer sur un tapis demouches 14,15.
- Sous un microscope à dissection (grossissement 10x), utilisez une pince pour retirer la tête.
- Transférer 5 à 10 mouches décapitées sur 100 μL de tampon de Ringer (KCI de 183 mM, NaCl 47 mM, Tris-HCI de 10 mM, EDTA 1 mM, inhibiteur de protéine complète, pH 6,8) sur une lame de verre enduit de silicone sur un support de fond noir.
- Avec un microscope à dissection à un grossissement 40x, utilisez une paire de pinces numéro 5 pour maintenir une mouche entre le thorax et l’abdomen et, avec d’autres pinces, éloignez l’abdomen du thorax. Isolez rapidement les testicules et les tissus adjacents de la carcasse de mouche15 et placez-les dans une nouvelle goutte de tampon de Ringer sur la même lame.
- Une fois que tous les testicules sont prêts, nettoyez les testicules des tissus restants (glande accessoire et organes génitaux externes).
- Retirez l’excès de mémoire tampon de la goutte contenant les testicules disséqués. En règle générale, utilisez une pipette p200 avec une pointe de 10 μL montée sur une pointe de 200 μL. Cela permet d’éliminer l’excès de liquide à travers une petite ouverture. Placer une goutte de fixateur de paraformaldéhyde à 4% sur la goutte contenant les testicules disséqués, puis transférer rapidement les testicules dans un tube contenant une solution fixatrice fraîche.
2. Fixation du paraformaldéhyde
- Préparer 2 mL de solution fixatrice juste avant utilisation : 600 μL de paraformaldéhyde à 4 % dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 30 μL de NP40 20 % plus 1200 μL d’heptane dans un tube de microcentrifugation siliconé de 2 mL. Utiliser du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS préparé dans des aliquotes de 600 μL et conservé à -20 °C.
Attention : L’heptane et le paraformaldéhyde sont toxiques et doivent être manipulés dans une hotte. Éliminez-les conformément aux règlements de l’institut d’accueil. - Transférer les testicules à l’aide d’une micropipette p200 avec une pointe à large ouverture vers la solution PFA/NP40/heptane. Agiter le tube de haut en bas pendant 30 s à la main. Continuer à fixer les testicules sur un mélangeur rotatif à température ambiante pendant 30 min.
- Arrêtez le mélangeur rotatif et placez le tube dans un rack à tubes pour permettre la séparation de phase et pour que les testicules se déposent au fond du tube.
- Retirez tout l’heptane et la solution fixatrice et rincez rapidement les testicules trois fois avec 1x PBS.
- Transférer dans un tube individuel propre de 200 μL. Effectuer toutes les incubations dans ces petits tubes pour minimiser les quantités d’anticorps utilisés.
- Retirer l’excès de tampon à l’aide d’une micropipette de 200 μL avec une pointe P200 et une pointe P10 attachées. Veillez à ne pas aspirer les testicules.
- Conservez les testicules en PBS 1x sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons soient prêts.
3. Coloration des anticorps en solution
- Jeter le PBS et laisser les testicules dans 0,3% PBS-T pendant 30 min à température ambiante pour perméabiliser les membranes cellulaires.
- Pré-incuber dans le même tampon plus 5% sérum de chèvre normal (NGS) pendant 1 h.
- Ajouter 200 μL de l’anticorps primaire dilué dans 0,3 % pbs-t plus 5 % ngs(table des matériaux).
- Incuber l’anticorps primaire pendant la nuit à 4 °C (ou température ambiante) avec une agitation douce sur une bascule.
- Laver 3 fois dans 0,3% PBS-T pendant 15 min sur une bascule à température ambiante. Laisser les testicules se déposer au fond du tube par gravité.
- Ajouter 200 μL d’anticorps secondaires dilués 1:500 de la série conjuguée DyLight.
- Incuber l’anticorps secondaire dans une chambre sombre pendant 4 h à température ambiante.
- Laver à 0,3% PBS-T pendant 15 min sur une bascule à température ambiante. Répétez ensuite avec 0,2% PBS-T et 0,1% PBS-T, à chaque fois pendant 30 min sur une bascule à température ambiante. Faites un lavage final en PBS 1x pendant 30 min pour enlever le détergent.
- Ajouter 180 μL de solution de DAPI à 1 μg/mL dans 1x PBS pendant 15 min. La solution mère est de 10 mg/mL dansH2O.Évitez de faire une solution mère dans pbs, ce qui peut réduire le signal de coloration DAPI sur la chromatine diffuse dans les spermatocytes plus gros.
- Laver 3x pendant 5 min chacun.
- Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur une diapositive propre.
- Aspirez les testicules et mettez-les sur la lame. Le pré-rinçage de la pointe à grande ouverture avec 0,1% pbs-t empêche les testicules de coller à la pointe. Retirez l’excès de PBS.
- Ajouter une goutte (environ 100 μL) de Citifluor AF1.
- Placez doucement une lamelle de couverture de verre sur le tissu, en prenant soin d’éviter de piéger les bulles d’air.
- Scellez la lame de couverture sur la lame à l’aide de vernis à ongles clair.
- Observez des lames au microscope.
4. Analyses de colocalisation
- Acquérir des images confocales. Nous avons utilisé un microscope confocal Zeiss LSM 710 (huile apochromatique Plan 63x) avec une résolution z de 0,5 ou 1 μm.
- Sélectionnez différentes cellules parmi des testicules indépendants.
- Importez des images dans un logiciel de traitement (par exemple, Imaris).
- Définir le noyau par segmentation manuelle afin d’exclure les noyaux voisins. Utilisez le logiciel Coloc; il recueille les coefficients de corrélation de Pearson (PCC) à l’intérieur du volume entier entre 2 fluorophores.
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Representative Results
Le principal obstacle à l’obtention d’une coloration adéquate des testicules de drosophile est la pénétrabilité limitée des anticorps, qui a été partiellement résolue en utilisant des préparations écrasées mais au prix d’une restriction des analyses 3D (par exemple la représentation 3D ou la mesure de la colocalisation). La procédure permet un étiquetage uniforme et préserve le volume de toutes les cellules du testicule. Ici, nous avons concentré l’illustration de la méthode sur la représentation 3D des spermatocytes S4-S5, car ce sont les cellules les plus grandes et donc plus sensibles à la déformation de l’écrasement. Nous avons utilisé différents marqueurs nucléaires, y compris les nucléoporines et le étiquetage du domaine MINT intranucléaire (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) décrit par la protéine mitotique Mad112. Comme les MINTs pouvaient être révélés par plusieurs anticorps différents, nous les avons utilisés pour tester la robustesse du protocole de colocalisation 3D quantitative, une méthode qui nécessite une résolution spatiale correcte.
Le protocole décrit ci-dessus permet l’acquisition d’images confocales de qualité suffisante pour être ensuite traitées pour une reconstitution 3D. Quatre sections sériel adjacentes d’un spermatocyte de stade S5 sont représentées sur la figure 1A,montrant une immunomarquage représentative de MINT (immunomarquage Mad1 à l’aide d’un booster GFP en rouge) avec du DAPI (en cyan). Les chromosomes sont organisés en 3 amas distincts majeurs caractéristiques et la structure MINT est montrée en détail fin autour de l’ADN, intimement associée à -- mais distincte de -- les masses autosomiques de chromatine. La résolution permet également la détection de la présence de Mad1 à la périphérie nucléaire ainsi qu’entre les masses autosomiques des chromosomes 2 et 3. Nous avons utilisé le logiciel Imaris pour la représentation 3D. La surface nucléaire a été définie par la présence de bas niveau de Mad1 à l’enveloppe nucléaire (en gris) et MINT a été définie par une accumulation élevée de Mad1 à l’intérieur du noyau (en rouge) avec une coloration DAPI (en bleu)(Figure 1A). Le film de reconstitution 3D illustre bien le volume et la relation de Mad1 (à l’enveloppe nucléaire et dans le MINT) avec les chromosomes dans les spermatocytes de stade S4-S5.
La distribution des nucléoporines n’a été que mal décrite dans ces cellules, probablement en raison de la difficulté à les détecter dans ces grands noyaux difformes. La distribution de Nup154 n’a été rapportée qu’une seule fois précédemment16 et Nup153 et Nup98 n’ont été étudiés que dans les spermatogones et les petits spermatocytes précoces17. Les reconstitutions 3D de grands spermatocytes S5 colorés par la nucléoporine Nup62 et par l’importine β (produit du gène ketel) étaient réalisables et sont représentées respectivement à la figure 1C et à la figure 1D. Ces composants associés aux pores nucléaires semblent non uniformément répartis sur la jante nucléaire sous forme de points de taille irrégulière. Par exemple, l’importine β se rassemble autour de la chromatine autosomique de la même manière qu’un réseau de lamins a déjà été décrit3. Ce type de distribution avec des zones riches en pores et de grandes zones sans pores a été décrit par microscopie électronique dans les spermatocytes de rongeurs18. Comprendre les changements dans la distribution de la lamine et de la nucléoporine aiderait à comprendre la structure de l’enveloppe nucléaire dans ces cellules G2 juste avant la méiose masculine.
Tout en conservant le volume 3D des cellules, ce protocole permet également aux anticorps de pénétrer uniformément dans la profondeur de chaque cellule, permettant une analyse quantitative telle que la colocalisation. Le coefficient de corrélation de Pearson (PCC) est une mesure bien établie. Il peut aller de +1 (indiquant une corrélation positive parfaite) à −1 (corrélation négative parfaite)19. Pour évaluer la localisation des protéines partenaires MINT par rapport à Mad1 dans les spermatocytes, nous avons précédemment estimé le PCC sur une seule section de 0,5 μm en utilisant ImageJ dans les spermatocytes S512 (Figure 2A,B). Nous avons testé le protocole plus en profondeur en utilisant la colocalisation 3D sur l’ensemble des noyaux au lieu d’une simple surface. Le volume des noyaux a été défini par segmentation manuelle et le PCC a été mesuré utilisant l’outil de colocation. Nous avons analysé huit noyaux de spermatocyte S5, du même testicule ou de différents testicules. La figure 2B montre une représentation 3D d’un noyau qui a servi à mesurer le PCC. La figure 2D montre la mesure du PCC sur huit noyaux de spermatocytes S5 différents provenant de trois testicules différents. Les valeurs PCC ne sont pas différentes, variant de 0,6 et 0,75, ce qui indique une valeur élevée pour la colocalisation. Ceux-ci sont indiscernables du PCC défini sur une seule section. Ainsi, le procédé permet un étiquetage uniforme reproductible et préserve un bon volume de toutes les cellules du testicule.
Parce que le protocole permet une mesure fiable de la colocalisation à partir de testicules indépendants, il a permis la comparaison de la coloration de différents génotypes de mouches. Ceci a été illustré ici par la comparaison des mouches WT et des mouches ARNi épuisé pour Mtor (généré par l’expression des lignes UAS dsRNA et le pilote Bam-Gal4 qui atteignent un épuisement substantiel dans les spermatogonies tardives et les spermatocytes précoces20). Comme décrit pour les expériences de colocalisation, les testicules épuisés par l’ARNi Mtor et les testicules de types sauvages ont été disséqués et fixés ensemble et les images confocales ont été acquises dans des paramètres constants. En respectant ces conditions, la comparaison des cellules individuelles devient possible. Nous avons observé que le MINT est plus affecté que l’enveloppe nucléaire par la perte de Mtor comme le montrent les cellules représentatives Mtor RNAi-épuisées (supérieures) et wt (inférieures) (Figure 3)12.
Ill. 1 : Illustration de l’immunomarquage de noyaux de spermatocytes de drosophile S4-S5 à l’aide de différentes sondes. (A) Images d’un noyau de spermatocyte de stade unique 5 immunostained avec de l’anticorps α-GFP (booster GFP) détectant la structure MINT par Mad1-GFP (rouge) ensemble à la coloration DAPI (bleu). Il montre avec précision la relation entre Mad1 et les deux masses de chromatine autosomique (représentées par des astérisques). Mad1 est également faiblement détecté à la périphérie du noyau. Toutes les images sont des projections Z série d’une pile de 3 (0,5 μm) tranches confocales successives. Des images confocales ont été acquises sur un microscope confocal (63x, objectif de L’huile apochromatique de plan DIC). Les barres d’échelle sont de 5 μm. (B) Cadre d’un rendu de film du même noyau de spermatocyte. La surface nucléaire a été définie par une faible expression de Mad1 à l’enveloppe nucléaire (en gris) et MINT a été définie par une expression élevée de Mad1 à l’intérieur du noyau (en rouge). (A, B) Réimprimé avec la permission de la figure précédemment publiée (à partir de12). (C) Image 3D d’un noyau de spermatocyte de stade 5 avec immunomarquage simultané de Nup62 (jaune) et MINT (booster GFP en rouge). La barre d’échelle est de 4 μm. (D) image 3D d’un noyau de spermatocyte de stade 5 avec immunomarquage simultané de l’importine-β Ketel (jaune) avec de l’ADN (DAPI en bleu). Les barres d’échelle sont de 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification de la colocalisation 2D et 3D de Mad1 avec Ulp1. (A) Images fusionnées d’un noyau de spermatocyte de stade 5 immunostained avec un anticorps de rappel GFP détectant Mad1 (vert) et avec un anticorps anti-Ulp1 (rouge) représenté sous la forme d’une pile de 1 μm d’épaisseur d’un noyau de spermatocyte. Sur la droite est indiqué le coefficient de corrélation d’intensité de Pearson calculé à l’aide du plugin Coloc-2 ImageJ. Le PCC a été estimé à 0,73 (réimprimé avec la permission de Raich12). (B) Image fusionnée du noyau de spermatocyte de stade 5 (correspondant au noyau G dans le tableau adjacent) immunostained avec l’anticorps de rappel GFP détectant Mad1 (vert) et avec l’anticorps anti-Ulp1 (rouge) représenté dans une projection 3D. Le volume du noyau a été défini par segmentation manuelle. À droite, le tableau répertorie les coefficients de corrélation d’intensité de Pearson calculés sur 8 spermatocytes différents (A à H) à partir de 3 testicules différents (1 à 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 3 : Analyse par immunofluorescence des spermatocytes traités par ARNi Mtor par rapport au type sauvage. Les cellules épuisées de Mtor à l’aide de cellules MtorRNAi (ID 110218) (panneaux supérieurs) et de cellules de type sauvage (panneaux inférieurs) ont été colorées pour les protéines Mad1, Raf2 et Mtor. Les testicules ont été fixés et colorés ensemble, montés sur la même diapositive et les images acquises avec les mêmes paramètres. Les cellules d’ARNi pourraient être distinguées de WT par l’absence ou la présence respectivement de Mad1-GFP. Le chiffre est représentatif des projections maximales de 4 x 0,5 μm de cheminées. La barre d’échelle est de 5 μm (réimprimée avec la permission de la figure précédemment publiée dans12). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole fournit une méthode pour l’immunolabeling réussi des testicules adultes de drosophile de tout-monté. Comme indiqué dans d’autres procédures, les jeunes mâles doivent être utilisés (nous avons même raccourci l’âge à moins de 20 heures après l’éclosion) pour minimiser la présence de spermatozoïdes en développement, ce qui risque d’obstruer les spermatocytes. La dissection doit être rapide et la dilution des anticorps doit être ajustée pour optimiser le rapport signal/bruit21,22,23. Parce qu’utilisant d’autres protocoles, nous n’avons pas observé la souillure dans toute la profondeur du testicule, nous avons développé une méthode de fixation combinant PFA ainsi que NP40 et heptane. Nous utilisons maintenant systématiquement 600 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans le PBS avec 30 μL de NP40 à 20 % plus deux volumes d’heptane. Ceci est essentiel pour permettre une perméabilisation suffisante. La réduction de la quantité de NP40 à 10 μL réduit visiblement l’étiquetage. Toutes les étapes suivantes ont été effectuées en suspension et l’excès de tampon a été éliminé en permettant aux testicules de descendre doucement au fond du tube par gravité. Pour la dernière étape de transfert des échantillons sur une lame, nous rinçons la pointe à 0,1% PBS-T pour éviter que les testicules ne collent au cône. Selon les observations, le protocole de coloration immunohistologique fonctionne bien avec une variété de protéines nucléaires, y compris les marqueurs utilisés ici, ainsi que des sondes de modifications épigénétiques des histones, de la lamine et des nucléoporines. Nous notons que le protocole peut également être utilisé pour les testicules larvaires, auquel cas l’heptane doit être omis, car il rend les testicules plus difficiles à récupérer intacts.
Le protocole est spécialement conçu pour maintenir ensemble des piles intactes des spermatocytes pour un étiquetage efficace et uniforme du testicule. Nous avons illustré le protocole avec les grands spermatocytes de phase tardive, dont les noyaux difformes en font parmi les cellules les plus difficiles à préserver. En outre, dans ces spermatocytes, le étiquetage nucléaire devient souvent dilué probablement à cause de la taille des noyaux. Par exemple, il est communément observé que le étiquetage DAPI ou lamin est plus fort dans les cellules à l’apex du testicule et devient progressivement plus faible et plus dispersé au fur et à mesure que les spermatocytes se développent3,24. Cela pourrait également être l’une des raisons pour lesquelles la distribution des nucléoporines n’a été décrite que dans les cellules à un stade précoce (spermatogonie et spermatocytes précoces)17.
D’excellentes images d’immunomarquage des spermatocytes de la drosophile S5 ont été publiées, en particulier pour le t-BRD spécifique aux testicules et les protéines dany25,26 en utilisant soit le protocole de désoxycholate de sodium à 0,3%, soit après écrasement du tissu21,22. Dans nos mains, les courges conduisent à une non-uniformité significative de la coloration dans les profondeurs de l’organe et aussi au sacrifice de la structure 3D. Même si l’utilisation du désoxycholate de sodium à 0,3% donnait de meilleurs résultats, nous avons tout de même observé une non-uniformité. Ainsi, nous préférons np40 pour sa reproductibilité et la qualité de l’étiquetage. Les images confocales permettent la reconstruction d’images 3D pour les protéines nucléaires. Par exemple, nous avons appliqué avec succès cette méthode en utilisant de nombreuses sondes différentes, illustrées ici par le domaine MINT intranucléaire, intimement associé aux masses de chromatine autosomique et au réseau de pores nucléaires. La distribution 3D intrigante des pores nucléaires de ces noyaux de spermatocytes est maintenant disponible pour d’autres études. Les images permettent une quantification reproductible de la colocalisation à partir de différents spermatocytes provenant d’un même testicule et de différents testicules. À notre connaissance, c’est la première fois que la quantification précise par coefficient de corrélation de Pearson a été mesurée sur de tels échantillons. Il donne la confiance requise pour la comparaison précise des niveaux de protéines immunomarquées de différents testicules.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura pour les anticorps et A. Debec, les centres boursiers de Bloomington et de Vienne pour les mouches. Merci à C. Jackson pour ses suggestions et ses discussions stimulantes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Stock solution must be prepared in H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Wide Bore Pipette Tips | Fisherbrand | 11917744 | Wide aperture tip |
| Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml micro centrifuge tubes | Sigma | T3531-200EA | Siliconized 2ml tube |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyde 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| 0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T | PBS 1X containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, for molecular biology, | Sigma | T8787 | |
| Antibodies | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Mouse anti-Mtor | 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University | ||
| Rat anti-Nup62 | 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK | ||
| Guinea-pig anti-Ulp1 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| Rabbit anti-Raf2 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| DyLight conjugated series | Thermo | 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse, rabbit or rat) as second antibodies |
References
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