Summary
Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.
Abstract
Drosophila testisleri kök hücre biyolojisi, nükleer mimari, meiosis ve sperm gelişimi dahil olmak üzere biyolojik süreçleri incelemek için güçlü bir model sistemidir. Bununla birlikte, tüm Drosophila testislerinin immünolabelingi genellikle antikor penetrasyonu nedeniyle lekelemenin önemli ölçüde homojen olmayanlığı ile ilişkilidir. Ezilmiş preparatlar, analizlerin 3D kalitesini azalttığı için sorunun sadece kısmen üstesinden gelmektedir. Burada, sıvı ortamda immünolabeling ile birlikte fiksasyon sırasında NP40 ve heptane kullanan tam montajlı bir protokol açıklıyoruz. Konfokal mikroskopiye uygun hacmi tekrarlanabilir ve güvenilir etiketleme ile birlikte korur. Konfokal bölümlerden spermatosit çekirdeğinin 3D rekonsesinin farklı örneklerini gösteriyoruz. İntra-ve inter-testes tekrarlanabilirliği, farklı genotiplerden tek hücreler arasındaki floresanların 3D nicelleştirilmesine ve karşılaştırılmasını sağlar. Bu protokolü ve testislerin en büyük hücreleri olan S4-S5 spermatositleri üzerindeki uygulamalarını göstermek için intranükleer MINT yapısının (Mad1 içeren Intra Nükleer Bölge) farklı bileşenlerinin yanı sıra nükleer gözenek kompleksi ile ilişkili iki bileşen kullandık.
Introduction
Drosophila testisleri nükleer mimarinin incelenmesi için değerli bir modeldir. Mitotik spermatogonyal hücrelerde, nükleer hacim büyük ölçüde kromatin tarafından işgal edilir. Bu hücreler dört tur bölünmeye uğrar ve 16 birincil spermatosit kisti üretir. Sonraki birkaç gün boyunca, spermatositler 6 gelişim aşamasından (S1-S6) geçer, hacim olarak büyük ölçüde artar, yaklaşık olarak 20 kat1,2. Nükleer morfolojilerini de değiştiriyorlar. Lamin Dm0 tarafından ortaya çıkan çekirdeğin ana hatları düzensiz hale gelir ve derin invaginasyonları gösterir1,3. Buna kromatin organizasyonu 1 , 4 ,5,6,7 'de kapsamlı gen ekspresyasyonu değişiklikleri ve modifikasyonları eşlikeder. Ara evre kromozomları, S4-S5 evresinde iyi tanımlanmıştır ve 2 büyük çift değerli otomoz ve çekirdekle sabitlenmiş X-Y çiftine karşılık gelen üç ayrı kütle oluşturur.
Mad1 başlangıçta mitotik kontrol noktasının önemli bir bileşeni olarak izole edildi(8'degözden geçirildi). Interfazda, öncelikle nükleer zarfta değil, aynı zamanda nükleoplazma9, 10,11'dede bulunur. Drosophila testislerinde, Mad1'in nükleoplazmada belirgin olduğunu, iki büyük otozomal kromatin kütlesi ile yakından ilişkili olduğunu ve XY kromatin ile daha az ölçüde ilişkili olduğunu bildirdik. Kromatinle ilişkili bu yapıyı MINT (Mad1 içeren IntraNükleer Bölge)12olarak tanımladık. Diğer dört protein spermatositlerdeki MINT'lerle ilişkiliydi: nükleoporin Mtor / Tpr, SUMO peptidaz Ulp1, mitotik kontrol noktası proteini Mad2 ve Polikomla benzeri bir kompleksin alt bireyi Raf212.
MINT'lerin tanımını tamamlamak için antikor kullanmamız gerekiyordu ve testislerde genellikle immünostaining ile karşılaşılan teknik sorunlarla karşı karşıya kaldık: testislerin derinliğinde, özellikle de büyük spermatositlerde önemli bir homojenlik ile sonuçlanan zayıf bir geçirgenlik. Squashed preparatları antikor erişimini artırdı, ancak sıkıştırılmış görüntülere yol açtı, 3D analizleri kısıtladı ve kolokalizasyon da dahil olmak üzerenicel floresan ölçümünü önledi. Antikor penetrasyonu sorunu da % 0.3 Na deoksikollat13gibi permeabilizasyon edici ajanlar tarafından ele alınabiliyordu, ancak bu prosedür elimizde tekrarlanabilir sonuçlar vermedi. Birçok ortak etiketleme deneyi yaptığımız için, permeabilizasyon protokolünü geliştirmeye baktık. % 1 NP40 artı heptan kombinasyonu, özellikle büyük spermatositlerin incelenmesinde daha fazla tekrarlanabilirlik ile sonuçlandı.
Bu protokol, süspansiyondaki testislerin sabitlenmesi ve immünostainingini gerçekleştirir, numune kalitesini artırır, tekrarlanabilirliği artırır ve konfokal mikroskopi için uygun hale getirir. Protokolü, bazı nükleer zarf proteinlerinin büyük spermatositlerin nükleoplazmik yapılarıyla olan mekansal ilişkilerini daha iyi tanımlamak için kullandık. Bu yöntem, spermatosit gelişimine eşlik eden değişikliklerin, örneğin kromatin, nükleoplazma ve nükleer gözenekler de dahil olmak üzere çekirdeğin dinamik yapısal değişikliklerinin daha iyi araştırılmasına izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila testis koleksiyonu
NOT: Genç erkekler (eklozyon sonrası 0-15 saat) diploid mikrop hücrelerini (spermatogonia ve spermatositler) incelemek için gereklidir.
- Spermatidler geliştirmeden kaynaklanan paraziti en aza indirmek için mümkün olduğunca genç sinekleri seçin.
- Karbondioksite kısa bir süre maruz kalarak sinekleri uyuşturun ve bir sineklik pedine aktarın14,15.
- Bir diseksiyon mikroskobu (10x büyütme) altında, başı çıkarmak için tokmak kullanın.
- Siyah bir arka plan desteği üzerine silikon kaplı cam kaydırakta 5 ila 10 kafa kesilmiş sinekleri 100 μL Ringer tamponu (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, komple protein inhibitörü, pH 6.8) aktarın.
- 40x büyütmede mikroskobun parçalanmasıyla, toraks ile karın arasında bir sinek tutmak için bir çift 5 numaralı toparlama kullanın ve diğer toparlamalarla birlikte karnı torakstan çekin. Testisleri ve bitişik dokuları sinek karkası15'ten hızla izole edin ve ringer tamponunun yeni bir damlasına aynı slaytta yerleştirin.
- Tüm testisler hazır olduğunda, testisleri kalan dokulardan (aksesuar bezi ve dış cinsel organ) temizleyin.
- Parçalanmış testisleri içeren damladan fazla tamponu çıkarın. Tipik olarak, 200 μL ucun üzerine monte edilmiş 10 μL uçlu bir p200 pipet kullanın. Bu, sıvı fazlalığının küçük bir diyafram açıklığından çıkarılmasını sağlar. Parçalanmış testisleri içeren damlanın üzerine% 4 paraformaldehit fiksatif bir damla yerleştirin ve ardından testisleri hızlı bir şekilde taze fiksatif çözelti içeren bir tüpe aktarın.
2. Paraformaldehit fiksasyonu
- Kullanımdan hemen önce 2 mL fiksatif çözelti hazırlayın: 2 mL silikonlu mikrosenj tüpte 30 μL NP40% 20 artı 1200 μL hepatik ile fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilmiş% 4 paraformaldehitin 600 μL'si. 600 μL aliquots olarak hazırlanan ve -20 °C'de depolanan PBS'de %4 paraformaldehit kullanın.
Dikkat: Heptan ve paraformaldehit toksiktir ve duman kaputunda ele alınmalıdır. Ev sahibi enstitünün yönetmeliklerine göre bunları atın. - Testleri geniş diyafram ucuna sahip bir p200 mikropipette kullanarak PFA/NP40/heptane çözeltisine aktarın. Tüpü elle 30 sn boyunca yukarı ve aşağı sallayın. Testisleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döner karıştırıcıya sabitleye devam edin.
- Döner karıştırıcıyı durdurun ve faz ayrımına izin vermek ve testislerin tüpün dibine yerleşmesini sağlamak için tüpü bir tüp rafı içine yerleştirin.
- Tüm heptane ve fiksatif çözeltiyi çıkarın ve testisleri 1x PBS ile üç kez hızlı bir şekilde durulayın.
- Temiz bir 200 μL bireysel tüpe aktarın. Kullanılan antikor miktarlarını en aza indirmek için bu küçük tüplerdeki tüm inkübasyonları gerçekleştirin.
- Hem P200 hem de P10 ucu takılı 200 μL mikropipette kullanarak fazla tamponu çıkarın. Testisleri aspire etmemeye dikkat edin.
- Tüm numuneler hazır olana kadar testisleri buz üzerinde 1x PBS'de tutun.
3. Çözeltide antikor lekesi
- PBS'yi atın ve hücre zarlarını permeabilize etmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca testisleri% 0,3 PBS-T'de bırakın.
- Aynı tamponda önceden inkübasyon artı 1 saat boyunca% 5 normal keçi serumu (NGS).
- %0,3 PBS-T artı %5 NGS(Malzeme Tablosu)ile seyreltilmiş birincil antikorun 200 μL'sini ekleyin.
- Birincil antikoru bir gecede 4 °C'de (veya oda sıcaklığında) bir rocker üzerinde hafif ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
- Oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 15 dakika boyunca% 0.3 PBS-T'de 3 kez yıkayın. Testislerin yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
- DyLight konjuge serisinden 1:500 seyreltilmiş 200 μL ikincil antikor ekleyin.
- İkincil antikorun oda sıcaklığında 4 saat boyunca karanlık bir odada kuluçkaya yatırın.
- Oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 15 dakika boyunca% 0.3 PBS-T'de yıkayın. Daha sonra her seferinde oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 30 dakika boyunca% 0.2 PBS-T ve% 0.1 PBS-T ile tekrarlayın. Deterjanı çıkarmak için 30 dakika boyunca 1x PBS'de son bir yıkama yapın.
- 15 dakika boyunca 1x PBS'de 1 μg/mL'de 180 μL DAPI çözeltisi ekleyin. Stok çözeltisi H2O'da 10 mg/mL'dir. PBS'de stok çözeltisi yapmaktan kaçının, bu da daha büyük spermatositlerde dağınık kromatin üzerindeki DAPI boyama sinyalini azaltabilir.
- Her biri 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
- Temiz bir slayt üzerinde bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
- Testisleri aspire edin ve slayda koyun. Geniş diyafram ucunun %0,1 PBS-T ile önceden durulanmasını test etmenin uyrmaya yapışmasını önler. Fazla PBS'yi kaldırın.
- Citifluor AF1'den bir damla (yaklaşık 100 μL) ekleyin.
- Hava kabarcıklarını hapsetmekten kaçınmaya dikkat ederek, dokunun üzerine hafifçe bir cam kapak yerleştirin.
- Kapak kapağını şeffaf oje kullanarak kaydırağa kapatın.
- Slaytları mikroskopta gözlemleyin.
4. Kolokalizasyon analizleri
- Konfokal görüntüler elde edin. Z çözünürlüğünde 0,5 veya 1 μm çözünürlüğünde zeiss LSM 710 konfokal mikroskop (63x Plan Apokromatik yağ) kullandık.
- Bağımsız testislerden farklı hücreler seçin.
- Görüntüleri işleme yazılımına (örneğin, imaris) içe aktarın.
- Komşu çekirdeği dışlamak için çekirdeği manuel segmentasyonla tanımlayın. Coloc yazılımını kullanın; Pearson'ın korelasyon katsayılarını (PCC' ler) 2 florofor arasındaki tüm hacimde toplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila testislerinin yeterli lekelenmesine yönelik en büyük engel, ezilmiş preparatlar kullanılarak kısmen çözülmüş olan ancak 3D analizlerin (örneğin 3D temsili veya kolokalizasyon ölçüsü) kısıtlanması pahasına antikorların sınırlı penetrability'dir. Prosedür tek tip etiketlemeye izin veriyor ve testislerin tüm hücrelerinin hacmini koruyor. Burada yöntemin illüstrasyonunu S4-S5 spermatositlerinin 3D temsiline odakladık, çünkü en büyük hücrelerdir ve böylece ezilme deformasyonuna karşı daha hassastırlar. Nükleoporinler ve mitotik protein Mad112tarafından tanımlanan intranükleer MINT etki alanının (Mad1 içeren Intra Nükleer Bölge) etiketlenerek dahil olmak üzere farklı nükleer belirteçler kullandık. MINT'ler birkaç farklı antikor tarafından ortaya çıkarabildiğinden, bunları doğru bir mekansal çözüm gerektiren bir yöntem olan nicel 3D kolokalizasyon için protokolün sağlamlığını test etmek için kullandık.
Yukarıda açıklanan protokol, 3D yeniden yapılanma için tedavi edilecek yeterli kalitede konfokal görüntülerin elde edilmesine izin vermektedir. Bir aşama S5 spermatosit dört bitişik seri bölümleri Şekil 1A,DAPI(siyan) ile birlikte MINT (kırmızı GFP güçlendirici kullanarak Mad1 immünolabeling) temsili immünostaining gösteren tasvir edilir. Kromozomlar karakteristik 3 ana farklı küme halinde düzenlenmiştir ve MINT yapısı DNA etrafında ince ayrıntılarla gösterilmiştir, otozomal kromatin kütleleri ile yakından ilişkilidir- ancak ondan farklıdır. Karar ayrıca Mad1'in nükleer çevrede ve 2 ve 3 kromozomlarının otozomal kütleleri arasında varlığının tespit edilmesine izin verdi. 3D temsil için Imaris yazılımını kullandık. Nükleer yüzey, Mad1'in nükleer zarftaki (gri) düşük seviyeli varlığı ile tanımlanmış ve MINT, DAPI boyama (mavi) ile birlikte çekirdeğin içinde (kırmızı) Mad1'in üst düzey birikmesi ile tanımlanmıştır(Şekil 1A). 3D reconstitution filmi, Mad1'in (nükleer zarfta ve MINT'te) S4-S5 spermatositlerindeki kromozomlarla birlikte hacmini ve ilişkisini iyi göstermektedir.
Nükleoporinlerin dağılımı, muhtemelen bu büyük misshapen çekirdeklerinde tespit etme zorluğu nedeniyle, bu hücrelerde sadece kötü tanımlanmıştır. Nup154'ün dağılımı daha önce sadece bir kezbildirilmiştir 16 ve Nup153 ve Nup98 sadece spermatogonia ve küçük, erken spermatositlerde çalışılmıştır17. Nükleoporin Nup62 ve importin β (ketel geninin ürünü) tarafından lekelenen büyük S5 spermatositlerinin 3D rekonsitleri uygulanabilirdi ve sırasıyla Şekil 1C ve Şekil 1D'detemsil edilir. Bu nükleer gözenekle ilişkili bileşenler, düzensiz boyutta noktalar olarak nükleer jant üzerine eşit olmayan bir şekilde dağılmış olarak görünür. Örneğin, importin β, bir lamin ağının zaten açıklandığı yere benzer şekilde otozomal kromatin etrafında toplanır3. Gözenek bakımından zengin alanlar ve geniş gözeneksiz alanlarla yapılan bu tür dağılım kemirgen spermatositlerinde elektron mikroskopisi ile tanımlanmıştır18. Lamin ve nükleoporin dağılımındaki değişiklikleri anlamak, erkek meiosisinin hemen öncesinde bu G2 hücrelerindeki nükleer zarf yapısının anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Hücrelerin 3D hacmini korurken, bu protokol aynı zamanda antikorların her hücrenin derinliğine eşit şekilde nüfuz etmesine izin verir ve kolokalizasyon gibi nicel analizlere izin verir. Pearson korelasyon katsayısı (PCC) iyi kurulmuş bir metriktir. +1 (mükemmel pozitif korelasyonu gösteren) ile −1 (mükemmel negatif korelasyon)19arasında değişebilir. Spermatositlerde Mad1'e göre MINT partner proteinlerinin lokalizasyonunu değerlendirmek için, daha önce S5 spermatositlerinde ImageJ kullanarak 0,5 μm'lik tek bir bölümde PCC'yi tahmin ettik( Şekil 2A,B). Protokolü sadece bir yüzey yerine tüm çekirdeklerde 3D kolokalizasyon kullanarak daha derinlemesine test ettik. Çekirdeğin hacmi manuel segmentasyon ile tanımlanmış ve PCC Colocation aracı kullanılarak ölçüldü. Aynı testislerden veya farklı testislerden sekiz S5 spermatosit çekirdeğini analiz ettik. Şekil 2B, PCC'yi ölçmeye hizmet eden bir çekirdeğin 3B gösterimini göstermektedir. Şekil 2D, PCC'nin üç farklı testisten sekiz farklı S5 spermatosit çekirdeği üzerindeki ölçümünü göstermektedir. PCC değerleri 0,6 ve 0,75 arasında değişen farklı değildir, bu da kolokalizasyon için yüksek bir değer olduğunu gösterir. Bunlar, tek bir bölümde tanımlanan PCC'den ayırt edilemez. Böylece, prosedür tekrarlanabilir bir tekdüze etiketlemeye izin eder ve testislerin tüm hücrelerinin iyi bir hacmini korur.
Protokol, bağımsız testislerden kolokalizasyonun güvenilir bir şekilde ölçülmesine izin verdiğinden, farklı sinek genotiplerinden lekelenmenin karşılaştırılmasını sağlar. Bu burada Mtor için tükenen WT sinekleri ve sinekleri ile karşılaştırıldığında gösterilmiştir (dsRNA UAS çizgilerinin ifadesi ve geç spermatogonia ve erken spermatositlerde önemli tükenme sağlayan Bam-Gal4 sürücüsü20). Kolokalizasyon deneyleri için açıklandığı gibi, Mtor-RNAi tükenmiş testisler ve vahşi tip testisler parçalara ayrıldığında ve birlikte sabitlenmiş ve konfokal görüntüler sabit ayarlar altında elde edilmiştir. Bu koşullara saygı duyarak, tek tek hücrelerin karşılaştırılması mümkün hale gelir. DARPHANE'nin, temsili Mtor RNAi-tükenmiş (üst) ve wt (alt) hücrelerin gösterdiği gibi Mtor kaybından nükleer zarftan daha fazla etkilendiğini gözlemledik (Şekil 3)12.
Şekil 1: Drosophila S4-S5 spermatosit çekirdeklerinin farklı problar kullanılarak immünostainasyonu illüstrasyonu. (A) Mad1-GFP (kırmızı) ile BIRLIKTE DAPI boyama (mavi) ile birlikte MINT yapısını tespit eden α-GFP antikoru (GFP güçlendirici) ile bağışıklık kazanan tek aşamalı 5 spermatosit çekirdeğinin görüntüleri. Mad1 ile iki otozomal kromatin kütlesi (yıldız olarak temsil edilir) arasındaki ilişkiyi hassasiyetle gösterir. Mad1 ayrıca çekirdeğin çevresinde hafifçe tespit edilir. Tüm görüntüler, 3 (0,5 μm) ardışık konfokal dilim yığınının seri Z projeksiyonlarıdır. Konfokal görüntüler konfokal mikroskopta (63x, Plan Apochromatic yağ DIC objektif lens) elde edildi. Ölçek çubukları 5 μm'dir. (B) Aynı spermatosit çekirdeğinin bir film görüntüsünden kare. Nükleer yüzey, nükleer zarftaki Mad1'in düşük ifadesiyle (gri renkte) ve MINT çekirdeğin içindeki Mad1'in yüksek ifadesiyle (kırmızı) tanımlanmıştır. (A, B) Daha önce yayınlanan şekilden izin atılmış olarak yeniden basılmıştır(12'denitibaren). (C) Nup62 (sarı) ve MINT (kırmızı GFP güçlendirici) eşzamanlı immünostaining ile bir evre 5 spermatosit çekirdeğinin 3D görüntüsü. Ölçek çubuğu 4 μm. (D) 3D görüntü bir aşama 5 spermatosit çekirdeği ile aynı anda immünostaining ile importin-β Ketel (sarı) DNA ile birlikte (mavi DAPI). Ölçek çubukları 5 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ulp1 ile birlikte Mad1'in 2D ve 3D Colocalization nicelemesi. (A) Mad1 (yeşil) tespit eden GFP booster antikoru ve 1 μm kalınlığında spermatosit çekirdeği yığını olarak temsil edilen anti-Ulp1 antikoru (kırmızı) ile bağışıklık kazanan 5. Sağda, Coloc-2 ImageJ eklentisi kullanılarak hesaplanan Pearson yoğunluk korelasyon katsayısı belirtilir. PCC'nin 0.73 olduğu tahmin edildi (Raich12'denizin atılmış olarak yeniden basıldı). (B) Mad1 (yeşil) tespit GFP booster antikoru ve 3D projeksiyonda temsil edilen anti-Ulp1 antikoru (kırmızı) ile immünositlenmiş evre 5 spermatosit çekirdeğinin (bitişik tablodaki çekirdek G'ye karşılık gelen) birleştirilmiş görüntüsü. Çekirdeğin hacmi manuel segmentasyon ile tanımlanmıştır. Sağda, tabloda 3 farklı testisten (1 ila 3) 8 farklı spermatosit (A'dan H'ye) hesaplanan Pearson yoğunluk korelasyon katsayıları listeler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mtor RNAi ile tedavi edilen spermatositlerin vahşi tipe göre immünoresans analizi. MtorRNAi (ID 110218) hücreleri (üst paneller) ve vahşi tip hücreler (alt paneller) kullanılarak Mtor'untükenen hücreleri Mad1, Raf2 ve Mtor proteinleri için boyandı. Testisler sabitlendi ve birbirine boyandı, aynı slayta monte edildi ve aynı parametrelerle elde edilen görüntüler. RNAi hücreleri, Sırasıyla Mad1-GFP'nin yokluğu veya varlığı ile WT'den ayırt edilebilir. Şekil, 4 x 0,5 μm yığının maksimum projeksiyonlarını temsil eder. Ölçek çubuğu 5 μm'dir(12'dedaha önce yayınlanan şekilden izin atılmış olarak yeniden basılmıştır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, tüm mount yetişkin Drosophila testislerinin başarılı bir şekilde immünoblabeling için bir yöntem sağlar. Diğer prosedürlerde bildirildiği gibi, spermatositleri engelleme riski taşıyan spermin varlığını en aza indirmek için genç erkeklerin kullanılması gerekir (hatta eklosyondan sonra yaşı 20 saatten daha az bir süreye kısalttık). Diseksiyon hızlı olmalı ve antikor seyreltmesi sinyal-gürültü oranını optimize etmek için ayarlanmalıdır21,22,23. Diğer protokolleri kullanarak, testislerin derinliği boyunca lekelenme gözlemlemediğimiz için, PFA'yı NP40 ve heptane ile birleştiren bir fiksasyon yöntemi geliştirdik. Artık PBS'de rutin olarak %4 paraformaldehitin 600 μL'sini %20 NP40'ın 30 μL'si artı iki cilt hetan ile kullanıyoruz. Bu, yeterli geçirgenlik sağlamak için kritik öneme sahiptir. NP40 miktarını 10 μL'ye düşürmek etiketlemeyi gözle görülür şekilde azaltır. Sonraki tüm adımlar süspansiyonda gerçekleştirildi ve testislerin yerçekimi ile tüpün dibine hafifçe inmesine izin vererek fazla tampon çıkarıldı. Numuneleri bir slayda aktarmanın son adımı için, testislerin koniye yapışmasını önlemek için ucu% 0,1 PBS-T'de durularız. Gözlemlere göre, immünohistolojik boyama protokolü, burada kullanılan belirteçlerin yanı sıra epigenetik histon modifikasyonları, lamin ve nükleoporinlerin probları da dahil olmak üzere çeşitli nükleer proteinlerle iyi çalışır. Protokolün larva testisleri için de kullanılabileceğini, bu durumda testislerin sağlam bir şekilde iyileşmesini zorlaştıracağı için heptane atlanmalıdır.
Protokol özellikle testislerin verimli ve düzgün bir şekilde etiketlenmesi için spermatositlerin hasarsız yığınlarını birlikte tutmak için tasarlanmıştır. Protokolü, misshapen çekirdekleri onları korunması en zor hücreler arasında yapan büyük geç evre spermatositlerle gösterdik. Ayrıca, bu spermatositlerde nükleer etiketleme genellikle çekirdeklerin büyüklüğü nedeniyle seyreltilir. Örneğin, dapi veya lamin etiketlemenin testis tepelerindeki hücrelerde daha güçlü olduğu ve spermatositler büyüdükçe giderek zayıflayıp dağıldığı gözlenir3,24. Bu aynı zamanda nükleoporinlerin dağılımının sadece daha erken evre hücrelerde (spermatogonia ve erken spermatositler) tanımlanmasının nedenlerinden biri olabilir17.
Drosophila S5 spermatositlerinin immünostainasyonunun mükemmel görüntüleri, özellikle testislere özgü t-BRD ve dany proteinleri25,26 için% 0.3 sodyum deoksikolat protokolü kullanılarak veya dokunun ezildikten sonra 21,22. Elimizde, kabaklar organın derinliklerinde önemli bir homojenlik dışı lekelenmeye ve 3D yapıdan ödün vermeye yol açar. % 0.3 sodyum deoksikolat kullanımı daha iyi sonuçlar verse bile, yine de homojenlik gözlemledik. Bu nedenle, tekrarlanabilirliği ve etiketleme kalitesi için NP40'ı tercih ediyoruz. Konfokal görüntüler, nükleer proteinler için 3D görüntülerin yeniden yapılandırılmasına izin vermez. Örneğin, bu yöntemi, burada intranükleer MINT etki alanı tarafından gösterilen, otozomal kromatin kütleleri ve nükleer gözenek ağı ile yakından ilişkili birçok farklı prob kullanarak başarıyla uyguladık. Bu spermatosit çekirdeklerinin nükleer gözeneklerinin ilgi çekici 3D dağılımı artık daha fazla çalışma için mevcuttur. Görüntüler, aynı testislerden ve farklı testislerden farklı spermatositlerden kolokalizasyonun tekrarlanabilir nicelemesine izin vermektedir. Bilgimize göre, Pearson korelasyon katsayısı ile doğru niceleme ilk kez bu tür örnekler üzerinde ölçüldüğünde. Farklı testislerin doğru immün etiketli protein seviyelerinin karşılaştırılması için gereken güveni verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Antikorlar için P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura ve sinekler için A. Debec, Bloomington ve Viyana stok merkezlerine teşekkür ederiz. Öneriler ve teşvik edici tartışmalar için C. Jackson'a teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Stock solution must be prepared in H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Wide Bore Pipette Tips | Fisherbrand | 11917744 | Wide aperture tip |
| Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml micro centrifuge tubes | Sigma | T3531-200EA | Siliconized 2ml tube |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyde 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| 0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T | PBS 1X containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, for molecular biology, | Sigma | T8787 | |
| Antibodies | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Mouse anti-Mtor | 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University | ||
| Rat anti-Nup62 | 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK | ||
| Guinea-pig anti-Ulp1 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| Rabbit anti-Raf2 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| DyLight conjugated series | Thermo | 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse, rabbit or rat) as second antibodies |
References
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
- Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
- Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
- Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
- White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
- Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).
- Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
- Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
- Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S.
- Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
- Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
- Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
- White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
- Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
- Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
- Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).
