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Biology

बड़े शुक्राणुओं के 3 डी कॉन्फोकल विश्लेषण के लिए होल-माउंट ड्रोसोफिला टेस्ट का इम्यूनोस्टेटिंग

Published: August 27, 2020 doi: 10.3791/61061
Automatic Translation
1, 1, 1
1CNRS, Institut Jacques Monod, Université de Paris, F 75006, Paris, France

Summary

हम यहां ड्रोसोफिला टेस्ट की पूरी-माउंट तैयारी और इम्यूनोस्टेटिंग के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त है और प्रजनन योग्य और विश्वसनीय लेबलिंग की अनुमति भी देता है। हम इस प्रोटोकॉल को 3 डी प्रतिनिधित्व और बड़े S4-S5 शुक्राणुओं पर कोलोकलाइजेशन प्रयोगों के परिमाणीकरण द्वारा वर्णन करते हैं।

Abstract

ड्रोसोफिला टेस्ट स्टेम सेल जीव विज्ञान, परमाणु वास्तुकला, मेयोसिस और शुक्राणु विकास सहित जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। हालांकि, पूरे ड्रोसोफिला टेस्टिस का इम्यूनोलबेलिंग अक्सर एंटीबॉडी प्रवेश के कारण धुंधला होने की महत्वपूर्ण गैर-एकरूपता से जुड़ा होता है। कुचल तैयारी केवल आंशिक रूप से समस्या को दूर करने के बाद से यह विश्लेषण की 3 डी गुणवत्ता कम हो जाती है । इसके साथ, हम तरल मीडिया में इम्यूनोलबेलिंग के साथ फिक्सेशन के दौरान NP40 और हेप्टेन का उपयोग करके एक पूरे माउंट प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रजनन योग्य और विश्वसनीय लेबलिंग के साथ मिलकर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त मात्रा को बरकरार रखता है। हम कॉन्फोकल वर्गों से शुक्राणुओं के नाभिक के 3डी पुनर्गठन के विभिन्न उदाहरण दिखाते हैं। अंतर-और अंतर-वृषण प्रजनन क्षमता विभिन्न जीनोटाइप से एकल कोशिकाओं के बीच फ्लोरेसेंस की 3डी मात्राकरण और तुलना की अनुमति देती है। हमने इंट्रान्यूक्लियर मिंट संरचना (Mad1-युक्त इंट्रा न्यूक्लियर टेरिटर) के विभिन्न घटकों के साथ-साथ परमाणु ताकना परिसर से जुड़े दो घटकों का उपयोग किया ताकि इस प्रोटोकॉल और टेस्टिस की सबसे बड़ी कोशिकाओं पर इसके अनुप्रयोगों को समझाया जा सके, S4-S5 शुक्राणु।

Introduction

ड्रोसोफिला टेस्ट परमाणु वास्तुकला के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल हैं। माइटोटिक शुक्राणु कोशिकाओं में, परमाणु मात्रा काफी हद तक क्रोमेटिन द्वारा कब्जा कर लिया जाता है। इन कोशिकाओं को विभाजन के चार दौर से गुजरना, 16 प्राथमिक शुक्राणुओं की एक पुटी का उत्पादन । अगले कई दिनों में, शुक्राणु 6 विकासात्मक चरणों (S1-S6) से गुजरते हैं, मात्रा में बहुत वृद्धि, लगभग 20 गुना1,2। वे अपनी न्यूक्लियर मॉर्फोलॉजी भी बदलते हैं । लैमिन डीएम0 द्वारा प्रकट नाभिक की रूपरेखा अनियमित हो जाती है और गहरी इनविटेशन1,3से पता चलता है। इसके साथ क्रोमेटिन संगठन1, 4,5,6, 7 में व्यापक जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन और संशोधनहोतेहैं । इंटरफेज गुणसूत्रों को चरण S4-S5 में अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है, जो 2 प्रमुख बाइवालेंट ऑटोसोम्स और न्यूक्लियोलस के साथ डॉक की गई एक्स-वाई जोड़ी के अनुरूप तीन अलग-अलग जनता बनाते हैं।

Mad1 मूल रूप से मिटोटिक चेकपॉइंट(8में समीक्षा) के एक प्रमुख घटक के रूप में अलग किया गया था। इंटरफेज में, इसे मुख्य रूप से परमाणु लिफाफे पर स्थित के रूप में वर्णित किया गया है, लेकिन न्यूक्लियोप्लाज्म9,10,11में भी। ड्रोसोफिला टेस्टिस में, हमने बताया कि मैड1 न्यूक्लियोप्लाज्म में प्रमुख है, जो दो प्रमुख ऑटोसोमल क्रोमेटिन जनता के साथ घनिष्ठ रूप से जुड़ा हुआ है और एक्सवाई क्रोमेटिन के साथ कुछ हद तक। हमने इस क्रोमेटिन से जुड़ी संरचना को टकसाल (Mad1-युक्त इंट्रान्यूक्लियर टेरिटरी)12के रूप में परिभाषित किया । चार अन्य प्रोटीन शुक्राणुओं में मिंट्स के साथ जुड़े थे: न्यूकोनोरिन Mtor/Tpr, SUMO पेप्टिसाडे यूएलपी 1, मिटोटिक चेकपॉइंट प्रोटीन Mad2 और पॉलीकॉम्ब जैसे जटिल आरएएफ2 12की एक सबयूनिट ।

MINTs के विवरण को पूरा करने के लिए, हम एंटीबॉडी का उपयोग करने की जरूरत है और तकनीकी समस्याओं के साथ आम तौर पर टेस्टिस में इम्यूनोदाता के साथ सामना किया गया: एक गरीब पारगम्यता के परिणामस्वरूप टेस्टिस की गहराई में धुंधला की एक महत्वपूर्ण गैर एकरूपता में जिसके परिणामस्वरूप, विशेष रूप से बड़े शुक्राणुओं में । एसरद्द तैयारी एंटीबॉडी पहुंच में वृद्धि हुई है, लेकिन संकुचित छवियों के लिए नेतृत्व किया, 3 डी विश्लेषण सीमित है, और कोलोकैलाइजेशन सहित मात्रात्मक फ्लोरेसेंसके माप को रोकने । एंटीबॉडी प्रवेश की समस्या को 0.3% ना डिऑक्सीकोटल13जैसे एजेंटों द्वारा भी संबोधित किया जा सकता है, लेकिन इस प्रक्रिया ने हमारे हाथों में प्रजनन योग्य परिणाम नहीं दिए। क्योंकि हमने कई सह-लेबलिंग प्रयोगों का प्रदर्शन किया, हमने पारमेबिलाइजेशन प्रोटोकॉल में सुधार करने के लिए देखा। 1% NP40 प्लस हेप्टेन के संयोजन के परिणामस्वरूप अधिक प्रजनन क्षमता हुई, विशेष रूप से बड़े शुक्राणुओं का अध्ययन करने में।

यह प्रोटोकॉल निलंबन में टेस्ट के निर्धारण और इम्यूनोसटेनिंग करता है, नमूना गुणवत्ता में सुधार के साथ-साथ प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है, और इसे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त प्रदान करता है। हमने बड़े शुक्राणुओं की न्यूक्लियोप्लाज्मिक संरचनाओं के साथ कुछ परमाणु लिफाफे प्रोटीन के स्थानिक संबंधों को बेहतर ढंग से परिभाषित करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग किया। यह विधि शुक्राणुओं के विकास के साथ होने वाले परिवर्तनों की बेहतर जांच की अनुमति देगी, उदाहरण के लिए क्रोमेटिन, न्यूक्लियोप्लाज्म और परमाणु छिद्रों सहित नाभिक के गतिशील संरचनात्मक परिवर्तन ।

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Protocol

1. ड्रोसोफिला टेस्ट संग्रह

नोट: युवा पुरुषों (0-15 घंटे के बाद eclosion) diploid रोगाणु कोशिकाओं (यानी, शुक्राणु और शुक्राणुओं की जांच के लिए आवश्यक हैं) ।

  1. शुक्राणुओं के विकास से हस्तक्षेप को कम करने के लिए जितना संभव हो युवा मक्खियों का चयन करें।
  2. कार्बन डाइऑक्साइड के संक्षिप्त संपर्क में आने से मक्खियों का एनेस्थेटाइज करें और फ्लाई पैड14,15में स्थानांतरित करदियाजाए ।
  3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (10x आवर्धन) के तहत, सिर को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  4. ब्लैक बैकग्राउंड सपोर्ट पर सिलिकॉन-कोटेड ग्लास स्लाइड पर रिंगर के बफर (183 एमएम केसीआई, 47 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम ट्रिस-एचसीआई, 1 एमएम ईडीटीए, कंप्लीट प्रोटीन अवरोधक, पीएच 6.8) के 100 माइक्रोन में 5 से 10 डिकैपिटेटेड मक्खियों को ट्रांसफर करें।
  5. 40x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप को विच्छेदन करने के साथ, छाती और पेट के बीच एक फ्लाई पकड़ने के लिए 5 नंबर के संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें, और, अन्य संदंश के साथ, पेट को छाती से दूर खींचें। तेजी से मक्खी शव15 से वृषण और आसन्न ऊतकों को अलग करें और एक ही स्लाइड पर रिंगर के बफर की एक नई बूंद में रखें।
  6. एक बार सभी टेस्ट तैयार हो जाने के बाद, शेष ऊतकों (सहायक ग्रंथि और बाहरी जननांग) से टेस्ट को साफ करें।
  7. विच्छेदित टेस्ट युक्त बूंद से अतिरिक्त बफर निकालें। आमतौर पर, 200 माइक्रोल टिप के शीर्ष पर लगे 10 माइक्रोन टिप के साथ एक p200 पिपेट का उपयोग करें। यह एक छोटे अपर्चर के माध्यम से तरल अतिरिक्त को हटाने की अनुमति देता है। विच्छेदित टेस्ट वाले ड्रॉप के शीर्ष पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड फिक्सेटिव की एक बूंद रखें, और फिर तेजी से टेस्ट को ताजा सुधार समाधान वाली ट्यूब में स्थानांतरित करें।

2. पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण

  1. उपयोग से ठीक पहले 2 एमसीएक समाधान तैयार करें: फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में पतला 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीबीएस) में 2 मिलियन सिलिकॉनयुक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 30 माइक्रोन के साथ 2 मिलियन सिलिकॉनयुक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 1200 माइक्रोल हेप्टेन के 600μL। 600 माइक्रोल एलिकोट्स में तैयार पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
    सावधानी: हेप्टेन और पैराफॉर्मलडिहाइड जहरीले होते हैं और इसे धूम हुड में संभाला जाना चाहिए। मेजबान संस्थान के नियमों के अनुसार उन्हें निपटाएं।
  2. पीएफए/NP40/heptane समाधान के लिए एक विस्तृत एपर्चर टिप के साथ एक p200 माइक्रोपिपेट का उपयोग कर टेस्ट स्थानांतरित करें । हाथ से 30 एस के लिए ट्यूब को ऊपर और नीचे हिलाएं। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रोटरी मिक्सर पर टेस्ट फिक्सिंग जारी रखें ।
  3. रोटरी मिक्सर बंद करो और एक ट्यूब रैक में ट्यूब जगह चरण जुदाई की अनुमति के लिए और टेस्ट के लिए ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए ।
  4. सभी हेप्टेन और फिक्सेटिव समाधान निकालें और 1x पीबीएस के साथ तीन बार टेस्ट्स को जल्दी से कुल्ला करें।
  5. एक साफ 200 μL व्यक्तिगत ट्यूब पर स्थानांतरित करें। नियोजित एंटीबॉडी की मात्रा को कम करने के लिए इन छोटी ट्यूबों में सभी ऊष्मायनों का प्रदर्शन करें।
  6. P200 और P10 टिप दोनों के साथ 200 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके अतिरिक्त बफर निकालें। टेस्ट को एस्पिरेट न करने का ध्यान रखें।
  7. बर्फ पर 1x PBS में टेस्ट रखें जब तक सभी नमूने तैयार हैं।

3. समाधान में एंटीबॉडी धुंधला

  1. पीबीएस को त्यागें और कोशिका झिल्ली को पार करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 0.3% पीबीएस-टी में टेस्ट छोड़ दें।
  2. एक ही बफर प्लस 1 घंटे के लिए 5% सामान्य बकरी सीरम (NGS) में पूर्व-इनक्यूबेट।
  3. 0.3% पीबीएस-टी प्लस 5% एनजी(सामग्रीकी तालिका) में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 माइक्रोन जोड़ें।
  4. एक घुमाव पर कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस (या कमरे के तापमान) पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी को इनक्यूबेट करें।
  5. कमरे के तापमान पर एक घुमाव पर 15 मिनट के लिए 0.3% पीबीएस-टी में 3 बार धोएं। टेस्ट को गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति दें।
  6. डाइलाइट संयुग्मित श्रृंखला से 1:500 पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 μL जोड़ें।
  7. कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए एक अंधेरे कक्ष में माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेट।
  8. कमरे के तापमान पर एक घुमाव पर 15 मिनट के लिए 0.3% पीबीएस-टी में धोएं। फिर कमरे के तापमान पर एक घुमाव पर 30 मिनट के लिए हर बार 0.2% पीबीएस-टी और 0.1% पीबीएस-टी के साथ दोहराएं। डिटर्जेंट को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए 1x पीबीएस में अंतिम वॉश करें।
  9. 15 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 1 μg/mL पर DAPI समाधान के 180 μL जोड़ें। स्टॉक सॉल्यूशन है 10 मिलीग्राम/एमएल एच2ओ में पीबीएस में स्टॉक सॉल्यूशन बनाने से बचें, जिससे बड़े स्पर्मेटोसाइट्स में डिफ्यूज क्रोमेटिन पर डैपी स्टेनिंग सिग्नल को कम किया जा सकता है।
  10. प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x धोएं।
  11. एक साफ स्लाइड पर एक सर्कल आकर्षित करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम का प्रयोग करें।
  12. टेस्ट को एस्पिरेट करें और उन्हें स्लाइड पर रखें। 0.1% पीबीएस-टी के साथ विस्तृत एपर्चर टिप को प्री-रिंसिंग करने से टेस्ट्स को टिप से चिपके रहने से रोकता है। अतिरिक्त पीबीएस निकालें।
  13. सिटीफ्लोर AF1 की एक बूंद (लगभग 100 माइक्रोन) जोड़ें।
  14. धीरे-धीरे ऊतक के ऊपर एक ग्लास कवरलिप रखें, हवा के बुलबुले को फँसाने से बचने के लिए ध्यान रखें।
  15. स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग करके स्लाइड पर कवर्लिप को सील करें।
  16. आगे की स्लाइड्स में देखें माइक्रोस्कोप से।

4. कोलोकलाइजेशन विश्लेषण

  1. कॉन्फोकल इमेज हासिल करें। हमने 0.5 या 1 माइक्रोन के जेड-रेजोल्यूशन के साथ ज़ीस एलएसएम 710 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (63x प्लान एपोक्रोमेटिक ऑयल) का इस्तेमाल किया।
  2. स्वतंत्र टेस्ट से विभिन्न कोशिकाओं का चयन करें।
  3. प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (जैसे, Imaris) के लिए छवियों का आयात करें।
  4. पड़ोसी नाभिक को बाहर करने के लिए मैन्युअल विभाजन द्वारा नाभिक को परिभाषित करें। कोलैक सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; यह 2 फ्लोरोफोरस के बीच पूरी मात्रा के अंदर पियर्सन के सहसंबंध गुणांक (पीसीसी) एकत्र करता है।

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Representative Results

ड्रोसोफिला टेस्ट के पर्याप्त धुंधला प्राप्त करने में मुख्य बाधा एंटीबॉडी की सीमित प्रवेशीयता है, जिसे कुचल तैयारियों का उपयोग करके आंशिक रूप से हल किया गया है, लेकिन 3 डी विश्लेषणों के प्रतिबंध को प्रेरित करने की कीमत पर (उदाहरण के लिए 3 डी प्रतिनिधित्व या कोलोकलाइजेशन का उपाय)। प्रक्रिया एक समान लेबलिंग की अनुमति देती है और टेस्टिस की सभी कोशिकाओं की मात्रा को बरकरार रखता है। यहां हमने S4-S5 शुक्राणुओं के 3 डी प्रतिनिधित्व पर विधि के चित्रण को केंद्रित किया है, क्योंकि वे सबसे बड़ी कोशिकाएं हैं और इस प्रकार स्क्वैशिंग से विरूपण के प्रति अधिक संवेदनशील हैं। हमने न्यूक्लियोरोरोरिन और इंट्रान्यूक्लियर मिंट डोमेन (Mad1-युक्त इंट्रा न्यूक्लियर टेरिटरी) की लेबलिंग सहित विभिन्न परमाणु मार्कर का उपयोग किया, जिसे माइटोटिक प्रोटीन मैड112द्वारा वर्णित किया गया था। चूंकि MINTs को कई अलग-अलग एंटीबॉडी द्वारा प्रकट किया जा सकता है, हमने उन्हें मात्रात्मक 3 डी कोलोकैलाइजेशन के लिए प्रोटोकॉल की मजबूती का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया, एक विधि जो एक सही स्थानिक संकल्प की आवश्यकता है।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल पर्याप्त गुणवत्ता की कॉन्फोकल छवियों के अधिग्रहण की अनुमति देता है ताकि 3 डी पुनर्गठन के लिए इलाज किया जा सके। एक चरण S5 शुक्राणुओं के चार आसन्न धारावाहिकों को चित्र 1 एमें चित्रित किया गया है, जिसमें डीड के एक प्रतिनिधि इम्यूनोसटेनिंग (लाल रंग में जीएफपी बूस्टर का उपयोग करके पागल1 इम्यूनोबेलिंग) को DAPI (सियान में) के साथ दिखाया गया है। गुणसूत्रों को विशेषता 3 प्रमुख अलग समूहों में व्यवस्थित किया जाता है और टकसाल संरचना डीएनए के आसपास ठीक विस्तार से दिखाई जाती है, जो परिचित रूप से जुड़ी हुई है-लेकिन ऑटोसोमल क्रोमेटिन जनता से अलग है । यह संकल्प परमाणु परिधि में Mad1 की उपस्थिति का पता लगाने के साथ-साथ गुणसूत्रों 2 और 3 के ऑटोसोमल जनता के बीच भी अनुमति देता है । हमने 3डी प्रतिनिधित्व के लिए Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग किया। परमाणु सतह परमाणु लिफाफे में Mad1 के निम्न स्तर की उपस्थिति द्वारा परिभाषित किया गया था (ग्रे में) और टकसाल नाभिक के अंदर Mad1 के उच्च स्तर के संचय द्वारा परिभाषित किया गया था (लाल रंग में) एक साथ DAPI धुंधला (नीले रंग में)(चित्रा 1A)के साथ । 3 डी पुनर्गठन फिल्म अच्छी तरह से मात्रा और Mad1 के रिश्ते (परमाणु लिफाफे में और टकसाल में) मंच S4-S5 शुक्राणुओं में गुणसूत्रों के साथ दिखाता है ।

न्यूकोपोरिन का वितरण इन कोशिकाओं में केवल खराब वर्णित किया गया है, शायद इन बड़े गलत ास्पति नाभिक में उनका पता लगाने में कठिनाई के कारण। Nup154 के वितरण की सूचना केवल एक बार पहले16 और Nup153 और Nup98 केवल शुक्राणुओं और छोटे, प्रारंभिक शुक्राणुओं17में अध्ययन किया गयाहै । न्यूक्लियोपोरिन Nup62 द्वारा दाग बड़े S5 शुक्राणुओं के 3 डी पुनर्संगठन और आयातन β (केटेल जीन के उत्पाद) व्यवहार्य थे और क्रमशः चित्रा 1C और चित्रा 1D में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । ये परमाणु ताकना से जुड़े घटक अनियमित आकार के बिंदुओं के रूप में परमाणु रिम पर गैर-समान रूप से वितरित दिखाई देते हैं । उदाहरण के लिए, β आयात ऑटोसोमल क्रोमेटिन के आसपास इकट्ठा होता है, जहां एक लेमिन नेटवर्क पहले से ही3वर्णित किया गया है। पोर-समृद्ध क्षेत्रों और बड़े ताकना मुक्त क्षेत्रों के साथ इस तरह के वितरण का वर्णन कृंतक शुक्राणुओं में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया है18। लेमिन और न्यूक्लियोपोरिन वितरण में परिवर्तन को समझने से इन जी2 कोशिकाओं में परमाणु लिफाफा संरचना को समझने में मदद मिलेगी जो पुरुष मीयोसिस से ठीक पहले है ।

कोशिकाओं की 3डी मात्रा को संरक्षित करते समय यह प्रोटोकॉल एंटीबॉडी को हर कोशिका की गहराई में समान रूप से प्रवेश करने की अनुमति देता है, जिससे कोलोकैलाइजेशन जैसे मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति होती है। पियर्सन सहसंबंध गुणांक (पीसीसी) एक अच्छी तरह से स्थापित मीट्रिक है। यह +1 (सही सकारात्मक सहसंबंध को दर्शाता है) से लेकर −1 (सही नकारात्मक सहसंबंध)19तक हो सकता है। शुक्राणुओं में Mad1 के सापेक्ष टकसाल साथी प्रोटीन के स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए, हमने पहले S5 शुक्राणुओं में ImageJ का उपयोग करके 0.5 माइक्रोन के एक खंड पर पीसीसी का अनुमान लगाया है(चित्रा2 ए, बी)। हमने सिर्फ एक सतह के बजाय पूरे नाभिक पर 3 डी कोलोकैलाइजेशन का उपयोग करके प्रोटोकॉल का अधिक गहराई से परीक्षण किया। नाभिक की मात्रा को मैनुअल विभाजन द्वारा परिभाषित किया गया था और पीसीसी को कोलोशन टूल का उपयोग करके मापा गया था। हमने एक ही टेस्टिस या विभिन्न टेस्ट से आठ S5 शुक्राणुओं नाभिक का विश्लेषण किया। चित्रा 2B एक नाभिक का 3D प्रतिनिधित्व दिखाता है जो पीसीसी को मापने के लिए काम करता है। चित्रा 2 डी तीन अलग-अलग टेस्ट से आठ अलग-अलग S5 शुक्राणुओं नाभिक पर पीसीसी के माप को दर्शाता है। पीसीसी मूल्य अलग नहीं हैं, 0.6 और 0.75 से भिन्न हैं, जो कोलोकैलाइजेशन के लिए उच्च मूल्य का संकेत देते हैं। ये एक ही खंड पर परिभाषित पीसीसी से अविवेच्य हैं । इस प्रकार, प्रक्रिया एक प्रजनन योग्य समान लेबलिंग की अनुमति देती है और टेस्टिस की सभी कोशिकाओं की अच्छी मात्रा को बरकरार रखता है।

क्योंकि प्रोटोकॉल स्वतंत्र वृषण से कोलोकैलाइजेशन के विश्वसनीय माप की अनुमति देता है, इसलिए इसने विभिन्न फ्लाई जीनोटाइप से धुंधला होने की तुलना की अनुमति दी। यह यहां डब्ल्यूटी मक्खियों और मक्खियों की तुलना से सचित्र था आरएनएआई Mtor के लिए समाप्त (dsRNA UAS लाइनों और बाम-Gal4 ड्राइवर की अभिव्यक्ति से उत्पन्न जो देर से शुक्राणुओं और प्रारंभिक शुक्राणुओं20में पर्याप्त कमी प्राप्त करते हैं)। जैसा कि कोलोकलाइजेशन प्रयोगों के लिए वर्णित है, मस्टर-आरएनएआई-समाप्त वृषण और जंगली प्रकार के वृषणों को विच्छेदित किया गया था और एक साथ तय किया गया था और कॉन्फोकल छवियों को निरंतर सेटिंग्स के तहत प्राप्त किया गया था। इन स्थितियों का सम्मान करते हुए, व्यक्तिगत कोशिकाओं की तुलना संभव हो जाती है। हमने देखा कि मिंट एमटीआर के नुकसान से परमाणु लिफाफे से अधिक प्रभावित होता है जैसा कि प्रतिनिधि एमटीआर आरएनएआई-समाप्त (ऊपरी) और डब्ल्यूटी (निचले) कोशिकाओं(चित्रा 3)12द्वारा दिखाया गया है।

Figure 1
चित्र 1: विभिन्न जांचों का उपयोग करके ड्रोसोफिला S4-S5 शुक्राणुओं के इम्यूनोस्टेटिंग का चित्रण। (क)एक ही चरण की छवियां 5 शुक्राणुएक नाभिक इम्यूनोडाट α-जीएफपी एंटीबॉडी (जीएफपी बूस्टर) के साथ मिंट संरचना का पता लगाने के साथ Mad1-GFP (लाल) एक साथ DAPI धुंधला (नीला) । यह सटीकता के साथ Mad1 और दो ऑटोसोमल क्रोमेटिन जनता (तारक के रूप में प्रतिनिधित्व) के बीच संबंध दिखाता है। Mad1 भी बेहोशी नाभिक की परिधि में पता चला है । सभी छवियां 3 (0.5 माइक्रोन) के स्टैक के सीरियल जेड-अनुमान हैं लगातार कॉन्फोकल स्लाइस। कॉन्फोकल इमेजेज को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (63x, प्लान एपोक्रोमैटिक ऑयल डीआईसी ऑब्जेक्टिव लेंस) पर हासिल किया गया था। स्केल बार 5 माइक्रोन हैं।(B)एक ही शुक्राणु नाभिक के एक फिल्म प्रतिपादन से फ्रेम । परमाणु सतह को परमाणु लिफाफे (ग्रे में) पर Mad1 की कम अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया था और टकसाल को नाभिक (लाल रंग में) के अंदर Mad1 की उच्च अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया था। (A, B) पहले प्रकाशित आंकड़े(12से) से अनुमति के साथ पुनर्संरित । (ग)एक चरण 5 शुक्राणुओं की 3 डी छवि एनयूप 62 (पीला) और टकसाल (लाल रंग में जीएफपी बूस्टर) के एक साथ इम्यूनोदाता के साथ। स्केल बार 4 माइक्रोन है।(D)एक चरण 5 शुक्राणुओं की 3 डी छवि, जो डीएनए (नीले रंग में DAPI) के साथ आयात-β केटेल (पीला) के एक साथ इम्यूनोदाता है। स्केल बार 5 माइक्रोन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: Ulp1 के साथ Mad1 के 2D और 3डी कोलोकैलाइजेशन क्वांटिफिकेशन। (क)एक चरण 5 शुक्राणुओं के मिश्रित नाभिक इम्यूनोडायर्ड के साथ जीएफपी बूस्टर एंटीबॉडी का पता लगाने मैड 1 (ग्रीन) और एंटी-यूएलपी 1 एंटीबॉडी (लाल) के साथ एक शुक्राणु नाभिक नाभिक के 1 माइक्रोन मोटी ढेर के रूप में प्रतिनिधित्व किया । दाईं ओर पियर्सन तीव्रता सहसंबंध गुणांक को कोलैक-2 इमेजजे प्लगइन का उपयोग करके गणना की जाती है। पीसीसी को 0.73 (रायच12से अनुमति के साथ पुनर् मुद्रित) का अनुमान लगाया गया था। (ख)चरण 5 शुक्राणुओं के नाभिक नाभिक की विलय छवि (आसन्न तालिका में नाभिक जी के अनुरूप) जीएफपी बूस्टर एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोडाटांड मैड1 (ग्रीन) का पता लगाने और एंटी-यूएलपी1 एंटीबॉडी (लाल) के साथ 3 डी प्रक्षेपण में प्रतिनिधित्व किया गया । नाभिक की मात्रा को मैनुअल विभाजन द्वारा परिभाषित किया गया था। दाईं ओर, तालिका में पियर्सन तीव्रता सहसंबंध गुणांक को 3 अलग-अलग टेस्ट (1 से 3) से 8 अलग-अलग शुक्राणुओं (ए से एच) पर गणना की गई सूचीबद्ध करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: जंगली प्रकार की तुलना में Mtor RNAi-इलाज शुक्राणुओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण। MtorRNAi (आईडी 110218) कोशिकाओं (ऊपरी पैनल) और जंगली प्रकार कोशिकाओं (निचले पैनलों) का उपयोग कर Mtorके समाप्त कोशिकाओं Mad1, Raf2 और Mtor प्रोटीन के लिए दाग थे । टेस्ट तय किए गए थे और एक साथ दाग दिए गए थे, एक ही स्लाइड पर घुड़सवार और एक ही पैरामीटर के साथ प्राप्त छवियों। आरएनएआई कोशिकाओं को क्रमशः Mad1-GFP की अनुपस्थिति या उपस्थिति से डब्ल्यूटीई से अलग किया जा सकता है। यह आंकड़ा 4 x 0.5 माइक्रोन स्टैक के अधिकतम अनुमानों का प्रतिनिधि है। स्केल बार 5 माइक्रोन है(12में पहले प्रकाशित आंकड़े से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल पूरे माउंट वयस्क ड्रोसोफिला टेस्ट के सफल इम्यूनोबेलिंग के लिए एक विधि प्रदान करता है। जैसा कि अन्य प्रक्रियाओं में बताया गया है कि युवा पुरुषों का उपयोग किया जाना चाहिए (हमने शुक्राणुओं के विकास की उपस्थिति को कम करने के लिए उम्र को भी कम कर दिया है) जो शुक्राणुओं में बाधा डालने का जोखिम है। विच्छेदन तेजी से होना चाहिए और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को सिग्नल-टू-शोर अनुपात21, 22,23को अनुकूलित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। क्योंकि अन्य प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने टेस्टिस की गहराई में धुंधलापन का पालन नहीं किया, हमने एनपी 40 और हेप्टेन के साथ पीएफए के संयोजन के लिए एक निर्धारण विधि विकसित की। अब हम नियमित रूप से पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 600 माइक्रोन का उपयोग करते हैं जिसमें 20% NP40 के 30 माइक्रोन के साथ-साथ हेप्टेन के दो वॉल्यूम हैं। यह पर्याप्त पारमेबिलाइजेशन के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। NP40 की मात्रा को घटाकर 10 माइक्रोल दिख रहा है लेबलिंग को कम करता है । बाद के सभी कदम निलंबन में किए गए और अतिरिक्त बफर को गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के नीचे धीरे से उतरने की अनुमति देकर हटा दिया गया था। एक स्लाइड करने के लिए नमूनों को स्थानांतरित करने वाले अंतिम चरण के लिए, हम शंकु से चिपके हुए टेस्ट को रोकने के लिए 0.1% पीबीएस-टी में टिप कुल्ला। टिप्पणियों के अनुसार, इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार के परमाणु प्रोटीन के साथ अच्छी तरह से काम करता है, जिसमें यहां इस्तेमाल किए जाने वाले मार्कर शामिल हैं, साथ ही एपिजेनेटिक हाइस्टोन संशोधनों, लेमिन और न्यूक्लियोपोरिन की जांच भी शामिल है । हम ध्यान दें कि प्रोटोकॉल का उपयोग लार्वा वृषण के लिए भी किया जा सकता है, जिस स्थिति में हेप्टेन को छोड़ दिया जाना चाहिए, क्योंकि यह टेस्ट को बरकरार रखने के लिए अधिक कठिन बनाता है।

प्रोटोकॉल विशेष रूप से टेस्टिस की एक कुशल और एक समान लेबलिंग के लिए शुक्राणुओं के अक्षतिग्रस्त ढेर को एक साथ बनाए रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हमने प्रोटोकॉल को बड़े देर चरण के शुक्राणुओं के साथ सचित्र किया, जिसका गलत निशक्त नाभिक उन्हें संरक्षित करने के लिए सबसे कठिन कोशिकाओं में से एक बनाता है। इसके अलावा, इन शुक्राणुओं में परमाणु लेबलिंग अक्सर नाभिक के आकार के कारण शायद पतला हो जाती है। उदाहरण के लिए, आमतौर पर यह देखा जाता है कि टेस्टिस शीर्ष पर कोशिकाओं में दापी या लेमिन लेबलिंग मजबूत होती है और उत्तरोत्तर कमजोर और अधिक तितर-बितर हो जाती है क्योंकि शुक्राणु3,24बढ़ रहे हैं। यह भी एक कारण हो सकता है कि न्यूकोपोरिन के वितरण का वर्णन केवल पहले चरण की कोशिकाओं (शुक्राणुओं और प्रारंभिक शुक्राणुओं)17में किया गया है।

ड्रोसोफिला S5 शुक्राणुओं के इम्यूनोस्टेटिंग की उत्कृष्ट छवियां प्रकाशित की गई हैं, विशेष रूप से टेस्टिस-विशिष्ट टी-बीआरडी और डैंसी प्रोटीन25,26 या तो 0.3% सोडियम डिऑक्सीकोटे प्रोटोकॉल का उपयोग करके या ऊतक21, 22के स्क्वैशिंग के बाद। हमारे हाथों में, स्क्वैश अंग की गहराई में धुंधला करने की एक महत्वपूर्ण गैर-एकरूपता का कारण बनते हैं और साथ ही 3 डी संरचना का त्याग करते हैं। यहां तक कि अगर 0.3% सोडियम डिऑक्सीकोटल के उपयोग ने बेहतर परिणाम दिए, तो भी हमने गैर-एकरूपता देखी। इस प्रकार, हम इसकी प्रजनन क्षमता और लेबलिंग की गुणवत्ता के लिए NP40 पसंद करते हैं। कॉन्फोकल इमेजेज न्यूक्लियर प्रोटीन के लिए 3डी इमेजेज के पुनर्निर्माण की इजाजत देती हैं । उदाहरण के लिए, हमने कई अलग-अलग जांचों का उपयोग करके इस विधि को सफलतापूर्वक लागू किया है, जो यहां इंट्रान्यूक्लियर मिंट डोमेन द्वारा सचित्र है, जो ऑटोसोमल क्रोमेटिन जनता और परमाणु पोर नेटवर्क से परिचित रूप से जुड़ा हुआ है। इन शुक्राणुओं के नाभिक के परमाणु छिद्रों का पेचीदा 3डी वितरण अब आगे के अध्ययनों के लिए उपलब्ध है । छवियां एक ही टेस्टिस से और विभिन्न टेस्ट से विभिन्न शुक्राणुओं से कोलोकैलाइजेशन के प्रजनन योग्य मात्रा की अनुमति देती हैं। हमारे ज्ञान के लिए यह पहली बार है कि पियर्सन सहसंबंध गुणांक द्वारा सटीक मात्राकरण ऐसे नमूनों पर मापा गया है । यह विभिन्न टेस्ट की तुलना सटीक इम्यूनोलेबेल्ड प्रोटीन स्तर के लिए आवश्यक आत्मविश्वास देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पी Verrijzer, जे जोहानसेन एच, एंटीबॉडी और ए Debec, ब्लूमिंगटन और मक्खियों के लिए वियना स्टॉक केंद्रों के लिए ओखुरा का शुक्रिया अदा करते हैं । सुझाव और उत्तेजक चर्चा के लिए सी जैक्सन के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi  VDRC ID 110218 Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI  Thermo D1306 Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps  Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips Fisherbrand 11917744 Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube Thermo AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes  Sigma T3531-200EA  Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1 Citifluor AF1
Dakopen  Sigma Z377821-1EA 
Normal Goat Serum (NGS) Sigma NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4% Sigma P6148-500G  Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml 
PBS 1X Thermo 14190094 DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T  PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,  Sigma T8787
Antibodies
GFP booster Chromotek gba488 1/200
Mouse anti-Mtor 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series  Thermo 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies

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References

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जीव विज्ञान अंक 162 ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर,टेस्ट्स स्पर्मेटोसाइट्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेज 3 डी कोलोकैलाइजेशन न्यूक्लियोपोरिन न्यूक्लियर टेरिटरी न्यूक्लियर पोर कॉम्प्लेक्स
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Raich, N., Contremoulins, V., Karess, R. E. Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes. J. Vis. Exp. (162), e61061, doi:10.3791/61061 (2020).

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