Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Published: August 27, 2020 doi: 10.3791/61061
Automatic Translation
1, 1, 1
1CNRS, Institut Jacques Monod, Université de Paris, F 75006, Paris, France

Summary

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Abstract

Drosophila-Hoden sind ein leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung biologischer Prozesse, einschließlich Stammzellbiologie, Kernarchitektur, Meiose und Spermienentwicklung. Die Immunmarkierung des gesamten Drosophila-Hodens ist jedoch oft mit einer signifikanten Ungleichmäßigkeit der Färbung aufgrund der Antikörperpenetration verbunden. Gequetschte Präparate überwinden das Problem nur teilweise, da sie die 3D-Qualität der Analysen verringern. Hierin beschreiben wir ein Whole-Mount-Protokoll mit NP40 und Heptan während der Fixierung zusammen mit der Immunmarkierung in flüssigen Medien. Es bewahrt das für die konfokale Mikroskopie geeignete Volumen zusammen mit einer reproduzierbaren und zuverlässigen Markierung. Wir zeigen verschiedene Beispiele für die 3D-Rekonstitution von Spermatozytenkernen aus konfokalen Abschnitten. Die Reproduzierbarkeit von Intra- und Inter-Hoden ermöglicht die 3D-Quantifizierung und den Vergleich der Fluoreszenz zwischen einzelnen Zellen verschiedener Genotypen. Wir verwendeten verschiedene Komponenten der intranukleären MINT-Struktur (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) sowie zwei Komponenten, die mit dem Kernporenkomplex verbunden sind, um dieses Protokoll und seine Anwendungen auf den größten Zellen des Hodens, den S4-S5-Spermatozyten, zu veranschaulichen.

Introduction

Drosophila-Hoden sind ein wertvolles Modell für das Studium der nuklearen Architektur. In mitotischen Spermatogonienzellen ist das Kernvolumen weitgehend mit Chromatin besetzt. Diese Zellen durchlaufen vier Teilungsrunden und produzieren eine Zyste von 16 primären Spermatozyten. In den nächsten Tagen durchlaufen die Spermatozyten 6 Entwicklungsstadien (S1-S6), wobei das Volumen stark zunimmt, ungefähr 20-fach1,2. Sie verändern auch ihre Kernmorphologie. Der Umriss des Kerns, der durch das Lamin Dm0 offenbart wird, wird unregelmäßig und zeigt tiefe Invaginationen1,3. Damit einher gehen umfangreiche Genexpressionsveränderungen und Modifikationen in der Chromatinorganisation1,4,5,6,7. Die Interphasenchromosomen sind im Stadium S4-S5 gut definiert und bilden drei verschiedene Massen, die den 2 wichtigsten bivalenten Autosomen und dem X-Y-Paar entsprechen, das an den Nukleolus angedockt ist.

Mad1 wurde ursprünglich als Schlüsselkomponente des mitotischen Checkpoints isoliert (überprüft in8). In der Interphase wird es als primär an der Kernhülle, aber auch im Nukleoplasmus9,10,11lokalisiert beschrieben. Bei Drosophila hoden berichteten wir, dass Mad1 im Nukleoplasma prominent ist, eng mit den beiden großen autosomalen Chromatinmassen und in geringerem Maße mit dem XY-Chromatin verbunden ist. Wir haben diese Chromatin-assoziierte Struktur als MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12definiert. Vier weitere Proteine waren mit MINTs in Spermatozyten assoziiert: das Nukleoporin Mtor/Tpr, das SUMO peptidase Ulp1, das mitotische Checkpointprotein Mad2 und eine Untereinheit eines Polycomb-ähnlichen Komplexes Raf212.

Um die Beschreibung von MINTs zu vervollständigen, mussten wir Antikörper verwenden und wurden mit den technischen Problemen konfrontiert, die im Allgemeinen bei der Immunfärbung im Hoden auftreten: eine schlechte Permeabilität, die zu einer signifikanten Ungleichmäßigkeit der Färbung in der Tiefe des Hodens, insbesondere in den großen Spermatozyten, führt. Szerschmierte Präparate erhöhten den Antikörperzugang, führten jedoch zu komprimierten Bildern, schränkten die 3D-Analysen ein und verhinderten die Messung der quantitativen Fluoreszenz, einschließlich der Kolokalisierung. Das Problem der Antikörperpenetration könnte auch durch Permeabilisierungsmittel wie 0,3% Na-Desoxycholat13angegangen werden, aber dieses Verfahren führte in unseren Händen nicht zu reproduzierbaren Ergebnissen. Da wir viele Co-Labeling-Experimente durchgeführt haben, haben wir versucht, das Permeabilisierungsprotokoll zu verbessern. Die Kombination von 1% NP40 plus Heptan führte zu mehr Reproduzierbarkeit, insbesondere bei der Untersuchung der großen Spermatozyten.

Dieses Protokoll führt die Fixierung und Immunfärbung von Hoden in Suspension durch, verbessert die Probenqualität sowie verbessert die Reproduzierbarkeit und macht sie für die konfokale Mikroskopie geeignet. Wir haben das Protokoll verwendet, um die räumlichen Beziehungen bestimmter Kernhüllenproteine mit den nukleoplasmatischen Strukturen großer Spermatozyten besser zu definieren. Diese Methode wird es ermöglichen, die Veränderungen, die die Spermatozytenentwicklung begleiten, besser zu überprüfen, zum Beispiel die dynamischen strukturellen Veränderungen des Kerns einschließlich Chromatin, Nukleoplasma und der Kernporen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Drosophila Hodensammlung

HINWEIS: Junge Männchen (0-15 h nach der Eklosion) sind notwendig, um diploide Keimzellen (dh Spermatogonie und Spermatozyten) zu untersuchen.

  1. Wählen Sie junge Fliegen so weit wie möglich aus, um Störungen durch die Entwicklung von Spermatiden zu minimieren.
  2. Anästhesieren Sie Fliegen durch kurze Exposition gegenüber Kohlendioxid und Übertragen auf ein Fliegenpad14,15.
  3. Unter einem Seziermikroskop (10-fache Vergrößerung) den Kopf mit einer Zette entfernen.
  4. 5 bis 10 enthauptete Fliegen auf 100 μL Ringer-Puffer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, vollständiger Proteininhibitor, pH 6,8) auf einen silikonbeschichteten Glasträger auf schwarzem Hintergrundträger übertragen.
  5. Verwenden Sie mit einem Seziermikroskop bei einer 40-fachen Vergrößerung ein Paar Einer Zange Nummer 5, um eine Fliege zwischen Thorax und Bauch zu halten, und ziehen Sie mit einer anderen Zange den Bauch vom Thorax weg. Isolieren Sie schnell die Hoden und das angrenzende Gewebe aus dem Fliegenkadaver15 und legen Sie einen neuen Tropfen Ringers Puffer auf denselben Objektträger.
  6. Sobald alle Hoden fertig sind, reinigen Sie die Hoden von den verbleibenden Geweben (Akzessodrüse und äußere Genitalien).
  7. Entfernen Sie überschüssigen Puffer aus dem Tropfen, der die sezierten Hoden enthält. Verwenden Sie in der Regel eine p200-Pipette mit einer 10-μL-Spitze, die auf einer 200-μL-Spitze angebracht ist. Dies ermöglicht die Entfernung des Flüssigkeitsüberschusses durch eine kleine Öffnung. Legen Sie einen Tropfen 4% Paraformaldehyd-Fixiermittel auf den Tropfen, der die sezierten Hoden enthält, und geben Sie die Hoden dann schnell in ein Röhrchen mit frischer Fixierlösung.

2. Paraformaldehyd-Fixierung

  1. Bereiten Sie 2 ml Fixierlösung kurz vor dem Gebrauch vor: 600 μL 4% Paraformaldehyd verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 30 μL NP40 20% plus 1200 μL Heptan in einem 2 mL silikonisierten Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd in PBS, das in 600 μL Aliquoten hergestellt und bei -20 °C gelagert wird.
    Achtung: Heptan und Paraformaldehyd sind giftig und sollten in einem Abzug gehandhabt werden. Entsorgen Sie diese gemäß den Vorschriften des Gastinstituts.
  2. Übertragen Sie die Hoden mit einer p200-Mikropipette mit einer breiten Öffnungsspitze auf die PFA/NP40/Heptan-Lösung. Schütteln Sie den Schlauch 30 s lang von Hand auf und ab. Setzen Sie die Fixierung der Hoden auf einem Rotationsmischer bei Raumtemperatur für 30 minuten fort.
  3. Stoppen Sie den Rotationsmischer und legen Sie das Rohr in ein Rohrgestell, damit die Phasentrennung erfolgt und sich die Hoden am Boden des Rohres absetzen können.
  4. Entfernen Sie das gesamte Heptan und die Fixierlösung und spülen Sie die Hoden schnell dreimal mit 1x PBS aus.
  5. In ein sauberes 200 μL Einzelröhrchen überführen. Führen Sie alle Inkubationen in diesen kleinen Röhrchen durch, um die Menge der verwendeten Antikörper zu minimieren.
  6. Entfernen Sie überschüssigen Puffer mit einer 200 μL-Mikropipette, an der sowohl eine P200- als auch eine P10-Spitze angebracht sind. Achten Sie darauf, keine Hoden anzusaugen.
  7. Halten Sie die Hoden in 1x PBS auf Eis, bis alle Proben fertig sind.

3. Antikörperfärbung in Lösung

  1. Verwerfen Sie das PBS und lassen Sie die Hoden in 0,3% PBS-T für 30 minuten bei Raumtemperatur, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.
  2. Im selben Puffer plus 5% normales Ziegenserum (NGS) für 1 h vorinkubieren.
  3. 200 μL des primären Antikörpers verdünnt in 0,3% PBS-T plus 5% NGS ( Materialtabelle )werden hinzugefügt.
  4. Inkubieren Sie den primären Antikörper über Nacht bei 4 °C (oder Raumtemperatur) mit sanftem Rühren auf einer Wippe.
  5. 3 mal in 0,3% PBS-T für 15 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur waschen. Lassen Sie die Hoden sich durch die Schwerkraft auf den Boden der Röhre absetzen.
  6. Fügen Sie 200 μL sekundären Antikörper hinzu, der 1:500 verdünnt ist, aus der dyLight-konjugierten Serie.
  7. Inkubieren Sie den sekundären Antikörper in einer dunklen Kammer für 4 h bei Raumtemperatur.
  8. In 0,3% PBS-T für 15 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur waschen. Dann mit 0,2% PBS-T und 0,1% PBS-T wiederholen, jedes Mal für 30 minuten auf einer Wippe bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Reinigungsmittel abschließend in 1x PBS für 30 Minuten, um das Reinigungsmittel zu entfernen.
  9. 180 μL DAPI-Lösung bei 1 μg/ml in 1x PBS für 15 min hinzufügen. Die Stammlösung beträgt 10 mg/ ml inH2O. Vermeiden Sie die Herstellung von Stammlösung in PBS, die das DAPI-Färbesignal auf diffusem Chromatin in größeren Spermatozyten reduzieren kann.
  10. 3x für je 5 min waschen.
  11. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis auf einem sauberen Dia zu zeichnen.
  12. Saugen Sie hoden an und legen Sie sie auf den Schlitten. Das Vorspülen der weiten Blendenspitze mit 0,1% PBS-T verhindert, dass die Hoden an der Spitze haften. Entfernen Sie überschüssiges PBS.
  13. Fügen Sie einen Tropfen (ca. 100 μL) Citifluor AF1 hinzu.
  14. Legen Sie vorsichtig einen Glasdeckel über das Gewebe und achten Sie darauf, dass Luftblasen nicht einfangen.
  15. Versiegeln Sie den Abdeckverschluss mit klarem Nagellack auf dem Schlitten.
  16. Beobachten Sie Objektträger auf einem Mikroskop.

4. Kolokalisationsanalysen

  1. Erfassen Sie konfokale Bilder. Wir verwendeten ein Zeiss LSM 710 Konfokalmikroskop (63x Plan Apochromatic Öl) mit einer z-Auflösung von 0,5 oder 1 μm.
  2. Wählen Sie verschiedene Zellen aus unabhängigen Hoden aus.
  3. Importieren Sie Bilder in Verarbeitungssoftware (z. B. Imaris).
  4. Definieren Sie den Kern durch manuelle Segmentierung, um die benachbarten Kerne auszuschließen. Verwenden Sie die Coloc-Software; Es sammelt die Pearson-Korrelationskoeffizienten (PCCs) innerhalb des gesamten Volumens zwischen 2 Fluorophoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Das Haupthindernis für eine angemessene Färbung der Drosophila-Hoden ist die begrenzte Penetrabilität von Antikörpern, die teilweise durch die Verwendung von gequetschten Präparaten gelöst wurde, aber auf Kosten einer Einschränkung der 3D-Analysen (z. B. 3D-Darstellung oder Maß der Kolokalisierung). Das Verfahren ermöglicht eine einheitliche Kennzeichnung und bewahrt das Volumen aller Zellen des Hodens. Hier haben wir die Darstellung der Methode auf die 3D-Darstellung von S4-S5-Spermatozyten konzentriert, da diese die größten Zellen sind und somit empfindlicher auf Verformungen durch Quetschen reagieren. Wir verwendeten verschiedene nukleare Marker, darunter Nukleoporine und die Markierung der intranukleären MINT-Domäne (Mad1-containing Intra Nuclear Territory), die durch das mitotische Protein Mad112beschrieben wird. Da MINTs durch mehrere verschiedene Antikörper aufgedeckt werden konnten, haben wir sie verwendet, um die Robustheit des Protokolls für die quantitative 3D-Kolokalisierung zu testen, eine Methode, die eine korrekte räumliche Auflösung erfordert.

Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die Erfassung konfokaler Bilder von ausreichender Qualität, um dann für die 3D-Rekonstitution behandelt zu werden. Vier benachbarte serielle Abschnitte eines S5-Spermatozyten im Stadium sind in Abbildung 1Adargestellt und zeigen eine repräsentative Immunfärbung von MINT (Mad1-Immunmarkierung mit GFP-Booster in Rot) zusammen mit DAPI (in Cyan). Die Chromosomen sind in den charakteristischen 3 Hauptclustern organisiert und die MINT-Struktur wird detailliert um die DNA herum gezeigt, die eng mit den autosomalen Chromatinmassen verbunden ist, sich aber von ihnen unterscheidet. Die Auflösung erlaubt auch den Nachweis des Vorhandenseins von Mad1 an der nuklearen Peripherie sowie zwischen den autosomalen Massen der Chromosomen 2 und 3. Für die 3D-Darstellung haben wir die Imaris-Software verwendet. Die Kernoberfläche wurde durch die geringe Präsenz von Mad1 an der Kernhülle (grau) und MINT durch eine hohe Akkumulation von Mad1 im Kern (rot) zusammen mit DAPI-Färbung (blau) definiert(Abbildung 1A). Der 3D-Rekonstitutionsfilm veranschaulicht gut das Volumen und die Beziehung von Mad1 (an der Kernhülle und in der MINT) zusammen mit den Chromosomen in Den Spermatozyten der Stufen S4–S5.

Die Verteilung von Nukleoporinen wurde in diesen Zellen nur schlecht beschrieben, wahrscheinlich aufgrund der Schwierigkeit, sie in diesen großen unförmigen Kernen zu erkennen. Die Verteilung von Nup154 wurde bisher nur einmal berichtet und Nup153 und Nup98 wurden nur in der Spermatogonie und kleinen, frühen Spermatozyten untersucht17 . Die 3D-Rekonstitutionen großer S5-Spermatozyten, die durch das Nukleoporin Nup62 und durch Importin β (Produkt des Ketel-Gens) gefärbt wurden, waren durchführbar und sind in Abbildung 1C bzw. Abbildung 1Ddargestellt. Diese kernporenbesezisierten Komponenten erscheinen ungleichmäßig über den Kernrand als Punkte unregelmäßiger Größe verteilt. Beispielsweise sammelt sich der Importin-β um das autosomale Chromatin ähnlich wie dort, wo bereits ein Lamin-Netzwerk beschrieben wurde3. Diese Art der Verteilung mit porenreichen Bereichen und großen porenfreien Bereichen wurde elektronenmikroskopisch in Nagetierspermatozyten beschrieben18. Das Verständnis der Veränderungen in der Lamin- und Nukleoporinverteilung würde helfen, die Kernhüllenstruktur in diesen G2-Zellen kurz vor der männlichen Meiose zu verstehen.

Während das 3D-Volumen der Zellen erhalten bleibt, ermöglicht dieses Protokoll auch, dass Antikörper gleichmäßig in die Tiefe jeder Zelle eindringen, was quantitative Analysen wie die Kolokalisierung ermöglicht. Der Pearson-Korrelationskoeffizient (PCC) ist eine etablierte Metrik. Es kann von +1 (bedeutet perfekte positive Korrelation) bis −1 (perfekte negative Korrelation)19reichen. Um die Lokalisation von MINT-Partnerproteinen relativ zu Mad1 in Spermatozyten zu bewerten, haben wir zuvor die PCC auf einem einzelnen Abschnitt von 0,5 μm mit ImageJ in S5-Spermatozyten12 geschätzt (Abbildung 2A, B). Wir haben das Protokoll tiefer getestet, indem wir die 3D-Kolokalisierung auf den gesamten Kernen anstelle einer Oberfläche verwendet haben. Das Volumen der Kerne wurde durch manuelle Segmentierung definiert und die PCC mit dem Colocation-Tool gemessen. Wir analysierten acht S5-Spermatozytenkerne aus demselben Hoden oder verschiedenen Hoden. Abbildung 2B zeigt eine 3D-Darstellung eines Kerns, der zur Messung des PCC diente. Abbildung 2D zeigt die Messung des PCC an acht verschiedenen S5-Spermatozytenkernen aus drei verschiedenen Hoden. Die PCC-Werte unterscheiden sich nicht und variieren von 0,6 und 0,75, was auf einen hohen Wert für die Kolokalisierung hinweist. Diese sind nicht von der PCC zu unterscheiden, die auf einem einzigen Abschnitt definiert ist. Somit erlaubt das Verfahren eine reproduzierbare einheitliche Markierung und bewahrt ein gutes Volumen aller Zellen des Hodens.

Da das Protokoll eine zuverlässige Messung der Kolokalisierung von unabhängigen Hoden ermöglicht, ermöglichte es den Vergleich der Färbung verschiedener Fliegengenotypen. Dies wurde hier durch den Vergleich von WT-Fliegen und Fliegen RNAi für Mtor erschöpft (erzeugt durch Expression von dsRNA UAS-Linien und dem Bam-Gal4-Treiber, die eine erhebliche Erschöpfung in späten Spermatogonien und frühen Spermatozyten erreichen20). Wie für die Kolokalisierungsexperimente beschrieben, wurden Mtor-RNAi-erschöpfte Hoden und Wildtypen-Hoden seziert und zusammen fixiert und die konfokalen Bilder unter konstanten Einstellungen aufgenommen. Unter Berücksichtigung dieser Bedingungen wird der Vergleich einzelner Zellen möglich. Wir beobachteten, dass die MINT durch den Verlust von Mtor stärker betroffen ist als die Kernhülle, wie repräsentative Mtor RNAi-depleted (obere) und wt (untere) Zellen zeigen (Abbildung 3)12.

Figure 1
Abbildung 1: Illustration der Immunfärbung von Drosophila S4-S5 Spermatozytenkernen mit verschiedenen Sonden. (A) Bilder eines einstufigen 5-Spermatozytenkerns, immungefärbt mit α-GFP-Antikörper (GFP-Booster), der die MINT-Struktur durch Mad1-GFP (rot) zusammen mit DAPI-Färbung (blau) nachweist. Es zeigt präzise die Beziehung zwischen Mad1 und den beiden autosomalen Chromatinmassen (dargestellt als Sternchen). Mad1 wird auch schwach an der Peripherie des Kerns nachgewiesen. Alle Bilder sind serielle Z-Projektionen eines Stapels von 3 (0,5 μm) aufeinanderfolgenden konfokalen Scheiben. Konfokale Bilder wurden auf einem konfokalen Mikroskop (63x, Plan Apochromatic Oil DIC Objektiv) aufgenommen. Skalenbalken sind 5 μm. (B) Bild aus einem Film Rendering des gleichen Spermatozytenkerns. Die Kernoberfläche wurde durch eine niedrige Expression von Mad1 an der Kernhülle (in Grautönen) und MINT durch eine hohe Expression von Mad1 im Kern (in Rot) definiert. (A, B) Nachdruck mit Genehmigung der zuvor veröffentlichten Abbildung (ab12). (C) 3D-Bild eines Spermatozytenkerns der Stufe 5 mit gleichzeitiger Immunfärbung von Nup62 (gelb) und MINT (GFP-Booster in rot). Der Schuppenbalken beträgt 4 μm. (D) 3D-Bild eines Spermatozytenkerns der Stufe 5 mit gleichzeitiger Immunfärbung des Importin-β Ketel (gelb) zusammen mit DNA (DAPI in blau). Maßstabsbalken sind 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: 2D- und 3D-Kolokalisationsquantifizierung von Mad1 zusammen mit Ulp1. (A) Zusammengeführte Bilder eines Spermatozytenkerns im Stadium 5, der immungefärbt ist mit GFP-Booster-Antikörpern, die Mad1 (grün) und einen Anti-Ulp1-Antikörper (rot) nachweisen, dargestellt als 1 μm dicker Stapel eines Spermatozytenkerns. Auf der rechten Seite ist der Pearson-Intensitätskorrelationskoeffizient angegeben, der mit dem Coloc-2 ImageJ-Plugin berechnet wurde. Der PCC wurde auf 0,73 geschätzt (Nachdruck mit Genehmigung von Raich12). (B) Zusammengeführtes Bild des Spermatozytenkerns im Stadium 5 (entsprechend dem Kern G in der nebenstehenden Tabelle), immungefärbt mit GFP-Booster-Antikörpern, die Mad1 (grün) nachweisen, und mit Anti-Ulp1-Antikörpern (rot), die in einer 3D-Projektion dargestellt sind. Das Volumen des Kerns wurde durch manuelle Segmentierung definiert. Auf der rechten Seite listet die Tabelle die Pearson-Intensitätskorrelationskoeffizienten auf, die auf 8 verschiedenen Spermatozyten (A bis H) aus 3 verschiedenen Hoden (1 bis 3) berechnet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Immunfluoreszenzanalyse von Mtor RNAi-behandelten Spermatozyten im Vergleich zum Wildtyp. Zellen, die mit MtorRNAi (ID 110218) Zellen (obere Panels) und Wildtypzellen (untere Panels) erschöpft waren, wurden für Mad1-, Raf2- und Mtor-Proteine gefärbt. Die Hoden wurden fixiert und zusammen gefärbt, auf dem gleichen Dia montiert und Bilder mit den gleichen Parametern aufgenommen. Die RNAi-Zellen konnten von WT durch das Fehlen bzw. Vorhandensein von Mad1-GFP unterschieden werden. Die Abbildung ist repräsentativ für maximale Projektionen von 4 x 0,5 μm Stacks. Der Maßstabsbalken beträgt 5 μm (Nachdruck mit Genehmigung der zuvor veröffentlichten Abbildung in12). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur erfolgreichen Immunmarkierung von drosophila-Hoden bei Erwachsenen. Wie in anderen Verfahren berichtet, müssen junge Männer verwendet werden (wir haben sogar das Alter auf weniger als 20 Stunden nach der Eklosion verkürzt), um das Vorhandensein von sich entwickelnden Spermien zu minimieren, die die Spermatozyten behindern könnten. Die Dissektion sollte schnell sein und die Antikörperverdünnung muss angepasst werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis21,22,23zu optimieren. Da wir mit anderen Protokollen keine Färbung in der gesamten Tiefe des Hodens beobachteten, entwickelten wir eine Fixierungsmethode, die PFA zusammen mit NP40 und Heptan kombiniert. Wir verwenden jetzt routinemäßig 600 μL 4% Paraformaldehyd in PBS mit 30 μL von 20% NP40 plus zwei Volumen Heptan. Dies ist entscheidend, um eine ausreichende Permeabilisierung zu ermöglichen. Die Reduzierung der NP40-Menge auf 10 μL reduziert die Beschriftung sichtbar. Alle nachfolgenden Schritte wurden in Suspension durchgeführt und der überschüssige Puffer wurde entfernt, indem die Hoden durch die Schwerkraft sanft zum Boden des Rohres absteigen konnten. Für den letzten Schritt, bei dem die Proben auf einen Objektträger übertragen werden, spülen wir die Spitze in 0,1% PBS-T aus, um zu verhindern, dass die Hoden am Kegel haften. Beobachtungen zufolge funktioniert das immunhistologische Färbeprotokoll gut mit einer Vielzahl von Kernproteinen, einschließlich der hier verwendeten Marker, sowie Sonden epigenetischer Histonmodifikationen, Lamin und Nukleoporinen. Wir stellen fest, dass das Protokoll auch für Larven hoden verwendet werden kann, in diesem Fall sollte das Heptan weggelassen werden, da es die Hoden schwieriger macht, sich intakt zu erholen.

Das Protokoll wurde speziell entwickelt, um unbeschädigte Stapel der Spermatozyten für eine effiziente und einheitliche Markierung des Hodens zusammen zu halten. Wir illustrierten das Protokoll mit den großen Spermatozyten im Spätstadium, deren unförmige Kerne sie zu den am schwierigsten zu erhaltenden Zellen machen. Darüber hinaus wird in diesen Spermatozyten die Kernmarkierung oft verdünnt, wahrscheinlich aufgrund der Größe der Kerne. Zum Beispiel wird häufig beobachtet, dass die DAPI- oder Lamin-Markierung in den Zellen an der Hodenspitze stärker ist und zunehmend schwächer und dispergierterwird,wenn die Spermatozytenwachsen 3,24. Dies könnte auch einer der Gründe dafür sein, dass die Verteilung von Nukleoporinen nur in Zellen im Frühstadium (Spermatogonie und frühe Spermatozyten) beschrieben wurde17.

Ausgezeichnete Bilder der Immunfärbung von Drosophila S5-Spermatozyten wurden veröffentlicht, insbesondere für die hodenspezifischen t-BRD- und Dany-Proteine25,26 unter Verwendung von entweder 0,3% Natriumdesoxycholat-Protokoll oder nach Zerquetschen des Gewebes21,22. In unseren Händen führen Kürbisse zu einer signifikanten Ungleichmäßigkeit der Färbung in den Tiefen des Organs und opfern auch die 3D-Struktur. Selbst wenn die Verwendung von 0,3% Natriumdeoxycholat bessere Ergebnisse lieferte, beobachteten wir immer noch eine Ungleichmäßigkeit. Daher bevorzugen wir NP40 wegen seiner Reproduzierbarkeit und Qualität der Etikettierung. Die konfokalen Bilder erlauben die Rekonstruktion von 3D-Bildern für Kernproteine. Zum Beispiel haben wir diese Methode erfolgreich mit vielen verschiedenen Sonden angewendet, die hier durch die intranukleäre MINT-Domäne veranschaulicht werden, die eng mit den autosomalen Chromatinmassen und dem Kernporennetzwerk verbunden ist. Die faszinierende 3D-Verteilung der Kernporen dieser Spermatozytenkerne steht nun für weitere Studien zur Verfügung. Die Bilder erlauben eine reproduzierbare Quantifizierung der Kolokalisation aus verschiedenen Spermatozyten desselben Hodens und aus verschiedenen Hoden. Unseres Wissens ist dies das erste Mal, dass an solchen Proben eine genaue Quantifizierung durch den Pearson-Korrelationskoeffizienten gemessen wurde. Es gibt die Sicherheit, die für einen genauen Vergleich der immunmarkierten Proteinspiegel verschiedener Hoden erforderlich ist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Wir danken P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura für Antikörper und A. Debec, den Lagerzentren Bloomington und Vienna für Fliegen. Danke an C. Jackson für Anregungen und anregende Diskussionen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi  VDRC ID 110218 Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI  Thermo D1306 Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps  Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips Fisherbrand 11917744 Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube Thermo AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes  Sigma T3531-200EA  Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1 Citifluor AF1
Dakopen  Sigma Z377821-1EA 
Normal Goat Serum (NGS) Sigma NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4% Sigma P6148-500G  Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml 
PBS 1X Thermo 14190094 DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T  PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,  Sigma T8787
Antibodies
GFP booster Chromotek gba488 1/200
Mouse anti-Mtor 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series  Thermo 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
  2. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
  3. Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).
  4. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
  5. Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
  6. Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
  7. White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
  8. Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).
  9. Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
  10. Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
  11. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  12. Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
  13. Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
  14. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  15. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).
  16. Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
  17. Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
  18. Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
  19. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  20. White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
  21. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
  22. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
  23. White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
  24. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
  25. Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
  26. Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).

Tags

Biologie Heft 162 Drosophila Melanogaster Hoden Spermatozyten Immunfluoreszenz Konfokale Mikroskopie Bild 3D Kolokalisierung Nukleoporin Kernterritorium Kernporenkomplex
Immunfärbung von <em>Drosophila-Hoden</em> für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raich, N., Contremoulins, V.,… More

Raich, N., Contremoulins, V., Karess, R. E. Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes. J. Vis. Exp. (162), e61061, doi:10.3791/61061 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter