Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

Published: August 27, 2020 doi: 10.3791/61061
Automatic Translation
1, 1, 1
1CNRS, Institut Jacques Monod, Université de Paris, F 75006, Paris, France

Summary

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

Abstract

אשכי דרוזופילה הם מערכת מודל רבת עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים כולל ביולוגיה של תאי גזע, ארכיטקטורה גרעינית, מיוזיס והתפתחות זרע. עם זאת, immunolabeling של האשכים Drosophila כולו קשורה לעתים קרובות עם אי אחידות משמעותית של כתמים עקב חדירת נוגדנים. ההכנות מעוכות רק חלקית להתגבר על הבעיה שכן הוא מקטין את איכות 3D של הניתוחים. בזאת, אנו מתארים פרוטוקול הרכבה שלם באמצעות NP40 והפטן במהלך הקיבעון יחד עם immunolabeling במדיה נוזלית. הוא משמר את עוצמת הקול המתאימה למיקרוסקופיה קונפוקלית יחד עם תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו מראים דוגמאות שונות של שחזור תלת מימדי של גרעיני זרע מחלקים קונפוקליים. השחזור התוך-אשכים והבין-אשכים מאפשר כימות תלת-ממדי והשוואה של פלואורסצנטיות בין תאים בודדים מגנוטיפים שונים. השתמשנו ברכיבים שונים של מבנה MINT תוך-גרעיני (הטריטוריה הגרעינית התוך-גרעינית המכילה Mad1) כמו גם בשני רכיבים הקשורים למתחם הנקבוביות הגרעיניות כדי להמחיש פרוטוקול זה ויישומים שלו על התאים הגדולים ביותר של האשכים, הזרעונים S4-S5.

Introduction

אשכי דרוזופילה הם מודל בעל ערך לחקר האדריכלות הגרעינית. בתאי זרע מיטוטיים, הנפח הגרעיני תפוס במידה רבה על ידי כרומטין. תאים אלה עוברים ארבעה סבבים של חלוקה, לייצר ציסטה של 16 זרעונים ראשוניים. במהלך הימים הבאים, spermatocytes לעבור 6 שלבים התפתחותיים (S1-S6), גדל מאוד בנפח, בקירוב 20-פי1,2. הם גם משנים את המורפולוגיה הגרעינית שלהם. קווי המתאר של הגרעין, המתגלה על ידי למין Dm0, הופך לא סדיר ומראה invaginations עמוק1,3. זה מלווה בשינויים ושינויים נרחבים בביטוי גנים בארגון כרומטין1,4,5,6,7. הכרומוזומים הבין-פאזיים מוגדרים היטב בשלב S4-S5, ויוצרים שלוש מסות נפרדות המתאימות ל-2 האוטוסומים הדו-כיווניים העיקריים ולזוג ה-X-Y המעוגן בגרעין.

Mad1 היה מבודד במקור כמרכיב מרכזי במחסום המיטוטי (נבדק בשנת8). ב interphase, הוא מתואר כממוקם בעיקר על המעטפה הגרעינית, אלא גם בגרעין9,10,11. במבחן דרוזופילה, דיווחנו כי Mad1 בולט בגרעין, הקשור באופן אינטימי עם שתי מסות כרומטין אוטוזומליות גדולות ובמידה פחותה עם כרומטין XY. הגדרנו מבנה זה הקשור לכרומטין כ- MINT (טריטוריה תוך-גרעינית המכילה Mad1)12. ארבעה חלבונים אחרים היו קשורים MINTs ב spermatocytes: הגרעין Mtor / Tpr, פפטידאז SUMO Ulp1, חלבון מחסום מיטוטי Mad2 ו subunit של קומפלקס דמוי פוליקומב Raf212.

כדי להשלים את התיאור של MINTs, היינו צריכים להשתמש בנוגדנים והתמודדנו עם הבעיות הטכניות שנתקלו בדרך כלל עם immunostaining ב testis: חדירות ירודה וכתוצאה מכך אי אחידות משמעותית של כתמים בעומק האשכים, במיוחד בזרעונים הגדולים. ההכנות המודלגות הגבירו את הגישה לנוגדנים אך הובילו לתמונות דחוסות, הגבילו את הניתוחים התלת-ממדיים ומניעת מדידה של פלואורסצנטיות כמותית, כולל קולוקליזציה. הבעיה של חדירת נוגדנים יכולה להיות מטופלת גם על ידי סוכנים מחלחלים כגון 0.3% Na deoxycholate13, אבל הליך זה לא בידיים שלנו להניב תוצאות לשחזור. מכיוון שביצענו ניסויים רבים בתיוג משותף, חיפשנו לשפר את פרוטוקול ההחלחלה. השילוב של 1% NP40 בתוספת הפטאן הביא לשחזור רב יותר, במיוחד בחקר הזרעונים הגדולים.

פרוטוקול זה מבצע קיבעון ו immunostaining של האשכים בהשעיה, שיפור איכות המדגם, כמו גם שיפור הרבייה, ועיבוד זה מתאים מיקרוסקופיה confocal. השתמשנו בפרוטוקול כדי להגדיר טוב יותר את היחסים המרחביים של חלבוני מעטפה גרעינית מסוימים עם המבנים הגרעיניים של זרעונים גדולים. שיטה זו תאפשר חקירות טובות יותר של השינויים המלווים את התפתחות הזרע, למשל השינויים המבניים הדינמיים של הגרעין כולל כרומטין, גרעין והנקבוביות הגרעיניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אוסף האשכים של דרוזופילה

הערה: זכרים צעירים (0-15 שעות לאחר eclosion) נחוצים לבדיקת תאי נבט דיפלואיד (כלומר, זרעונים וזרע).

  1. בחר זבובים צעירים ככל האפשר כדי למזער את ההפרעה מפיתוח spermatids.
  2. הרדמה זבובים על ידי חשיפה קצרה פחמן דו חמצני ולהעביר כרית זבוב14,15.
  3. תחת מיקרוסקופ מנתח (הגדלה 10x), השתמש במלקחיים כדי להסיר את הראש.
  4. העבר 5 עד 10 זבובים ערופים ל 100 μL של חיץ של רינגר (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 מ"מ EDTA, מעכב חלבון מלא, pH 6.8) על שקופית זכוכית מצופה סיליקון על תמיכה ברקע שחור.
  5. עם ניתוח מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40, השתמש בזוג אחד של מלקחיים מספר 5 כדי להחזיק זבוב בין בית החזה לבטן, ועם מלקחיים אחרים, משוך את הבטן מבית החזה. לבודד במהירות את האשכים ואת הרקמות הסמוכות מן פגר זבוב15 ומניחים טיפה חדשה של חיץ של רינגר על אותה שקופית.
  6. לאחר כל האשכים מוכנים, לנקות את האשכים מן הרקמות הנותרות (בלוטת עזר ואברי מין חיצוניים).
  7. הסר מאגר עודף מהשחרור המכיל את האשכים המנותחים. בדרך כלל, השתמש פיפטה p200 עם קצה μL 10 מצויד על גבי קצה 200 μL. זה מאפשר הסרת עודף נוזלי דרך צמצם קטן. מניחים טיפה של 4% תיקון paraformaldehyde על גבי טיפה המכילה את האשכים מנותח, ולאחר מכן להעביר במהירות את האשכים לצינור המכיל פתרון קיבוע טרי.

2. קיבעון פרפורמלדהיד

  1. הכן 2 מ"ל של פתרון קיבוע ממש לפני השימוש: 600 μL של 4% paraformaldehyde מדולל מלוחים אגירה פוספט (PBS) עם 30 μL של NP40 20% בתוספת 1200 μL של heptane בצינור מיקרוצנטריפוגה סיליקון 2 mL. השתמש 4% paraformaldehyde ב PBS מוכן 600 μL aliquots ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    זהירות: הפטן ופרפורמלדהיד רעילים ויש לטפל בהם במכסה המנוע. יש להשליך אותם בהתאם לתקנות המכון המארח.
  2. העבר את האשכים באמצעות מיקרופיפט p200 עם קצה צמצם רחב לפתרון PFA / NP40 / heptane. לנער את הצינור למעלה ולמטה במשך 30 s ביד. ממשיכים לתקן את האשכים על מערבל סיבובי בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
  3. עצרו את המיקסר הסיבובי והניחו את הצינור בארון תקשורת צינורי כדי לאפשר הפרדת פאזה ואת האשכים להתיישב לתחתית הצינור.
  4. הסר את כל heptane ואת הפתרון התיקון ולשטוף את האשכים במהירות שלוש פעמים עם 1x PBS.
  5. העבר לצינור בודד נקי של 200 μL. בצע את כל הדגירות בצינורות קטנים אלה כדי למזער את כמויות הנוגדנים המועסקים.
  6. הסר מאגר עודף באמצעות מיקרופיפט 200 μL עם P200 וגם קצה P10 מצורף. היזהר לא לשאוף אשכים.
  7. יש לשמור את האשכים ב-1x PBS על הקרח עד שכל הדגימות יהיו מוכנות.

3. כתמי נוגדנים בתמיסה

  1. להשליך את PBS ולהשאיר אשכים ב 0.3% PBS-T במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל קרום התא.
  2. טרום דגירה באותו חיץ בתוספת 5% סרום עיזים רגיל (NGS) במשך 1 שעות.
  3. הוסף 200 μL של הנוגדן העיקרי מדולל ב 0.3% PBS-T בתוספת 5% NGS(שולחן החומרים).
  4. דגירה הנוגדן העיקרי לילה ב 4 °C (או טמפרטורת החדר) עם תסיסה עדינה על נדנדה.
  5. לשטוף 3 פעמים ב 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. אפשר האשכים להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה.
  6. הוסף 200 μL של נוגדן משני מדולל 1:500 מהסדרה מצומד DyLight.
  7. דגירה הנוגדן המשני בתא כהה במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
  8. לשטוף 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזרו על הפעולה עם 0.2% PBS-T ו-0.1% PBS-T, בכל פעם למשך 30 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. בצע שטיפה סופית ב 1x PBS במשך 30 דקות כדי להסיר את חומר הניקוי.
  9. הוסף 180 μL של פתרון DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS במשך 15 דקות. פתרון המניה הוא 10 מ"ג / מ"ל ב H2O. הימנעו מפתרון מלאי ב- PBS, אשר יכול להפחית את אות הכתמת DAPI על כרומטין מפוזר בזרע גדול יותר.
  10. לשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד.
  11. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על שקופית נקייה.
  12. שאפתן אשכים ולשים אותם על השקופית. שטיפת קצה הצמצם הרחב ב-0.1% PBS-T מונעת מה האשכים להידבק לקצה. הסר PBS עודף.
  13. הוסף טיפה (כ 100 μL) של Citifluor AF1.
  14. מניחים בעדינות כיסוי זכוכית על הרקמה, מקפידים להימנע מלכידה של בועות אוויר.
  15. לאטום את הכיסוי לשקופית באמצעות לק ברור.
  16. שים לב לשקופיות במיקרוסקופ.

4. ניתוחי קולוקליזציה

  1. השג תמונות קונפוקל. השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקל Zeiss LSM 710 (63x Plan שמן אפוכרומטי) ברזולוציית z של 0.5 או 1 מיקרומטר.
  2. בחר תאים שונים מתוך אשכים עצמאיים.
  3. יבא תמונות לתוכנת עיבוד (למשל, Imaris).
  4. הגדר את הגרעין לפי פילוח ידני כדי לא לכלול את הגרעינים השכנים. השתמש בתוכנת קולוק; הוא אוסף את מקדמי המתאם (PCCs) של פירסון בתוך כל אמצעי האחסון בין 2 פלואורופורים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המכשול העיקרי להשגת כתמים נאותים של אשכי Drosophila הוא חדירה מוגבלת של נוגדנים, אשר נפתרה חלקית באמצעות הכנות מעוכות אבל במחיר של גרימת הגבלה של ניתוחים 3D (למשל ייצוג 3D או מידה של colocalization). הנוהל מאפשר תיוג אחיד ומשמר את נפח כל תאי האשכים. כאן מיקדנו את האיור של השיטה על ייצוג 3D של זרע S4-S5, כפי שהם התאים הגדולים ביותר ולכן רגישים יותר עיוות מן הסקווש. השתמשנו בסמנים גרעיניים שונים, כולל נוקלאופורינים ותיוג תחום MINT תוך-גרעיני (הטריטוריה הגרעינית התוך-גרעינית המכילה Mad1) המתואר על ידי החלבון המיטוטי Mad112. כמו MINTs יכול להתגלות על ידי מספר נוגדנים שונים, השתמשנו בהם כדי לבדוק את החוסן של הפרוטוקול עבור colocalization 3D כמותי, שיטה המחייבת רזולוציה מרחבית נכונה.

הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר רכישה של תמונות confocal באיכות מספקת כדי להיות מטופלים לאחר מכן עבור שחזור 3D. באיור 1Aמתוארים ארבעה קטעים סדרתיים סמוכים של שלב S5, המציגים חיסון מייצג של MINT (אימונולאבלינג Mad1 באמצעות מאיץ GFP באדום) יחד עם DAPI (בציאן). הכרומוזומים מאורגנים ב-3 הצבירים השונים העיקריים ומבנה MINT מוצג בפירוט רב סביב הדנ"א, הקשור באופן אינטימי לגושי הכרומטין האוטוסומליים. ההחלטה מאפשרת גם גילוי נוכחות של Mad1 בפריפריה הגרעינית, כמו גם בין מסות אוטוזומליות של כרומוזומים 2 ו -3. השתמשנו בתוכנת אימריס לייצוג תלת מימדי. המשטח הגרעיני הוגדר על ידי נוכחות ברמה נמוכה של Mad1 במעטפה הגרעינית (באפור) ו- MINT הוגדר על ידי הצטברות ברמה גבוהה של Mad1 בתוך הגרעין (באדום) יחד עם כתמי DAPI (בכחול)(איור 1A). סרט ההשבה התלת מימדית ממחיש היטב את עוצמת הקול ואת מערכת היחסים של Mad1 (במעטפת הגרעינית ובמטבעה) יחד עם הכרומוזומים בשלב S4-S5 זרעונים.

התפלגות הגרעינים תוארה רק בצורה גרועה בתאים אלה, ככל הנראה בשל הקושי לזהות אותם בגרעיני מעוותים גדולים אלה. ההתפלגות של Nup154 דווחה רק פעם אחת בעבר16 ו Nup153 ו Nup98 נחקרו רק זרעונים קטנים, זרע מוקדם17. שחזורים תלת-ממדיים של זרעונים S5 גדולים מוכתמים על ידי nucleoporin Nup62 ועל ידי יבוא β (תוצר של הגן ketel) היו ריאליים מיוצגים באיור 1C ואיור 1D, בהתאמה. רכיבים גרעיניים אלה הקשורים לנקבוביות מופיעים באופן לא אחיד מפוזרים על שפת הגרעין כנקודות בגודל לא סדיר. לדוגמה, β היבוא מתכנס סביב הכרומטין האוטוסומלי בדומה למקום שבו רשת למין כבר תוארה3. סוג זה של הפצה עם אזורים עשירים בנקבוביות ואזורים גדולים ללא נקבוביות תואר על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים בזרע מכרסמים18. הבנת השינויים בחלוקת למין וגרעיני הגרעין תסייע להבין את מבנה המעטפה הגרעינית בתאי G2 אלה ממש לפני מיוזיס זכר.

תוך שמירה על נפח 3D של התאים פרוטוקול זה גם מאפשר נוגדנים לחדור באופן אחיד לתוך העומק של כל תא, המאפשר ניתוח כמותי כגון קולוקליזציה. מקדם המתאם פירסון (PCC) הוא מדד מבוסס היטב. זה יכול לנוע בין +1 (המציין מתאם חיובי מושלם) ל -1 (מתאם שלילי מושלם)19. כדי להעריך את לוקליזציה של חלבונים שותפים MINT יחסית Mad1 ב spermatocytes, הערכנו בעבר את PCC על קטע אחד של 0.5 מיקרומטר באמצעות ImageJ ב S5זרעונים 12 (איור 2A,B). בדקנו את הפרוטוקול לעומק על ידי שימוש בקולוקליזציה תלת-ממדית על כל הגרעינים במקום רק על משטח. נפח הגרעינים הוגדר על ידי פילוח ידני וה- PCC נמדד באמצעות כלי הקולוקציה. ניתחנו שמונה גרעיני זרע S5, מאותם אשכים או אשכים שונים. איור 2B מציג ייצוג תלת-ממדי של גרעין ששימש למדידת ה-PCC. איור 2D מציג את המדידה של ה-PCC בשמונה גרעיני זרע S5 שונים משלושה אשכים שונים. ערכי PCC אינם שונים, משתנים בין 0.6 ו- 0.75, המציין ערך גבוה עבור colocalization. אלה אינם ניתנים להבחנה מה- PCC המוגדר במקטע יחיד. לפיכך, ההליך מאפשר תיוג אחיד לשחזור ושומר על נפח טוב של כל תאי האשכים.

מכיוון שהפרוטוקול מאפשר מדידה אמינה של קולוקליזציה מניסויים עצמאיים, הוא התיר השוואה של כתמים מגנוטיבים שונים של זבובים. זה הומחש כאן על ידי השוואה של זבובים זבובים WT וזבובים RNAi מדולדל עבור Mtor (נוצר על ידי ביטוי של קווי DSRNA UAS ואת הנהג באם-Gal4 להשיג דלדול משמעותי זרע מאוחר spermatogonia ו spermatocytes מוקדם20). כפי שתואר בניסויי קולוקליזציה, אשכים מרוקנים Mtor-RNAi ואשכים מסוגי בר נותחו ותוקנו יחד והתמונות הקונפוקל נרכשו תחת הגדרות קבועות. כיבוד תנאים אלה, ההשוואה של תאים בודדים הופכת לאפשרית. ראינו כי MINT מושפע יותר מאשר המעטפה הגרעינית על ידי אובדן Mtor כפי שמוצג על ידי נציג Mtor RNAi מדולדל (העליון) ו wt (התחתון) תאים (איור 3)12.

Figure 1
איור 1: איור של חיסון גרעיני זרע S4-S5 של דרוזופילה באמצעות בדיקות שונות. (A) תמונות של גרעין זרע שלב יחיד 5 immunostained עם נוגדן α-GFP (GFP המאיץ) גילוי מבנה MINT על ידי Mad1-GFP (אדום) יחד כדי כתמי DAPI (כחול). זה מראה בדיוק את היחסים בין Mad1 לבין שני מסות כרומטין אוטוזומלי (מיוצג כ כוכביות). Mad1 מזוהה גם במעט בפריפריה של הגרעין. כל התמונות הן הקרנות Z טוריות של ערימה של 3 (0.5 מיקרומטר) פרוסות קונפוקל רצופות. תמונות קונפוקל נרכשו על מיקרוסקופ confocal (63x, תוכנית שמן אפוכרומטי DIC עדשה אובייקטיבית). סרגלי קנה המידה הם 5 מיקרומטר. (B) מסגרת מתוך עיבוד סרט של אותו גרעין זרע. המשטח הגרעיני הוגדר על ידי ביטוי נמוך של Mad1 במעטפה הגרעינית (באפורים) ו MINT הוגדר על ידי ביטוי גבוה של Mad1 בתוך הגרעין (באדום). (A, B) הודפס מחדש באישור מאיור שפורסם בעבר (מ-12). (C)תמונה תלת-ממדית של גרעין זרע שלב 5 עם חיסון בו זמנית של Nup62 (צהוב) ו- MINT (זריקת GFP באדום). סרגל קנה המידה הוא 4 מיקרומטר.(D)3D תמונה של גרעין זרע שלב 5 עם immunostaining בו זמנית של יבואן-β קטל (צהוב) יחד עם DNA (DAPI בכחול). סרגלי קנה המידה הם 5 מיקרומטר.

Figure 2
איור 2: כימות קולוקליזציה דו-ממדי ותלת-ממדי של Mad1 יחד עם Ulp1. (A) תמונות ממוזגות של גרעין זרע שלב 5 immunostained עם נוגדן המאיץ GFP גילוי Mad1 (ירוק) ועם נוגדן אנטי Ulp1 (אדום) מיוצג כערימה עבה 1 מיקרומטר של גרעין זרע. בצד ימין מצוין מקדם מתאם עוצמת פירסון מחושב באמצעות תוסף Coloc-2 ImageJ. ה-PCC הוערך ב-0.73 (הודפס מחדש באישור רייך12). (B) תמונה ממוזגת של גרעין זרע שלב 5 (המקביל לגרעין G בטבלה הסמוכה) immunostained עם נוגדן המאיץ GFP גילוי Mad1 (ירוק) ועם נוגדן אנטי Ulp1 (אדום) מיוצג בהקרנה 3D. נפח הגרעין הוגדר על ידי פילוח ידני. מימין, הטבלה מפרטת את מקדמי המתאם בעוצמת פירסון המחושבים על 8 זרעונים שונים (A עד H) מ-3 אשכים שונים (1 עד 3). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח כשל חיסוני של זרעונים שטופלו ב-Mtor RNAi בהשוואה לסוג הבר. תאים מרוקנים של Mtor באמצעות MtorRNAi (מזהה 110218) תאים (לוחות עליונים) ותאי סוג בר (לוחות נמוכים) היו מוכתמים עבור חלבוני Mad1, Raf2 ו Mtor. האשכים היו קבועים ומוכתמים יחד, רכובים על אותה שקופית ותמונות שנרכשו באותם פרמטרים. ניתן להבחין בין תאי RNAi לבין WT על ידי היעדרות או נוכחות בהתאמה של Mad1-GFP. האיור מייצג תחזיות מרביות של 4 x 0.5 μm ערימות. סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר (הודפס מחדש עם הרשאה מאיור שפורסם בעברב- 12). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה לאימונולאבלינג מוצלח של אשכי דרוזופילה בוגרים בכל ההר. כפי שדווח בהליכים אחרים יש להשתמש בזכרים צעירים (אפילו קיצרנו את הגיל לפחות מ -20 שעות לאחר eclosion) כדי למזער את נוכחותם של זרע מתפתח, אשר מסתכן בשיבוש הזרע. הניתוח צריך להיות מהיר ואת דילול הנוגדן חייב להיות מותאם כדי לייעל את יחס אות לרעש21,22,23. מכיוון ששימוש בפרוטוקולים אחרים, לא ראינו כתמים לאורך כל עומק האשכים, פיתחנו שיטת קיבוע המשלבת PFA יחד עם NP40 והפטן. עכשיו אנחנו משתמשים באופן שגרתי 600 μL של 4% paraformaldehyde ב PBS עם 30 μL של 20% NP40 ועוד שני כרכים של heptane. זה קריטי כדי לאפשר חדירה מספקת. הפחתת כמות NP40 עד 10 μL מפחיתה באופן ניכר את התיוג. כל השלבים הבאים בוצעו בהשעיה והחוצץ העודף הוסר על ידי מתן אפשרות לאשכים לרדת בעדינות לתחתית הצינור בכוח הכבידה. עבור השלב האחרון בהעברת דגימות לשקופית, אנו שוטפים את הקצה ב- 0.1% PBS-T כדי למנוע מה האשכים להידבק לקונוס. על פי תצפיות, פרוטוקול הכתם האימונוהיסטולוגי עובד היטב עם מגוון חלבונים גרעיניים, כולל הסמנים המשמשים כאן, כמו גם בדיקות של שינויים היפונטים אפיגנטיים, למין וגרעינים. נציין כי הפרוטוקול יכול לשמש גם עבור אשכי זחל, ובמקרה זה heptane צריך להיות מושמט, כפי שהוא עושה את האשכים קשה יותר להתאושש ללא פגע.

הפרוטוקול תוכנן במיוחד כדי לשמור על ערימות ניזוק של spermatocytes יחד עבור תיוג יעיל ואחיד של האשכים. הדגמנו את הפרוטוקול עם הזרעונים הגדולים בשלב מאוחר, שגרעינים המעוותים הופכים אותם בין התאים הקשים ביותר לשימור. יתר על כן, ב spermatocytes אלה תיוג גרעיני לעתים קרובות הופך לדלל כנראה בגלל הגודל של הגרעינים. לדוגמה, הוא ציין בדרך כלל כי DAPI או למין תיוג חזק יותר בתאים בשיא האשכים הופך בהדרגה חלש יותר ויותר לפזר כמו spermatocytes גדלים3,24. זה גם יכול להיות אחת הסיבות כי התפלגות של נוקליאופורינים תוארה רק בתאי שלב מוקדם יותר (זרע ו spermatocytes מוקדם)17.

תמונות מצוינות של immunostaining של זרע S5 Drosophila פורסמו, במיוחד עבור t-BRD ספציפי לאשכים וחלבונים דני25,26 באמצעות פרוטוקול נתרן deoxycholate 0.3% או בעקבות מעוך של הרקמה21,22. בידינו, סקווש מוביל לאי אחידות משמעותית של כתמים במעמקי האיבר וגם להקריב את המבנה 3D. גם אם השימוש של 0.3% נתרן deoxycholate נתן תוצאות טובות יותר, עדיין ראינו אי אחידות. לכן, אנו מעדיפים NP40 עבור הרבייה שלה ואיכות התיוג. התמונות confocal לאפשר שחזור של תמונות 3D עבור חלבונים גרעיניים. לדוגמה, יישמנו בהצלחה שיטה זו באמצעות בדיקות רבות ושונות, מאויר כאן על ידי תחום MINT תוך גרעיני, הקשורים קשר הדוק עם מסות כרומטין אוטוזומלי ורשת הנקבוביות הגרעינית. הפצה תלת מימדית מסקרנת של נקבוביות גרעיניות של גרעיני זרע אלה זמינה כעת למחקרים נוספים. התמונות מאפשרות כימות לשחזור של קולוקליזציה מזרעונים שונים מאותם אשכים ומאשכים שונים. למיטב ידיעתנו זו הפעם הראשונה שכימות מדויק על ידי מקדם המתאם פירסון נמדד על דגימות כאלה. זה נותן את הביטחון הנדרש עבור השוואת רמות חלבון immunolabelled מדויק של אשכים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לפ. וריג'ייזר, ג'יי יוהנסן ה., אוקהורה על נוגדנים וא. דבק, מרכזי המניות של בלומינגטון וינה לזבובים. תודה לסי ג'קסון על הצעות ודיונים מעוררים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.
Mtor RNAi  VDRC ID 110218 Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI  Thermo D1306 Stock solution must be prepared in H2O
Dumont # 5 Fine Forseps  Fine Science Tools
MBP Wide Bore Pipette Tips Fisherbrand 11917744 Wide aperture tip
Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube Thermo AB-0620
2 ml micro centrifuge tubes  Sigma T3531-200EA  Siliconized 2ml tube
Citifluor AF1 Citifluor AF1
Dakopen  Sigma Z377821-1EA 
Normal Goat Serum (NGS) Sigma NS02L-1ML
Paraformaldehyde 4% Sigma P6148-500G  Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml 
PBS 1X Thermo 14190094 DPBS, no calcium, no magnesium
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T  PBS 1X  containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100
Triton X-100, for molecular biology,  Sigma T8787
Antibodies
GFP booster Chromotek gba488 1/200
Mouse anti-Mtor 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup62 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
Rabbit anti-Raf2 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam
DyLight conjugated series  Thermo 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,  rabbit or rat) as second antibodies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
  2. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
  3. Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).
  4. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
  5. Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
  6. Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
  7. White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
  8. Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).
  9. Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
  10. Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
  11. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  12. Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
  13. Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
  14. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  15. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).
  16. Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
  17. Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
  18. Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
  19. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  20. White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
  21. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
  22. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
  23. White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
  24. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
  25. Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
  26. Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 162 דרוזופילה מלנוגאסטר אשכים זרעונים אימונופלואורסצנטיות מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונה תלת-ממדית קולוקליזציה נוקלאופורין טריטוריה גרעינית קומפלקס נקבוביות גרעיניות
חיסון של אשכי <em>דרוזופילה</em> הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raich, N., Contremoulins, V.,… More

Raich, N., Contremoulins, V., Karess, R. E. Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes. J. Vis. Exp. (162), e61061, doi:10.3791/61061 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter