Summary
Presentiamo qui un protocollo migliorato per la preparazione a montaggio intero e l'immunostaining dei tester Drosophila, adatto per la microscopia confocale e che consente anche un'etichettatura riproducibile e affidabile. Illustriamo questo protocollo attraverso la rappresentazione 3D e la quantificazione degli esperimenti di colocalizzazione sui grandi spermatociti S4-S5.
Abstract
I test di Drosophila sono un potente sistema modello per lo studio dei processi biologici tra cui la biologia delle cellule staminali, l'architettura nucleare, la meiosi e lo sviluppo dello sperma. Tuttavia, l'immunoetichettatura dell'intero testicolo drosophila è spesso associata a una significativa non uniformità di colorazione dovuta alla penetrazione degli anticorpi. I preparati schiacciati superano solo parzialmente il problema poiché diminuisce la qualità 3D delle analisi. Qui, descriviamo un protocollo a montaggio intero usando NP40 ed eptano durante la fissazione insieme all'immunoetichettatura nei mezzi liquidi. Preserva il volume adatto alla microscopia confocale insieme a etichette riproducibili e affidabili. Mostriamo diversi esempi di ricostituzione 3D dei nuclei di spermatociti da sezioni confocali. La riproducibilità intra- e inter-testes consente la quantificazione 3D e il confronto della fluorescenza tra singole cellule di diversi genotipi. Abbiamo utilizzato diversi componenti della struttura MINT intranucleare (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) e due componenti associati al complesso dei pori nucleari per illustrare questo protocollo e le sue applicazioni sulle più grandi cellule del testicolo, gli spermatociti S4-S5.
Introduction
I test di Drosophila sono un modello prezioso per lo studio dell'architettura nucleare. Nelle cellule spermatogoniche mitotiche, il volume nucleare è in gran parte occupato dalla cromatina. Queste cellule subiscono quattro cicli di divisione, producendo una cisti di 16 spermatociti primari. Nei giorni successivi, gli spermatociti passano attraverso 6 stadi di sviluppo (S1-S6), aumentando notevolmente di volume, approssimativamente 20 volte1,2. Cambiano anche la loro morfologia nucleare. Il contorno del nucleo, rivelato dal lamina Dm0, diventa irregolare e mostra profonde invaginazioni1,3. Questo è accompagnato da ampi cambiamenti di espressione genica e modifiche nell'organizzazione della cromatina1,4,5,6,7. I cromosomi interfase sono ben definiti nello stadio S4-S5, formando tre masse distinte corrispondenti ai 2 principali autosomi bivalenti e alla coppia X-Y agganciata al nucleolo.
Mad1 è stato originariamente isolato come componente chiave del checkpoint mitotico (esaminato in8). Nell'interfase, è descritto come situato principalmente all'involucro nucleare ma anche nel nucleoplasma9,10,11. In Drosophila testis, abbiamo riferito che Mad1 è prominente nel nucleoplasma, intimamente associato alle due principali masse di cromatina autosomica e in misura minore alla cromatina XY. Abbiamo definito questa struttura associata alla cromatina come MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Altre quattro proteine erano associate ai TT negli spermatociti: la nucleoporina Mtor/Tpr, la peptidasi Ulp1 suMO, la proteina del checkpoint mitotico Mad2 e una subunità di un complesso simile a Policomb Raf212.
Per completare la descrizione dei MINT, dovevamo usare gli anticorpi e ci siamo trovati di fronte ai problemi tecnici generalmente incontrati con l'immunostaining nel testicolo: una scarsa permeabilità con conseguente significativa non uniformità di colorazione nella profondità del testicolo, in particolare nei grandi spermatociti. Ipreparati s annullati aumentavano l'accesso agli anticorpi ma portavano a immagini compresse, limitando le analisi 3D e impedendo la misurazione della fluorescenza quantitativa, compresa la colocalizzazione. Il problema della penetrazione degli anticorpi potrebbe anche essere affrontato da agenti permeabilizzanti come lo 0,3% di Na deossicholato13, ma questa procedura non ha prodotto nelle nostre mani risultati riproducibili. Poiché abbiamo eseguito molti esperimenti di co-etichettatura, abbiamo cercato di migliorare il protocollo di permeabilizzazione. La combinazione di 1% NP40 più eptano ha portato a una maggiore riproducibilità, in particolare nello studio dei grandi spermatociti.
Questo protocollo esegue la fissazione e l'immunosocienza dei test in sospensione, migliorando la qualità del campione e migliorando la riproducibilità e rendendolo adatto per la microscopia confocale. Abbiamo usato il protocollo per definire meglio le relazioni spaziali di alcune proteine dell'involucro nucleare con le strutture nucleoplasmatiche dei grandi spermatociti. Questo metodo consentirà di esaminare meglio i cambiamenti che accompagnano lo sviluppo degli spermatociti, ad esempio i cambiamenti strutturali dinamici del nucleo, tra cui cromatina, nucleoplasma e pori nucleari.
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Protocol
1. Raccolta testes Drosophila
NOTA: I giovani maschi (0-15 ore dopo l'eclosion) sono necessari per esaminare le cellule germinali diploidi (ad esempio spermatogonia e spermatociti).
- Seleziona le mosche giovani il più possibile per ridurre al minimo le interferenze derivanti dallo sviluppo di spermatidi.
- Anestetizza le mosche con una breve esposizione all'anidride carbonica e si trasferisce su un fly pad14,15.
- Al microscopio sezionato (ingrandimento 10x), utilizzare le flessione per rimuovere la testa.
- Trasferire da 5 a 10 mosche decapitate a 100 μL del tampone di Ringer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, inibitore proteico completo, pH 6,8) su uno scivolo di vetro rivestito di silicone su un supporto di sfondo nero.
- Con il microscopio sezionato con un ingrandimento di 40x, utilizzare un paio di forcep numero 5 per tenere una mosca tra il torace e l'addome e, con altre forcep, allontanare l'addome dal torace. Isolare rapidamente i tester e i tessuti adiacenti dalla carcassadi mosca 15 e posizionare in una nuova goccia del buffer di Ringer sullo stesso scivolo.
- Una volta che tutti i teste sono pronti, pulire i teste dai tessuti rimanenti (ghiandola accessoria e genitali esterni).
- Rimuovere il buffer in eccesso dalla goccia contenente i teste sezionati. In genere, utilizzare una pipetta p200 con una punta da 10 μL montata sopra una punta da 200 μL. Ciò consente la rimozione dell'eccesso di liquido attraverso una piccola apertura. Posizionare una goccia del 4% di paraformaldeide fissativa sopra la goccia contenente i tester sezionati, quindi trasferire rapidamente i tester su un tubo contenente soluzione fissante fresca.
2. Fissazione della paraformaldeide
- Preparare 2 ml di soluzione fissativa poco prima dell'uso: 600 μL di paraformaldeide al 4% diluita in salina tamponata di fosfato (PBS) con 30 μL di NP40 20% più 1200 μL di eptano in un tubo di microcentrifugo siliconato da 2 ml. Utilizzare il 4% di paraformaldeide in PBS preparata in aliquote 600 μL e conservata a -20°C.
Attenzione: Eptano e paraformaldeide sono tossici e devono essere maneggiati in una cappa aspirante. Smaltirli secondo il regolamento dell'istituto ospitante. - Trasferire i tester utilizzando una micropipetta p200 con un'ampia punta di apertura alla soluzione PFA/NP40/eptano. Agitare il tubo su e giù per 30 s a mano. Continuare a fissare i tester su un miscelatore rotativo a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Arrestare il miscelatore rotante e posizionare il tubo in un rack per tubi per consentire la separazione di fase e per i tester di depositarsi sul fondo del tubo.
- Rimuovere tutto l'eptano e la soluzione fissante e risciacquare rapidamente i tester tre volte con 1x PBS.
- Trasferire in un singolo tubo pulito da 200 μL. Eseguire tutte le incubazioni in questi piccoli tubi per ridurre al minimo le quantità di anticorpi impiegati.
- Rimuovere il buffer in eccesso utilizzando una micropipetta da 200 μL con una punta P200 e una punta P10 attaccata. Fare attenzione a non aspirare teste.
- Conservare i test in 1x PBS sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni non sono pronti.
3. Colorazione anticorpale in soluzione
- Scartare il PBS e lasciare i tester nello 0,3% di PBS-T per 30 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le membrane cellulari.
- Pre-incubare nello stesso tampone più il 5% di siero di capra normale (NGS) per 1 h.
- Aggiungere 200 μL dell'anticorpo primario diluito nello 0,3% pbs-t più 5% NGS(Tabella dei materiali).
- Incubare l'anticorpo primario durante la notte a 4 °C (o temperatura ambiente) con delicata agitazione su un rocker.
- Lavare 3 volte in 0,3% PBS-T per 15 minuti su un rocker a temperatura ambiente. Lasciare che i tester si sistemino sul fondo del tubo per gravità.
- Aggiungere 200 μL di anticorpo secondario diluito 1:500 dalla serie coniugata DyLight.
- Incubare l'anticorpo secondario in una camera scura per 4 ore a temperatura ambiente.
- Lavare in 0,3% PBS-T per 15 minuti su un rocker a temperatura ambiente. Quindi ripetere con 0,2% PBS-T e 0,1% PBS-T, ogni volta per 30 minuti su un rocker a temperatura ambiente. Fare un lavaggio finale in 1x PBS per 30 minuti per rimuovere il detergente.
- Aggiungere 180 μL di soluzione DAPI a 1 μg/mL in 1x PBS per 15 min. La soluzione stock è di 10 mg/mL in H2O. Evitare di fare soluzione stock in PBS, che può ridurre il segnale di colorazione DAPI sulla cromatina diffusa negli spermatociti più grandi.
- Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno.
- Utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio su uno scivolo pulito.
- Aspirare i teste e metterli sulla diapositiva. Il preri risciacquo della punta di apertura ampia con PBS-T dello 0,1% impedisce ai tester di attaccarsi alla punta. Rimuovere il PBS in eccesso.
- Aggiungere una goccia (circa 100 μL) di Citifluor AF1.
- Posizionare delicatamente una coverlip di vetro sul tessuto, facendo attenzione a evitare di intrappolare bolle d'aria.
- Sigillare il coverslip allo scivolo utilizzando smalto chiaro.
- Osservare le diapositive al microscopio.
4. Analisi di colocalizzazione
- Acquisire immagini confocali. Abbiamo usato un microscopio confocale Zeiss LSM 710 (olio apocromatico a piano 63x) con una risoluzione z di 0,5 o 1 μm.
- Selezionare celle diverse da tester indipendenti.
- Importare immagini nel software di elaborazione (ad esempio, Imaris).
- Definire il nucleo mediante segmentazione manuale per escludere i nuclei vicini. Utilizzare il software Coloc; raccoglie i coefficienti di correlazione di Pearson (PCC) all'interno dell'intero volume tra 2 fluorofori.
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Representative Results
Il principale ostacolo all'ottenimento di un'adeguata colorazione dei test di Drosophila è la limitata penetrabilità degli anticorpi, che è stata parzialmente risolta utilizzando preparati schiacciati ma a costo di indurre una restrizione delle analisi 3D (ad esempio rappresentazione 3D o misura della colocalizzazione). La procedura consente un'etichettatura uniforme e preserva il volume di tutte le cellule del testicolo. Qui abbiamo focalizzato l'illustrazione del metodo sulla rappresentazione 3D degli spermatociti S4-S5, in quanto sono le cellule più grandi e quindi più sensibili alla deformazione dalla schiacciamento. Abbiamo usato diversi marcatori nucleari, tra cui le nucleoporine e l'etichettatura del dominio intranucleare MINT (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) descritto dalla proteina mitotica Mad112. Poiché i MITT potrebbero essere rivelati da diversi anticorpi, li abbiamo usati per testare la robustezza del protocollo per la colocalizzazione quantitativa 3D, un metodo che richiede una corretta risoluzione spaziale.
Il protocollo sopra descritto consente l'acquisizione di immagini confocali di qualità sufficiente per poi essere trattate per la ricostituzione 3D. Quattro sezioni seriali adiacenti di uno spermatocita di stadio S5 sono raffigurate nella figura 1A, mostrando un'immunostaining rappresentativa di MINT (Mad1 immunolabeling using GFP booster in red) insieme a DAPI (in ciano). I cromosomi sono organizzati nei caratteristici 3 principali ammassi distinti e la struttura MINT è mostrata in dettaglio attorno al DNA, intimamente associato - ma distinto da - le masse di cromatina autosomica. La risoluzione consente inoltre di rilevare la presenza di Mad1 alla periferia nucleare e tra le masse autosomali dei cromosomi 2 e 3. Abbiamo usato il software Imaris per la rappresentazione 3D. La superficie nucleare è stata definita dalla bassa presenza di Mad1 all'involucro nucleare (in grigio) e MINT è stata definita da un accumulo di alto livello di Mad1 all'interno del nucleo (in rosso) insieme alla colorazione DAPI (in blu)(figura 1A). Il film di ricostituzione 3D illustra bene il volume e la relazione di Mad1 (all'involucro nucleare e nella MINT) insieme ai cromosomi negli spermatociti dello stadio S4-S5.
La distribuzione delle nucleoporine è stata descritta solo male in queste cellule, probabilmente a causa della difficoltà di rilevarle in questi grandi nuclei deformi. La distribuzione di Nup154 è stata riportata solo una voltaprecedentemente 16 e Nup153 e Nup98 sono stati studiati solo nella spermatogonia e piccoli spermatocitiprecoci 17. Le ricostituzioni 3D dei grandi spermatociti S5 macchiati dalla nucleoporina Nup62 e dall'importin β (prodotto del gene ketel) erano fattibili e sono rappresentate rispettivamente nella figura 1C e nella figura 1D. Questi componenti nucleari associati ai pori appaiono distribuiti in modo non uniforme sul bordo nucleare come punti di dimensioni irregolari. Ad esempio, l'β si raccoglie intorno alla cromatina autosomica in modo simile a dove una rete lamina è già stata descritta3. Questo tipo di distribuzione con aree ricche di pori e grandi aree senza pori è stata descritta dalla microscopia elettronica negli spermatociti dei roditori18. Comprendere i cambiamenti nella distribuzione della lamina e della nucleoporina aiuterebbe a comprendere la struttura dell'involucro nucleare in queste cellule G2 poco prima della meiosi maschile.
Pur conservando il volume 3D delle cellule questo protocollo consente anche agli anticorpi di penetrare uniformemente nella profondità di ogni cellula, consentendo analisi quantitative come la colocalizzazione. Il coefficiente di correlazione di Pearson (PCC) è una metrica ben consolidata. Può variare da +1 (denotando una perfetta correlazione positiva) a −1 (perfetta correlazione negativa)19. Per valutare la localizzazione delle proteine partner MINT rispetto a Mad1 negli spermatociti, abbiamo precedentemente stimato il PCC su una singola sezione di 0,5 μm utilizzando ImageJ negli spermatociti S512 (Figura 2A,B). Abbiamo testato il protocollo più profondamente utilizzando la colocalizzazione 3D su interi nuclei invece che solo su una superficie. Il volume dei nuclei è stato definito dalla segmentazione manuale e il PCC è stato misurato utilizzando lo strumento di colocation. Abbiamo analizzato otto nuclei di spermatociti S5, dello stesso testicolo o testicoli diversi. La figura 2B mostra una rappresentazione 3D di un nucleo che è servito a misurare il PCC. La figura 2D mostra la misurazione del PCC su otto diversi nuclei di spermatociti S5 da tre diversi teste. I valori PCC non sono diversi, variando da 0,6 e 0,75, indicando un valore elevato per la colocalizzazione. Questi sono indistinguibili dal PCC definito su una singola sezione. Pertanto, la procedura consente un'etichettatura uniforme riproducibile e conserva un buon volume di tutte le cellule del testicolo.
Poiché il protocollo consente una misurazione affidabile della colocalizzazione da tester indipendenti, ha permesso il confronto della colorazione da diversi genotipi di mosca. Questo è stato illustrato qui dal confronto di mosche e mosche WT RNAi esaurite per Mtor (generato dall'espressione di linee UAS dsRNA e il driver Bam-Gal4 che raggiungono un sostanziale esaurimento nella spermatogonia tardiva e nei primi spermatociti20). Come descritto per gli esperimenti di colocalizzazione, i tester impoveriti di Mtor-RNAi e i tester di tipi selvatici sono stati sezionati e fissati insieme e le immagini confocali sono state acquisite in contesti costanti. Rispettando queste condizioni, il confronto delle singole cellule diventa possibile. Abbiamo osservato che il MINT è più colpito dell'involucro nucleare dalla perdita di Mtor, come dimostrato dalle cellule rappresentative impoverite da Mtor RNAi (superiore) e wt (inferiore)(figura 3)12.
Figura 1: Illustrazione dell'immunostaining dei nuclei di spermatociti Drosophila S4-S5 utilizzando diverse sonde. (A) Immagini di un singolo nucleo di spermatociti allo stadio 5 immunosottenute con anticorpo α-GFP (booster GFP) che rilevano la struttura MINT da Mad1-GFP (rosso) insieme alla colorazione DAPI (blu). Mostra con precisione la relazione tra Mad1 e le due masse di cromatina autosomica (rappresentate come asterischi). Mad1 viene anche debolmente rilevato alla periferia del nucleo. Tutte le immagini sono proiezioni Z seriali di una pila di 3 (0,5 μm) fette confocali successive. Le immagini confocali sono state acquisite su un microscopio confocale (63x, plan Apochromatic oil DIC objective lens). Le barre di scala sono 5 μm. (B) Fotogramma da un rendering cinematografico dello stesso nucleo spermatocita. La superficie nucleare è stata definita dalla bassa espressione di Mad1 all'involucro nucleare (in grigio) e MINT è stata definita da alta espressione di Mad1 all'interno del nucleo (in rosso). (A, B) Ristampato con l'autorizzazione di una figura pubblicata in precedenza(da 12). (C) immagine 3D di un nucleo di spermatociti di stadio 5 con immunosottenimento simultaneo di Nup62 (giallo) e MINT (booster GFP in rosso). La barra di scala è di 4 μm.(D)immagine 3D di un nucleo di spermatociti di stadio 5 con immunosottenimento simultaneo dell'importin-β Ketel (giallo) insieme al DNA (DAPI in blu). Le barre di scala sono di 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Quantificazione della colocalizzazione 2D e 3D di Mad1 insieme a Ulp1. (A) Immagini fuse di un nucleo di spermatociti di stadio 5 immunosostinte con anticorpo booster GFP che rileva Mad1 (verde) e con anticorpo anti-Ulp1 (rosso) rappresentato come una pila spessa 1 μm di un nucleo spermatocita. A destra è indicato il coefficiente di correlazione di intensità di Pearson calcolato utilizzando il plugin ImageJ Coloc-2. Il PCC fu stimato a 0,73 (ristampato con il permesso di Raich12). (B) Immagine unita del nucleo spermatocita di stadio 5 (corrispondente al nucleo G nella tabella adiacente) immunosostimato con anticorpo booster GFP che rileva Mad1 (verde) e con anticorpo anti-Ulp1 (rosso) rappresentato in una proiezione 3D. Il volume del nucleo è stato definito dalla segmentazione manuale. A destra, la tabella elenca i coefficienti di correlazione dell'intensità di Pearson calcolati su 8 diversi spermatociti (da A a H) da 3 tester diversi (da 1 a 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi dell'immunofluorescenza degli spermatociti trattati con Mtor RNAi rispetto al tipo selvatico. Le cellule esaurite di Mtor usando cellule MtorRNAi (ID 110218) (pannelli superiori) e cellule di tipo selvaggio (pannelli inferiori) sono state macchiate per le proteine Mad1, Raf2 e Mtor. I tester sono stati fissati e macchiati insieme, montati sullo stesso scivolo e immagini acquisite con gli stessi parametri. Le cellule RNAi potrebbero essere distinte da WT per l'assenza o la presenza rispettivamente di Mad1-GFP. La cifra è rappresentativa delle proiezioni massime di 4 x 0,5 μm pile. La barra di scala è di 5 μm (ristampata con l'autorizzazione della figura precedentemente pubblicatain 12). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo per l'immunoetichettatura di tester di Drosophila adulti a montaggio intero. Come riportato in altre procedure devono essere utilizzati giovani maschi (abbiamo anche ridotto l'età a meno di 20 ore dopo l'eclosion) per ridurre al minimo la presenza di spermatozoi in via di sviluppo, che rischia di ostruire gli spermatociti. La dissezione deve essere rapida e la diluizione degli anticorpi deve essere regolata per ottimizzare il rapporto segnale-rumore21,22,23. Poiché utilizzando altri protocolli, non abbiamo osservato la colorazione per tutta la profondità del testicolo, abbiamo sviluppato un metodo di fissazione che combina PFA insieme a NP40 ed eptano. Ora usiamo regolarmente 600 μL di paraformaldeide al 4% in PBS con 30 μL di 20% NP40 più due volumi di eptano. Questo è fondamentale per consentire una permeabilizzazione sufficiente. Ridurre la quantità di NP40 a 10 μL riduce visibilmente l'etichettatura. Tutti i passaggi successivi sono stati eseguiti in sospensione e il tampone in eccesso è stato rimosso consentendo ai tester di scendere delicatamente verso il fondo del tubo per gravità. Per l'ultimo passaggio di trasferimento dei campioni in una diapositiva, risciacquiamo la punta in PBS-T allo 0,1% per evitare che i teste si attacchino al cono. Secondo le osservazioni, il protocollo di colorazione immunoistologica funziona bene con una varietà di proteine nucleari, compresi i marcatori qui utilizzati, così come sonde di modifiche epigenetiche dell'istono, lamina e nucleoporine. Notiamo che il protocollo può essere utilizzato anche per i teste larvali, nel qual caso l'eptano dovrebbe essere omesso, in quanto rende i teste più difficili da recuperare intatti.
Il protocollo è appositamente progettato per mantenere pile integre degli spermatociti insieme per un'etichettatura efficiente e uniforme del testicolo. Abbiamo illustrato il protocollo con i grandi spermatociti in fase avanzata, i cui nuclei deformi li rendono tra le cellule più difficili da preservare. Inoltre, in questi spermatociti l'etichettatura nucleare diventa spesso diluita probabilmente a causa delle dimensioni dei nuclei. Ad esempio, si osserva comunemente che l'etichettatura DAPI o lamina è più forte nelle cellule all'apice del testicolo e diventa progressivamente più debole e più dispersa man mano che gli spermatociticrescono 3,24. Questo potrebbe anche essere uno dei motivi per cui la distribuzione delle nucleoporine è stata descritta solo nelle cellule in fase precedente (spermatogonia e primi spermatociti)17.
Sono state pubblicate eccellenti immagini di immunostaining di spermatociti Drosophila S5, in particolare per le proteine t-BRD e dany specifiche del testicolo25,26 utilizzando il protocollo dello 0,3% di deossicholato di sodio o dopo lo schiacciamento del tessuto21,22. Nelle nostre mani, le squash portano a una significativa non uniformità di colorazione nelle profondità dell'organo e sacrificano anche la struttura 3D. Anche se l'uso dello 0,3% di deossicolato di sodio ha dato risultati migliori, abbiamo comunque osservato la non uniformità. Pertanto, preferiamo NP40 per la sua riproducibilità e qualità dell'etichettatura. Le immagini confocali consentono la ricostruzione di immagini 3D per proteine nucleari. Ad esempio, abbiamo applicato con successo questo metodo utilizzando molte sonde diverse, illustrate qui dal dominio intranucleare MINT, intimamente associate alle masse di cromatina autosomica e alla rete dei pori nucleari. L'intrigante distribuzione 3D dei pori nucleari di questi nuclei di spermatociti è ora disponibile per ulteriori studi. Le immagini consentono una quantificazione riproducibile della colocalizzazione da diversi spermatociti dello stesso testicolo e da testicoli diversi. Per quanto ne siamo a conoscenza, è la prima volta che su tali campioni viene misurata una quantificazione accurata da parte del coefficiente di correlazione di Pearson. Fornisce la fiducia necessaria per un confronto accurato dei livelli proteici immunoetichettati di diversi tester.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura per gli anticorpi e A. Debec, i centri di borsa bloomington e vienna per le mosche. Grazie a C. Jackson per suggerimenti e discussioni stimolanti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Stock solution must be prepared in H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Wide Bore Pipette Tips | Fisherbrand | 11917744 | Wide aperture tip |
| Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml micro centrifuge tubes | Sigma | T3531-200EA | Siliconized 2ml tube |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyde 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| 0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T | PBS 1X containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, for molecular biology, | Sigma | T8787 | |
| Antibodies | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Mouse anti-Mtor | 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University | ||
| Rat anti-Nup62 | 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK | ||
| Guinea-pig anti-Ulp1 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| Rabbit anti-Raf2 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| DyLight conjugated series | Thermo | 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse, rabbit or rat) as second antibodies |
References
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