Summary
Vi presenterer her en forbedret protokoll for helmontert forberedelse og immunstaining av Drosophila-testikler, egnet for konfektmikroskopi og tillater også reproduserbar og pålitelig merking. Vi illustrerer denne protokollen ved 3D-representasjon og kvantifisering av colokaliseringsforsøk på de store S4-S5-spermatocyttene.
Abstract
Drosophila testikler er et kraftig modellsystem for å studere biologiske prosesser, inkludert stamcellebiologi, kjernearkitektur, meiosis og sædutvikling. Imidlertid er immunolabeling av hele Drosophila testis ofte forbundet med betydelig ikke-ensartethet av farging på grunn av antistoff penetrasjon. Knuste preparater overvinner bare delvis problemet siden det reduserer 3D-kvaliteten på analysene. Her beskriver vi en helmontert protokoll ved hjelp av NP40 og heptane under fiksering sammen med immunisolering i flytende medier. Det bevarer volumet som er egnet for konfektmikroskopi sammen med reproduserbar og pålitelig merking. Vi viser forskjellige eksempler på 3D-rekonstituering av spermatocyttkjerner fra konfiskeringsseksjoner. Den intra- og inter-testikler reproduserbarhet tillater 3D kvantifisering og sammenligning av fluorescens mellom enkeltceller fra forskjellige genotyper. Vi brukte forskjellige komponenter i den intranukleære MINT-strukturen (Mad1-inneholdende Intra Nuclear Territory) samt to komponenter knyttet til kjernefysisk porekompleks for å illustrere denne protokollen og dens anvendelser på de største cellene i testis, S4-S5 spermatocytter.
Introduction
Drosophila testikler er en verdifull modell for studiet av kjernefysisk arkitektur. I mitotiske spermatogonialceller er atomvolumet i stor grad okkupert av kromatin. Disse cellene gjennomgår fire runder med divisjon, og produserer en cyste på 16 primære spermatocytter. I løpet av de neste dagene passerer spermatocyttene gjennom 6 utviklingsstadier (S1-S6), som øker i volum, ca. 20 ganger1,2. De endrer også sin kjernefysiske morfologi. Omrisset av kjernen, avslørt av lamin Dm0, blir uregelmessig og viser dype invaginasjoner1,3. Dette ledsages av omfattende genuttrykksendringer og modifikasjoner i kromatinorganisasjon1,4,5,6,7. De interfase kromosomene er veldefinerte i trinn S4-S5, og danner tre forskjellige masser som tilsvarer de 2 store bivalente autosomene og X-Y-paret som er forankret med kjernen.
Mad1 ble opprinnelig isolert som en nøkkelkomponent i det mitotiske sjekkpunktet (gjennomgått i8). I interfase er det beskrevet som plassert primært på atomkonvolutten, men også i nukleoplasma9,10,11. I Drosophila testis rapporterte vi at Mad1 er fremtredende i nukleoplasma, nært forbundet med de to store autosomale kromatinmassene og i mindre grad med XY-kromatin. Vi definerte denne kromatin-tilknyttede strukturen som MINT (Mad1-inneholdende IntraNuclear Territory)12. Fire andre proteiner var assosiert med MINTs i spermatocytter: nukleoporin Mtor / Tpr, SUMO peptidase Ulp1, det mitotiske sjekkpunktproteinet Mad2 og en underenhet av et Polycomb-lignende kompleks Raf212.
For å fullføre beskrivelsen av MINTs, måtte vi bruke antistoffer og ble konfrontert med de tekniske problemene som vanligvis oppstod med immunoppnåelse i testis: en dårlig permeabilitet som resulterte i en betydelig ikke-ensartethet av farging i dybden av testisene, spesielt i de store spermatocyttene. Squashed preparater økt antistoff tilgang, men førte til komprimerte bilder, begrense 3D-analyser, og forhindre måling av kvantitativ fluorescens, inkludert colocalization. Problemet med antistoff penetrasjon kan også løses av permeabiliserende midler som 0,3% Na deoxycholate13, men denne prosedyren ga ikke i våre hender reproduserbare resultater. Fordi vi utførte mange komerkingseksperimenter, så vi ut til å forbedre permeabiliseringsprotokollen. Kombinasjonen av 1% NP40 pluss heptane resulterte i mer reproduserbarhet, spesielt ved å studere de store spermatocyttene.
Denne protokollen utfører fiksering og immunisering av testikler i suspensjon, forbedrer prøvekvaliteten samt forbedrer reproduserbarheten og gjør den egnet for konfikal mikroskopi. Vi brukte protokollen til bedre å definere de romlige forholdene til visse kjernefysiske konvoluttproteiner med nukleoplasmatiske strukturer av store spermatocytter. Denne metoden vil tillate bedre undersøkelser av endringene som følger med spermatocyttutvikling, for eksempel de dynamiske strukturelle endringene i kjernen, inkludert kromatin, nukleoplasma og kjerneporene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila testikler samling
MERK: Unge menn (0-15 h post-eclosjon) er nødvendige for å undersøke diploid bakterieceller (dvs. spermatogonia og spermatocytter).
- Velg unge fluer så mye som mulig for å minimere forstyrrelser fra å utvikle spermatider.
- Bedøv flyr ved kort eksponering for karbondioksid og overføres til en flypute14,15.
- Under et dissekerende mikroskop (10x forstørrelse) bruker du tang for å fjerne hodet.
- Overfør 5 til 10 halshuggede fluer til 100 μL av Ringers buffer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, komplett proteinhemmer, pH 6,8) på et silikonbelagt glasssklie på en svart bakgrunnsstøtte.
- Med dissekering av mikroskop ved en 40x forstørrelse, bruk ett par nummer 5 tang for å holde en flue mellom thoraxen og magen, og med andre tang trekker magen bort fra thoraxen. Isoler raskt testiklene og tilstøtende vev fra fluekroppen15 og legg i en ny dråpe Ringers buffer på samme lysbilde.
- Når alle testiklene er klare, rengjør testiklene fra de resterende vevene (tilbehørskjertelen og ytre kjønnsorganer).
- Fjern overflødig buffer fra dråpen som inneholder dissekerte testikler. Bruk vanligvis en p200 pipette med en 10 μL spiss montert på toppen av en 200 μL spiss. Dette gjør det mulig å fjerne væskeoverskuddet gjennom en liten blenderåpning. Legg en dråpe på 4% paraformaldehydfiksiv på toppen av dråpen som inneholder dissekerte testikler, og overfør deretter testiklene raskt til et rør som inneholder fersk fikseringsløsning.
2. Paraformaldehydfiksering
- Forbered 2 ml fikseringsløsning like før bruk: 600 μL 4% paraformaldehyd fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS) med 30 μL NP40 20% pluss 1200 μL heptan i et 2 ml silikonisert mikrocentrifugerør. Bruk 4% paraformaldehyd i PBS fremstilt i 600 μL aliquots og lagret ved -20 °C.
Forsiktig: Heptan og paraformaldehyd er giftige og bør håndteres i en avtrekkshette. Kast dem i henhold til vertsinstituttets forskrifter. - Overfør testiklene ved hjelp av en p200 mikropipette med en bred blenderspiss til PFA/NP40/heptanløsningen. Rist røret opp og ned i 30 s for hånd. Fortsett å feste testiklene på en roterende mikser ved romtemperatur i 30 minutter.
- Stopp den roterende mikseren og plasser røret i et rørstativ for å tillate faseseparasjon og for testiklene å slå seg ned til bunnen av røret.
- Fjern alle heptane og fikseringsløsningen og skyll testiklene raskt tre ganger med 1x PBS.
- Overfør til et rent 200 μL individuelt rør. Utfør alle inkubasjoner i disse små rørene for å minimere mengden antistoffer som brukes.
- Fjern overflødig buffer ved hjelp av en 200 μL mikropipette med både en P200 og en P10-spiss festet. Pass på at du ikke aspirerer testikler.
- Hold testikler i 1x PBS på is til alle prøver er klare.
3. Antistofffarging i oppløsning
- Kast PBS og la testikler ligge i 0,3% PBS-T i 30 minutter ved romtemperatur for å permeabilisere cellemembraner.
- Pre-inkubere i samme buffer pluss 5% normalt geiteserum (NGS) i 1 time.
- Tilsett 200 μL av det primære antistoffet fortynnet i 0,3% PBS-T pluss 5% NGS (Tabell over materialer).
- Inkuber det primære antistoffet over natten ved 4 °C (eller romtemperatur) med mild agitasjon på en rocker.
- Vask 3 ganger i 0,3% PBS-T i 15 min på en rocker ved romtemperatur. La testiklene slå seg ned til bunnen av røret med tyngdekraften.
- Tilsett 200 μL sekundært antistoff fortynnet 1:500 fra DyLight-konjugert serie.
- Inkuber det sekundære antistoffet i et mørkt kammer i 4 timer ved romtemperatur.
- Vask i 0,3% PBS-T i 15 min på en rocker ved romtemperatur. Gjenta deretter med 0,2% PBS-T og 0,1% PBS-T, hver gang i 30 min på en rocker ved romtemperatur. Gjør en siste vask i 1x PBS i 30 min for å fjerne vaskemiddelet.
- Tilsett 180 μL DAPI-oppløsning ved 1 μg/ml i 1x PBS i 15 minutter. Lagerløsningen er 10 mg/ml i H2O. Unngå å lage lagerløsning i PBS, noe som kan redusere DAPI-fargesignalet på diffust kromatin i større spermatocytter.
- Vask 3x i 5 min hver.
- Bruk en hydrofob barrierepenn til å tegne en sirkel på et rent lysbilde.
- Aspirere testikler og sette dem på lysbildet. Forskylling av den brede blenderspissen med 0,1 % PBS-T forhindrer at testiklene fester seg til spissen. Fjern overflødig PBS.
- Tilsett en dråpe (ca. 100 μL) av Citifluor AF1.
- Plasser forsiktig et glassdeksler over vevet, og pass på å unngå å fange luftbobler.
- Forsegle dekslene til lysbildet ved hjelp av klar neglelakk.
- Vær oppmerksom på lysbilder på et mikroskop.
4. Colocalization analyser
- Skaff deg konfiskeringsbilder. Vi brukte et Zeiss LSM 710 konfokalt mikroskop (63x Plan Apochromatic oil) med en z-oppløsning på 0,5 eller 1 μm.
- Velg forskjellige celler fra uavhengige testikler.
- Importer bilder til behandling av programvare (f.eks.
- Definer kjernen ved manuell segmentering for å utelukke nabokjernene. Bruk Coloc-programvaren; den samler Pearsons korrelasjonskoeffisienter (PCC) inne i hele volumet mellom 2 fluoroforer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det største hinderet for å oppnå tilstrekkelig farging av Drosophila-testikler er den begrensede gjennomførbarheten av antistoffer, som har blitt delvis løst ved å bruke knuste preparater, men på bekostning av å indusere en begrensning av 3D-analysene (for eksempel 3D-representasjon eller mål på colokalisering). Prosedyren tillater jevn merking og bevarer volumet av alle cellene i testisene. Her har vi fokusert illustrasjonen av metoden på 3D-representasjon av S4-S5 spermatocytter, da de er de største cellene og dermed mer følsomme for deformasjon fra squashing. Vi brukte forskjellige kjernefysiske markører, inkludert nukleopoliner og merking av det intranukleære MINT-domenet (Mad1-inneholdende Intra Nuclear Territory) beskrevet av det mititotiske proteinet Mad112. Ettersom MINTs kunne avsløres av flere forskjellige antistoffer, brukte vi dem til å teste robustheten i protokollen for kvantitativ 3D-colokalisering, en metode som nødvendiggjør en riktig romlig oppløsning.
Protokollen beskrevet ovenfor tillater anskaffelse av konfektbilder av tilstrekkelig kvalitet til deretter å bli behandlet for 3D-rekonstituering. Fire tilstøtende serielle deler av en fase S5 spermatocytt er avbildet i figur 1A, som viser en representativ immunisering av MINT (Mad1 immunolabeling ved hjelp av GFP booster i rødt) sammen med DAPI (i cyan). Kromosomene er organisert i de karakteristiske 3 store distinkte klyngene, og MINT-strukturen er vist i detalj rundt DNA-et, nært forbundet med - men forskjellig fra - de autosomale kromatinmassene. Resolusjonen tillater også deteksjon av tilstedeværelsen av Mad1 ved kjernefysisk periferi, så vel som mellom de autosomale massene av kromosomer 2 og 3. Vi brukte Imaris programvare for 3D-representasjon. Den kjernefysiske overflaten ble definert av den lave tilstedeværelsen av Mad1 ved atomkonvolutten (i grått) og MINT ble definert ved høynivåakkumulering av Mad1 inne i kjernen (i rødt) sammen med DAPI-farging (i blått) (Figur 1A). 3D-rekonstitueringsfilmen illustrerer godt volumet og forholdet mellom Mad1 (ved atomkonvolutten og i MINT) sammen med kromosomene i stadium S4-S5 spermatocytter.
Fordelingen av nukleoporiner har bare blitt dårlig beskrevet i disse cellene, sannsynligvis på grunn av vanskeligheten med å oppdage dem i disse store misshapenkjernene. Fordelingen av Nup154 har bare blitt rapportert en gang tidligere16 og Nup153 og Nup98 ble bare studert i spermatogonia og små, tidlige spermatocytter17. 3D-rekonstitueringene av store S5-spermatocytter farget av nukleoporin Nup62 og importin β (produkt av ketelgenet) var gjennomførbare og er representert i henholdsvis figur 1C og figur 1D. Disse kjernefysiske pore-assosierte komponentene vises ikke-ensartet fordelt over atomkanten som prikker av uregelmessig størrelse. Importin-β for eksempel samles rundt autosomalt kromatin på samme måte som der et laminnettverk allerede er beskrevet3. Denne typen distribusjon med porerike områder og store porefrie områder har blitt beskrevet av elektronmikroskopi hos gnager spermatocytter18. Å forstå endringene i lamin- og nukleoporinfordelingen vil bidra til å forstå den kjernefysiske konvoluttstrukturen i disse G2-cellene like før mannlig meiosis.
Mens du sparer 3D-volumet av cellene, tillater denne protokollen også antistoffer å trenge jevnt inn i dybden av hver celle, slik at kvantitativ analyse som colokalisering. Pearson-korrelasjonskoeffisienten (PCC) er en veletablert metrikk. Den kan variere fra +1 (som betegner perfekt positiv korrelasjon) til −1 (perfekt negativ korrelasjon)19. For å evaluere lokaliseringen av MINT-partnerproteiner i forhold til Mad1 i spermatocytter, har vi tidligere estimert PCC på en enkelt seksjon på 0,5 μm ved hjelp av ImageJ i S5 spermatocytter12 (Figur 2A,B). Vi testet protokollen dypere ved å bruke 3D-colokalisering på hele kjernen i stedet for bare en overflate. Volumet av kjernene ble definert ved manuell segmentering og PCC ble målt ved hjelp av Colocation-verktøyet. Vi analyserte åtte S5 spermatocyttkjerner, fra samme testis eller forskjellige testikler. Figur 2B viser en 3D-representasjon av en kjerne som tjente til å måle PCC. Figur 2D viser målingen av PCC på åtte forskjellige S5 spermatocyttkjerner fra tre forskjellige testikler. PCC-verdier er ikke forskjellige, varierende fra 0,6 og 0,75, noe som indikerer en høy verdi for colokalisering. Disse kan ikke skilles fra PCC definert på en enkelt seksjon. Dermed tillater prosedyren en reproduserbar jevn merking og bevarer et godt volum av alle cellene i testisene.
Fordi protokollen tillater pålitelig måling av colokalisering fra uavhengige testikler, tillot det sammenligning av farging fra forskjellige flygenotyper. Dette ble illustrert her ved sammenligning av WT fluer og fluer RNAi utarmet for Mtor (generert av uttrykk for dsRNA UAS linjer og Bam-Gal4 driveren som oppnår betydelig uttømming i sen spermatogonia og tidlig spermatocytter20). Som beskrevet for colokaliseringsforsøkene ble Mtor-RNAi-utarmede testikler og wild-typer testikler dissekert og festet sammen, og de kondokale bildene ble anskaffet under konstante innstillinger. Respekterer disse forholdene, blir sammenligningen av individuelle celler mulig. Vi observerte at MINT er mer påvirket enn atomkonvolutten ved tap av Mtor som vist av representative Mtor RNAi-utarmede (øvre) og wt (nedre) celler (Figur 3)12.
Figur 1: Illustrasjon av immunstaining av Drosophila S4-S5 spermatocytter kjerner ved hjelp av forskjellige sonder. (A) Bilder av en enkelt trinn 5 spermatocyttkjerne immunostert med α-GFP antistoff (GFP booster) som oppdager MINT-strukturen av Mad1-GFP (rød) sammen med DAPI-farging (blå). Det viser med presisjon forholdet mellom Mad1 og de to autosomale kromatinmassene (representert som stjerner). Mad1 oppdages også svakt i periferien av kjernen. Alle bilder er serielle Z-projeksjoner av en stabel på 3 (0,5 μm) etterfølgende konfokale skiver. Konfokale bilder ble anskaffet på et konfokalt mikroskop (63x, Plan Apochromatic oil DIC objektiv linse). Skalastenger er 5 μm. (B) Ramme fra en filmgjengivelse av samme spermatocyttkjerne. Den kjernefysiske overflaten ble definert av lavt uttrykk for Mad1 ved atomkonvolutten (i gråtoner) og MINT ble definert av høyt uttrykk for Mad1 inne i kjernen (i rødt). (A, B) Gjengitt med tillatelse fra tidligere publisert figur (fra12). (C) 3D-bilde av en fase 5 spermatocyttkjerne med samtidig immunstaining av Nup62 (gul) og MINT (GFP booster i rødt). Skala bar er 4 μm. (D) 3D bilde av en stadium 5 spermatocytt kjernen med samtidig immunostaining av importin-β Ketel (gul) sammen med DNA (DAPI i blått). Skalastenger er 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 2D- og 3D-kvantiseringskvartifisering av Mad1 sammen med Ulp1. (A) Sammenslåtte bilder av en fase 5 spermatocyttkjerne immunostained med GFP booster antistoff detektere Mad1 (grønn) og med anti-Ulp1 antistoff (rød) representert som en 1 μm tykk stabel av en spermatocyttkjerne. Til høyre er indikert Pearson intensitet korrelasjonskoeffisient beregnet ved hjelp av Coloc-2 ImageJ plugin. PCC ble estimert til 0,73 (gjengitt med tillatelse fra Raich12). (B) Sammenslått bilde av stadium 5 spermatocyttkjerne (tilsvarende kjerne G i tilstøtende tabell) immunostert med GFP booster antistoff detektere Mad1 (grønn) og med anti-Ulp1 antistoff (rød) representert i en 3D-projeksjon. Volumet av kjernen ble definert ved manuell segmentering. Til høyre viser tabellen Pearsons intensitetskoeffisienter beregnet på 8 forskjellige spermatocytter (A til H) fra 3 forskjellige testikler (1 til 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Immunfluorescensanalyse av Mtor RNAi-behandlede spermatocytter sammenlignet med vill type. Celler utarmet av Mtor ved hjelp av MtorRNAi (ID 110218) celler (øvre paneler) og ville type celler (nedre paneler) ble farget for Mad1, Raf2 og Mtor proteiner. Testiklene ble fikset og farget sammen, montert på samme lysbilde og bilder ervervet med de samme parametrene. RNAi-cellene kan skilles fra WT av henholdsvis fraværet eller tilstedeværelsen av Mad1-GFP. Figuren er representativ for maksimale fremspring på 4 x 0,5 μm stabler. Skalalinjen er 5 μm (gjengitt med tillatelse fra tidligere publisert figur i12). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en metode for vellykket immunisering av helmonterte voksne Drosophila-testikler. Som rapportert i andre prosedyrer må unge menn brukes (vi forkortet til og med alderen til mindre enn 20 timer etter eklosjon) for å minimere tilstedeværelsen av å utvikle sæd, noe som risikerer å hindre spermatocyttene. Disseksjonen skal være rask og antistofffortynning må justeres for å optimalisere signal-til-støy-forholdet21,22,23. Fordi vi brukte andre protokoller, observerte vi ikke farging gjennom hele testisens dybde, vi utviklet en fikseringsmetode som kombinerer PFA sammen med NP40 og heptane. Vi bruker nå rutinemessig 600 μL 4% paraformaldehyd i PBS med 30 μL 20% NP40 pluss to bind heptan. Dette er avgjørende for å muliggjøre tilstrekkelig permeabilisering. Hvis du reduserer mengden NP40 til 10 μL, reduseres merkingen. Alle de påfølgende trinnene ble utført i suspensjon og overflødig buffer ble fjernet ved å la testiklene synke forsiktig til bunnen av røret med tyngdekraften. For det siste trinnet som overfører prøver til et lysbilde, skyller vi spissen i 0,1% PBS-T for å forhindre at testiklene stikker til kjeglen. Ifølge observasjoner fungerer den immunhitologiske fargingsprotokollen godt med en rekke kjerneproteiner, inkludert markørene som brukes her, samt sonder av epigenetiske histone modifikasjoner, lamin og nukleopoliner. Vi merker at protokollen også kan brukes til larval testikler, i så fall bør heptane utelates, da det gjør testiklene vanskeligere å gjenopprette intakt.
Protokollen er spesielt designet for å opprettholde uskadede stabler av spermatocyttene sammen for en effektiv og jevn merking av testisene. Vi illustrerte protokollen med de store senfase spermatocyttene, hvis misshapenkjerner gjør dem til blant de vanskeligste cellene å bevare. Videre blir atommerkingen i disse spermatocyttene ofte fortynnet sannsynligvis på grunn av størrelsen på kjernen. For eksempel observeres det ofte at DAPI- eller laminmerking er sterkere i cellene ved testis-apexen og blir gradvis svakere og mer spredt etter hvert som spermatocyttene vokser3,24. Dette kan også være en av grunnene til at fordelingen av nukleoporiner bare er beskrevet i tidligere faseceller (spermatogonia og tidlige spermatocytter)17.
Utmerkede bilder av immunstaining av Drosophila S5 spermatocytter har blitt publisert, spesielt for testis-spesifikke t-BRD og dany proteiner25,26 ved hjelp av enten 0,3% natrium deoxycholate protokoll eller etter squashing av vevet21,22. I våre hender fører squashes til en betydelig ikke-ensartethet av farging i dypet av orgelet og samt ofre 3D-strukturen. Selv om bruken av 0,3% natriumdeoksycholat ga bedre resultater, observerte vi fortsatt ikke-ensartethet. Dermed foretrekker vi NP40 for reproduserbarhet og kvalitet på merking. De konfomiske bildene tillater rekonstruksjon av 3D-bilder for kjerneproteiner. For eksempel har vi vellykket brukt denne metoden ved hjelp av mange forskjellige sonder, illustrert her av det intranukleære MINT-domenet, nært forbundet med de autosomale kromatinmassene og atomporene. Spennende 3D-distribusjon av kjerneporer av disse spermatocyttkjernene er nå tilgjengelig for videre studier. Bildene tillater reproduserbar kvantifisering av colokalisering fra forskjellige spermatocytter fra samme testis og fra forskjellige testikler. Så vidt vi vet er dette første gang nøyaktig kvantifisering av Pearsons korrelasjonskoeffisient er målt på slike prøver. Det gir tilliten som kreves for nøyaktig immunolabelled protein nivåer sammenligning av ulike testikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura for antistoffer og A. Debec, Bloomington og Wien lagersentre for fluer. Takk til C. Jackson for forslag og stimulerende diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Stock solution must be prepared in H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Wide Bore Pipette Tips | Fisherbrand | 11917744 | Wide aperture tip |
| Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml micro centrifuge tubes | Sigma | T3531-200EA | Siliconized 2ml tube |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyde 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| 0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T | PBS 1X containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, for molecular biology, | Sigma | T8787 | |
| Antibodies | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Mouse anti-Mtor | 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University | ||
| Rat anti-Nup62 | 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK | ||
| Guinea-pig anti-Ulp1 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| Rabbit anti-Raf2 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| DyLight conjugated series | Thermo | 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse, rabbit or rat) as second antibodies |
References
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
- Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
- Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
- Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
- White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
- Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).
- Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
- Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
- Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S.
- Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
- Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
- Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
- White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
- Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
- Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
- Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).
