Summary
Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.
Abstract
Los métodos presentados aquí demuestran procedimientos de laboratorio para la disección de cuatro regiones diferentes del sistema nervioso central (SNC) de neonatos murinos para el aislamiento de subpoblaciones gliales. El propósito del procedimiento es disociar la microglía, las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) y los astrocitos del tejido cortical, cerebeloso, del tronco encefálico y de la médula espinal para facilitar el análisis in vitro adicional. Los procedimientos de aislamiento de la región del SNC permiten determinar la heterogeneidad regional entre las glías en múltiples sistemas de cultivo celular. Se realiza un aislamiento rápido de la región del SNC, seguido de la extirpación mecánica de las meninges para evitar la contaminación de la glía por células meníngeas. Este protocolo combina una disociación suave del tejido y el recubrimiento en una matriz específica diseñada para preservar la integridad y la adherencia celular. El aislamiento de la glía mixta de múltiples regiones del SNC proporciona un análisis exhaustivo de la glía potencialmente heterogénea al tiempo que maximiza el uso de animales de experimentación individuales. Además, después de la disociación del tejido regional, la glía mixta se divide en múltiples tipos de células, incluidas la microglía, las OPC y los astrocitos para su uso en un solo tipo de célula, inserciones de placas de cultivo celular o sistemas de cocultivo. En general, las técnicas demostradas proporcionan un protocolo integral de amplia aplicabilidad para la disección cuidadosa de cuatro regiones individuales del SNC de neonatos murinos e incluye métodos para el aislamiento de tres tipos individuales de células gliales para examinar la heterogeneidad regional en cualquier número de sistemas de cultivo celular in vitro o ensayos.
Introduction
La glía es necesaria para la función neuronal adecuada en el SNC. Están compuestos por tres subpoblaciones principales, astrocitos, oligodendrocitos y microglía, cada uno con un papel diferente, pero indispensable1. Sin la diversidad y actividad adecuada de las células gliales, la función neuronal se vería gravemente afectada, lo que llevaría al deterioro del SNC. Las glías son capaces de influir en la neurotransmisión, y cada tipo de célula lo hace de una manera única. Las células gliales en el cerebro tienen la capacidad de comunicarse entre sí, así como con las células neuronales, con el fin de facilitar la función adecuada del SNC2. Los oligodendrocitos aumentan la velocidad de transmisión eléctrica a través de la formación de una vaina de mielina, lo que facilita la agrupación de canales iónicos en los nodos de Ranvier, los sitios de generación potencial de acción neuronal3. La microglía es crítica para la poda de las sinapsis mediante el monitoreo de la transmisión sináptica y el "recableado" de las conexiones neuronales después de la lesión4. Además, la microglía es la célula inmune residente más abundante del SNC, actuando como la forma primaria de defensa del huésped contra los patógenos5. Los astrocitos pueden regular la transmisión sináptica entre neuronas modificando la concentración de potasio extracelular6. También tienen un papel en el control del flujo sanguíneo local7, la liberación y absorción de elementos neuromoduladores8, y tienen un papel clave en el mantenimiento de la barrera hematoencefálica9. Por lo tanto, cada subtipo glial es crítico para la función del SNC, ya que los defectos en cualquier tipo se han asociado durante mucho tiempo con una amplia variedad de estados patológicos, incluyendo enfermedades psiquiátricas, epilepsia y condiciones neurodegenerativas10.
El mayor obstáculo en el estudio de la patobiología del SNC es la incapacidad de investigar las células humanas en el contexto de su nicho microambiental. El tejido de biopsia humana se recolecta más post mortem y las células pueden dañarse o perderse fácilmente durante la extracción y el procesamiento. Además, es un desafío mantener las células humanas vivas y viables in vitro durante cualquier período de tiempo sin derivar líneas celulares inmortalizadas de tumores, momento en el cual ya no reflejan con precisión sus propiedades fisiológicas normales11,12. Además, existe una cantidad significativa de heterogeneidad regional entre los tipos individuales de células gliales13,14,15, y la obtención de muestras regionales del SNC de pacientes individuales es casi imposible. Como tal, es necesario desarrollar modelos alternativos para estudiar la contribución de la glía regional en trastornos específicos del SNC.
Aquí, describimos un sistema in vitro que utiliza el aislamiento específico de la región del SNC del ratón de múltiples subpoblaciones gliales, lo que permite la manipulación y cuantificación de microglía, células precursoras de oligodendrocitos (OPC), que dan lugar a oligodendrocitos maduros, y astrocitos. Cada población puede ser aislada independientemente y sometida a una amplia variedad de técnicas experimentales que incluyen tratamiento farmacológico o molecular, inmunocitoquímica, extracción y análisis de proteínas / ARN y otros sistemas de cocultivo según la necesidad experimental. Además, esta técnica de aislamiento produce un alto número de células, lo que permite la caracterización e investigación de cada población glial de una manera de alto rendimiento. También permite el estudio de la diferenciación, el crecimiento y la proliferación de células del SNC en respuesta a una amplia variedad de estímulos microambientales de manera controlada para evitar factores de confusión que suelen estar presentes en un entorno in vivo. Por último, esta técnica de aislamiento celular facilita la manipulación de las poblaciones de células gliales dentro de diferentes regiones del SNC para investigar cómo la glía regional interactúa entre sí y responde a estímulos variables, lo que permite precisión y reproducibilidad.
Protocol
NOTA: Todos los estudios en animales fueron autorizados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación Lerner de la Clínica Cleveland.
1. Preparar los medios y suministros para la disección
NOTA: Todas las recetas de búfer y medios se proporcionan en la Tabla 1. Este procedimiento se realiza en condiciones estériles en un cultivo de tejidos designado gabinete de bioseguridad.
- Preparar y filtrar estérilmente los medios gliales mixtos (MGM). Esto se puede hacer el día anterior y se almacena a 4 °C.
- Diluir la fibronectina a una concentración de 1:100 conH2Oestéril. El volumen de fibronectina diluida dependerá del número de cachorros y la región del SNC utilizada para el experimento. Utilice un matraz T25 para 1 corteza, un matraz T25 para 2-4 cerebella, un matraz T25 para 2-4 troncos cerebrales y un matraz T25 para 2-4 médula espinal.
NOTA: La combinación de tejido de la misma región utilizando los criterios enumerados anteriormente permitirá una disociación adecuada sin alterar el protocolo descrito a continuación. La combinación de más tejido del descrito en el Paso 1.2 requerirá una mayor optimización de las concentraciones de reactivos de disociación. - Pipetear 3 ml de fibronectina diluida en matraces T25 a temperatura ambiente y dejar reposar durante 2 min.
- Aspirar la fibronectina y dejar que los matraces se sequen durante la noche con la tapa del matraz aflojada.
2. Disección de corteza, cerebelo, tronco encefálico y médula espinal
NOTA: Este procedimiento se puede realizar en la mesa de trabajo y requiere un alcance de disección. Use una técnica aséptica estricta para todos los pasos del procedimiento y minimice la exposición del tejido al aire ambiente. Mantenga todos los medios fríos en hielo durante la disección para garantizar la máxima preservación del tejido. Alternativamente, este procedimiento podría realizarse en una campana que permita el uso de un alcance de disección interna.
- Limpie todas las áreas con etanol al 70%.
- Pipetear 10 ml de PBS/solución antibiótica (PAS) en una placa de Petri de 10 cm. Prepara una placa de Petri para cada cachorro a diseccionar. Coloque en hielo para mantener la solución fría.
- En una campana de cultivo de tejidos desinfectada, pipetear 9 ml de DMEM (sin aditivos) en 4 tubos cónicos separados de 15 ml, uno para cada región del SNC, reemplazar las tapas de los tubos y poner en hielo. Coloque el cubo de hielo con tubos a una distancia de alcance del alcance de la disección.
- Colocar una placa de Petri de 10 cm preparada en el paso 2.2 en la etapa de endoscopio de disección desinfectada.
- Anestesiar y sacrificar a la cría de ratón de acuerdo con el protocolo institucional y retirar la cabeza por decapitación rápida con tijeras afiladas.
NOTA: Día postnatal (P) Se utilizan 3-5 cachorros. Los cachorros mayores tienen un SNC más desarrollado y pueden no ser una fuente adecuada de células gliales en expansión. Los cachorros más jóvenes (P) 0-2 pueden producir un mayor número de glía y pueden ser utilizados; Sin embargo, el tejido de la médula espinal es muy difícil de diseccionar a esta temprana edad debido al tamaño. - Limpia la piel del cachorro con etanol al 70%.
- Usando tijeras finas, cortar la capa cutánea a lo largo de la línea media de la cabeza del animal, comenzando caudalmente y moviendo rostral, hasta llegar al hocico. Evite cortar profundamente en el cráneo para evitar cualquier daño tisular.
- Inclinando la cabeza hacia abajo, tire de la capa cutánea a cada lado del cráneo y usando tijeras de resorte, haga una incisión a lo largo de la línea media del cráneo, comenzando en el foramen magnum, nuevamente cortando caudal a rostral.
- Con pinzas de punta fina, tire de las mitades del cráneo hacia los lados derecho e izquierdo, exponiendo la corteza, el cerebelo y el tronco encefálico.
- Una vez expuesto, levante suavemente el cerebro fuera del cráneo y dentro de la placa de Petri de 10 cm preparada en el Paso 2.2. Asegúrese de que el cerebro permanezca intacto para preservar la estructura anatómica, con el cerebro posterior unido.
- Usando pinzas finas de punta curva con la punta de los fórceps hacia arriba, pellizque el cerebelo. Retire las meninges y colóquelas en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo.
- Asegúrese de que el tronco encefálico sea directamente ventral al cerebelo y sea visible después de la extracción del cerebelo. Retírelo con pinzas de punta fina, retire las meninges y colóquelo en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo.
- Separe el mesencéfalo de la corteza, retire las meninges corticales y colóquelo en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo.
- Para extirpar la médula espinal, coloque el cachorro de ratón decapitado en posición supina (acostado boca arriba) con la columna vertebral cortada elevada hacia el investigador.
- Rocíe nuevamente con etanol al 70%.
- Cortar a lo largo de los lados laterales de la columna vertebral, en dirección rostral a caudal, a través de la caja torácica hasta llegar a las extremidades posteriores. Mientras corta, empuje hacia atrás los órganos internos hasta que la columna vertebral sea visible.
- Cortar a lo largo de cada lado lateral de la columna vertebral hasta aislarla y colocar en la placa de Petri de 10 cm preparada en el paso 2.2.
- Con el lado ventral hacia arriba, utilizando tijeras finas de resorte, alterna el corte de los lados derecho e izquierdo de cada vértebra hasta llegar a la región lumbar para exponer el tejido de la médula espinal.
- Retire suavemente la médula espinal y las meninges con pinzas de punta fina bajo el microscopio de disección. Coloque en un tubo cónico designado de 15 ml en cubitera.
- Repita los pasos 2.5.-2.19 para cada cachorro, combinando tejido de la misma región para ajustarse a los criterios descritos en el paso 1.2 para cada matraz T25 preparado.
NOTA: Retire las meninges lo más completamente posible. Si queda una cantidad significativa de meninges, el fenotipo similar a los fibroblastos de las células meníngeas crecerá y abrumará el cultivo celular. Múltiples médulas espinales, de igual fenotipo, se pueden combinar para generar un cultivo celular específico. Tenga cuidado de asegurarse de que no se produzca un hacinamiento de las células, lo que puede conducir a la apoptosis glial y fenotipos diferenciales.
3. Disociación tisular
NOTA: Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un cultivo de tejido estéril designado gabinete de bioseguridad utilizando técnica aséptica y materiales estériles.
- Agregue 1 ml de tripsina al 0,05% que contenga 0,53 mM de EDTA a cada tubo cónico de 15 ml de 9 ml de DMEM y tejido para comenzar la lisis tisular.
NOTA: DMEM contiene una alta cantidad de cloruro de calcio, que puede actuar como un inhibidor de la tripsina. Si la disociación no se completa siguiendo los pasos descritos, se puede usar la solución salina equilibrada de Hanks sin calcio ni magnesio. Después de la tripsinización, la enzima puede neutralizarse agregando un inhibidor de tripsina, aunque el calcio debe agregarse nuevamente a la solución, ya que es un cofactor para la DNasa I, que se usa en los pasos posteriores. - Triturar con una pipeta de 10 ml aproximadamente 20x.
- Transfiera las suspensiones celulares a tubos cónicos vacíos de 50 ml.
- Incubar la solución a 37 °C, 5% deCO2 durante 15 min, agitando suavemente los lisados después de 8 min.
- Agregue 5 ml de MGM y 200 μL (5 mg/ml) de DNasa I a cada tubo para obtener una concentración final de 50 μg/ml.
- Triturar cada lisado con una pipeta de 10 ml 10x.
- Deje que las suspensiones celulares reposen durante 3 minutos a temperatura ambiente para permitir que el tejido no disociado se asiente en la parte inferior de los tubos.
- Transfiera las suspensiones celulares a nuevos tubos cónicos de 50 ml, dejando atrás el tejido no disociado.
NOTA: Los pasos de lisis y trituración descritos anteriormente limitan significativamente la cantidad de tejido no disociado. - Centrifugar los tubos a 300 x g durante 3 min a 4 °C sin freno.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos celulares restantes en 5 ml de MGM.
- Triturar el pellet con una pipeta de 5 ml 20x.
- Colocar en placa las suspensiones de 5 ml de células en matraces T25 recubiertos.
- Incubar las células a 37 °C, 5% deCO2 y cambiar de medio inicialmente después de 24 h para eliminar los restos celulares.
NOTA: Algunos protocolos recomiendan un cambio inicial de medios después de 72 h. Es posible que sea necesario optimizar este paso. - Realizar un cambio de media del 100% con MGM cada 48-72 h hasta que las células sean 80% confluentes (aproximadamente 5-7 días).
NOTA: Todos los soportes deben calentarse a 37 °C antes de que cambien los medios.
4. Aislamiento de microglía
- Una vez que los cultivos gliales mezclados hayan alcanzado el 80% de confluencia, prepare los matraces para agitar apretando las tapas y sellando con una película de parafina.
- Para eliminar la microglía de cultivos gliales mixtos, fijar los matraces horizontalmente en un agitador orbital dentro de una incubadora a 37 °C. Agitar matraces a 15 x g durante 1 h.
- Retire el medio y la pipeta en un tubo cónico de 15 ml. Enjuague los matraces dos veces con 3 ml de MGM caliente, agregando lavado a los tubos cónicos de 15 ml. Estas son las microglías.
- Agregue 5 ml de MGM caliente y fresco a los matraces de cultivo.
- Volver a sellar los matraces con película de parafina, fijar los matraces horizontalmente en el agitador y agitar a 15 x g a 37 °C durante 15 h para separar los OPC de los astrocitos.
NOTA: Este paso se puede hacer durante la noche, pero el tiempo de agitación de 15 h es crítico ya que el exceso de tiempo puede provocar la muerte celular. - Centrifugar el sobrenadante a partir del paso 4.3. a 300 x g durante 3 min y cultivo de microglía según protocolos estándar16 o uso para un ensayo biológico.
5. Aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos
NOTA: Al chapar OPC después del aislamiento inicial, deben estar chapados en una superficie recubierta de poli-D-lisina (placa estéril o cubreba). Prepare estos materiales antes de completar esta sección.
- Después de agitar 15 h, retirar el sobrenadante de los matraces y colocar en placa una placa de Petri estéril de 100 mm.
- Incubar el sobrenadante a 37 °C, 5% deCO2 durante 30 min, agitando después de 15 min para eliminar la microglía restante, ya que estos se adherirán muy rápidamente al plato. Se pueden usar placas de Petri no tratadas con cultivo de tejidos para este paso.
- Retire el sobrenadante celular no adherente, el recuento y la placa en una superficie recubierta de poli-D-lisina. Normalmente, 7.500-10.000 OPC están chapados/cm2.
- Incubar a 37 °C, 5% deCO2 durante al menos 1 h (hasta 6 h), luego aspirar suavemente el 95% de los medios y agregar lentamente medios OPC calientes, pipeteando los medios contra la pared del pozo para minimizar la interrupción de los OPC. Cambie los medios cada 48 h hasta que las celdas estén listas para su uso.
NOTA: Es fundamental que solo se cambie un pozo a la vez. Los OPC son sensibles y son especialmente intolerantes a las condiciones secas. La adición de PDGF-AA en medios OPC es para retrasar la maduración de OPC en oligodendrocitos. Este factor puede excluirse de los medios de cultivo si el foco experimental son los oligodendrocitos maduros.
6. Aislamiento de astrocitos
- Después de 15 h de agitación, retire el sobrenadante y enjuague los matraces 2x con 1x PBS tibio.
- Añadir 4 ml de tripsina al 0,05% que contenga 0,53 mM de EDTA e incubar a 37 °C, 5% deCO2 durante 5 min o hasta que las células se hayan levantado. Para asegurarse de que los astrocitos se hayan levantado, visualícelos usando un microscopio estándar de campo amplio. Los astrocitos aparecerán esféricos después de la tripsinización.
- Una vez que los astrocitos se hayan desprendido, coloque el matraz verticalmente y agregue 4 ml de MGM. Triturar para mezclar.
- Pipetear los astrocitos en un tubo cónico de 15 ml, centrifugar a 300 x g durante 5 min.
- Resuspender los astrocitos en medios de astrocitos y placa en la superficie recubierta de fibronectina como se describe en el paso 1.2. o uso para ensayo biológico.
NOTA: Se pueden agregar 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos murinos durante el primer cambio de medios para ayudar a establecer el cultivo de astrocitos. Además, el recubrimiento de gelatina estándar puede ser una alternativa de bajo costo a la fibronectina.
7. Identificación y aislamiento de microglía, OPC, astrocitos y oligodendrocitos maduros mediante inmunocitoquímica
- Una vez que las células en placa hayan alcanzado la confluencia adecuada, retire suavemente los medios y fije las células adherentes con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 minutos. Haga este paso en un gabinete de bioseguridad.
NOTA: Al aspirar o añadir soluciones, pipetear con una presión suave para evitar el desprendimiento de células. - Aspire lentamente PFA y luego lave las células 3x con 1x PBS durante 5 min.
- Prepare la solución de bloqueo adecuada utilizando suero al 10% y Triton X-100 al 0,1% en 1x PBS.
NOTA: La fuente de suero refleja el animal huésped en el que se crió el anticuerpo secundario. Por ejemplo, si el anticuerpo secundario es anti-conejo de cabra, el suero de bloqueo apropiado es suero de cabra normal. Del mismo modo, si el anticuerpo secundario es anti-conejo burro, el suero de bloqueo debe ser suero de burro normal. - Agregue solución de bloqueo hasta que las células estén completamente cubiertas. Bloquear durante 1 h a temperatura ambiente.
- Preparar una solución diluyente de anticuerpos (9 ml de 1x PBS, 0,01 g de albúmina sérica bovina, 30 μL Triton X-100). Alternativamente, los anticuerpos pueden diluirse en la solución bloqueante descrita en el paso 6.3.
- Diluir anticuerpos primarios específicos para lo siguiente en diluyente de anticuerpos o solución bloqueante:
- Microglia: molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba1) en una dilución 1:250 (2,4 μg/ml).
- OPC: antígeno neuronal/glial 2 (NG2) en una dilución 1:200 (5 μg/mL).
- Oligodendrocitos maduros: proteína básica de mielina (MBP) en una dilución 1:400 (la concentración depende del lote y puede ser necesaria la optimización).
- Astrocitos: proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una dilución 1:400 (0,25 μg/mL)17.
NOTA: No mezcle anticuerpos primarios criados en la misma especie.
NOTA: GFAP etiquetará de manera confiable los astrocitos de la sustancia blanca. Para los astrocitos de materia gris, puede ser necesario usar un marcador alternativo.
- Incubar el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C (es preferible agitar suavemente).
- Lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos para eliminar el anticuerpo primario.
- Incubar células con anticuerpos secundarios apropiados en una dilución 1:400 en diluyente de anticuerpos o solución bloqueante protegida de la luz.
NOTA: Los anticuerpos secundarios se conjugan con un fluoróforo que puede intercambiarse dependiendo de los parámetros del microscopio disponibles. Una vez que se hayan aplicado anticuerpos secundarios fluorescentes, protéjalos de la luz tanto como sea posible. - Incubar el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente, limitando la exposición a la luz.
- Lavar 3 veces con 1x PBS durante 5 minutos para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios.
- Para etiquetar los núcleos, use una solución 1:1,000 DAPI/PBS e incube las células durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos en la oscuridad.
- Para montar, aplique los medios de montaje y deje secar en la oscuridad antes de la obtención de imágenes.
NOTA: Los portaobjetos montados se pueden almacenar a temperatura ambiente durante 2-3 días. Para un almacenamiento prolongado, mueva las diapositivas a 4 °C. Imagen dentro de una semana para una señal máxima. Todas las imágenes representativas han sido fotografiadas en un microscopio confocal; sin embargo, también se recomiendan microscopios fluorescentes invertidos.
Representative Results
Los datos representativos que se muestran a continuación ilustran que la señalización de IFNγ influye en la diferenciación y maduración de OPC. Sin la presencia del receptor de IFNγ (IFNγR), las OPC corticales no se diferencian en oligodendrocitos mielinizantes maduros tan fácilmente, lo que se evidencia por la ausencia de tinción MBP (Figura 1). Dado que los oligodendrocitos y los astrocitos se derivan de un progenitor común, analizamos la expresión de GFAP, que etiqueta los astrocitos. Encontramos que las células deficientes en IFNγR expresan fuertemente GFAP, lo que sugiere que pueden estar adoptando un fenotipo astrocítico, corroborando informes anteriores19.
La evidencia adicional de heterogeneidad regional en las células del SNC se evidencia por la morfología variable de los astrocitos como se ve en los astrocitos de la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal (Figura 2). Cabe destacar que los astrocitos de la misma región también pueden exhibir heterogeneidad morfológica, lo que apoya la noción de que este subtipo glial es altamente dinámico. Las diferencias en la arquitectura celular sugieren diversidad funcional y, por lo tanto, la capacidad de aislar poblaciones gliales es necesaria para estudiar las respuestas fenotípicas en ausencia y presencia de estímulos microambientales.
Los oligodendrocitos son críticos para la mielinización de los axones neuronales y son necesarios para la reparación y función adecuada del SNC. Los OPC dan lugar a sus contrapartes maduras, por lo que es fundamental comprender la biología detrás de su capacidad para diferenciarse. La señalización de citoquinas influye significativamente en el comportamiento de las células madre e inmunes. Por lo tanto, es importante comprender cómo las respuestas regionales de las OPC pueden variar a la estimulación diferencial de citoquinas (Figura 3), lo que puede afectar su capacidad para diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes maduros.
Figura 1: Datos representativos que muestran la diferenciación de OPC en ratones WT e IFNγR-/- en presencia de IFNγ exógeno. Las OPC corticales se aislaron de ( A ) WT y (B) IFNγR-/- P4 crías de ratón siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Las células se trataron con 1 ng/ml de IFNγ durante 48 h, luego se fijaron y se tiñeron para delinear la diferenciación celular. Los OPC se etiquetaron para NG2 y GFAP para identificar aquellos que estaban adoptando un fenotipo astrocítico. Del mismo modo, los OPC también se etiquetaron para NG2 y MBP para identificar aquellos que se diferenciaban en oligodendrocitos maduros. Barra de escala = 20 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Datos representativos que demuestran heterogeneidad regional en la morfología de los astrocitos. Los astrocitos de la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal se aislaron de crías de ratón P4 utilizando el protocolo descrito anteriormente y se etiquetaron para GFAP (verde) por inmunocitoquímica después de 48 h en cultivo. Barra de escala = 20 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Datos representativos que demuestran respuestas diferenciales de OPC regionales a citocinas. Las OPC se aislaron del tronco encefálico y la médula espinal de crías de ratón P4 utilizando el protocolo descrito anteriormente. Las células se trataron con concentraciones crecientes (1-10 ng / ml) de ( A ) IFNγ o (B) interleucina (IL) -17 para investigar la influencia diferencial de las citoquinas en la capacidad de las OPC regionales para diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes. Después de una incubación de 48 h con citoquinas especificadas, las OPC se fijaron y marcaron para NG2 (verde) y MBP (rojo). Barra de escala = 20 μM. Los datos representan medias ± SEM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 por ANOVA de 2 vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| PBS/Solución antibiótica (PAS): | ||
| 1.0 ml | 100X antibiótico/antimicótico que contiene 10.000 unidades/ml de penicilina y 10.000 mg/ml de estreptomicina | |
| 25 mg/ml | Anfotericina B | |
| 99 ml | 1X PBS | |
| Medios Glia Mixtos (MGM) | ||
| 88 ml | 1X DMEM (glucosa alta, con L-glutamina, con piruvato de Na) | |
| 10 ml | FBS inactivado por calor | |
| 1.0 ml | L-Glutamina (100X) | |
| 1.0 ml | Antibiótico/Antimicótico | |
| Medios OPC (50 ml) | ||
| 49 ml | Medios neurobasales | |
| 1.0 ml | Suplemento B27 (50X) | |
| 10 ng/ml | PDGF-AA | |
| NOTA: PDGF-AA se agrega nuevo antes de cada cambio de medios. | ||
| Medios de astrocitos (1 L) | ||
| 764 ml | MEM con sales de Earle que contienen glutamina | |
| 36 ml | Glucosa (use 100 mg/ml para la concentración final de 20 mM) | |
| 100 ml | FBS inactivado por calor | |
| 100 ml | Suero de caballo inactivado por calor | |
| 10 ml | Glutamina (use 200 mM de caldo si no está incluido en el medio de stock) | |
| OPCIONAL: 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante de ratón | ||
| NOTA: Filtrar estéril todos los medios y almacenar a 4°C hasta que se utilice. | ||
Tabla 1: Buffer y recetas de medios.
Discussion
En este protocolo, describimos el aislamiento de las tres principales subpoblaciones de células gliales del SNC del ratón: microglía, OPC y astrocitos. Un revés importante para la investigación de enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias del SNC es la falta de células y tejidos humanos primarios, particularmente aquellos que son regionales y del mismo paciente. En la mayoría de los casos, las líneas celulares del SNC humano se derivan de células cancerosas transformadas e inmortalizadas que pueden no ser representaciones precisas de su comportamiento fisiológico normal20,21,22. Por lo tanto, se necesitan métodos alternativos para estudiar los fenotipos de células del SNC de manera controlada. Además, la diversidad de las poblaciones neurológicas de células gliales hace necesario investigar cada subtipo, tanto independientemente entre sí, como en condiciones de cocultivo para recapitular sus funciones celulares autónomas y no autónomas. Las células gliales tienen una amplia variedad de funciones críticas en el SNC que van desde el soporte neuronal23, el aprendizaje/cognición 24,25 y las respuestas inmunológicas del SNC26. Como tal, es necesario comprender las funciones moleculares y celulares de cada subpoblación glial en un contexto fisiológico y patológico. Para ello, proporcionamos aquí un método fiable para la extracción y aislamiento de subtipos de glía viables. Debido a las limitaciones prácticas y éticas en la investigación de sujetos humanos, los modelos animales son actualmente los sustitutos más relevantes para la biología de las células gliales humanas. En particular, los ratones son animales modelo ideales, ya que su genoma puede ser manipulado y analizado para diseccionar aún más los mecanismos moleculares particulares que subyacen a la salud y la enfermedad. Por lo tanto, la eliminación y separación exitosa de la microglía murina, OPC y astrocitos es una herramienta clave para investigar las funciones de la glía durante afecciones fisiológicas, neurodegenerativas o neuroinflamatorias.
Este protocolo se puede optimizar para explorar la heterogeneidad regional de las células del SNC. Cada vez está más claro que la glía exhibe heterogeneidad regional en forma y función. Los astrocitos son regionalmente diversos y muestran una morfología distinta dependiendo de su ubicación dentro del SNC27. Además, la densidad de los astrocitos y su índice mitótico pueden definir regiones anatómicas, apoyando la hipótesis de que la heterogeneidad regional de los astrocitos puede reflejar diferencias moleculares y funcionales basadas en su ubicación dentro del SNC28. La heterogeneidad regional microglial también está bajo investigación activa, aunque los mecanismos subyacentes y las consecuencias funcionales de la diversidad de microglia en el desarrollo o comportamiento del SNC actualmente no están claros. Sin embargo, se sabe que la microglía adulta muestra diversidad en número celular, estructuras celulares y subcelulares, y firmas moleculares29. Además, los avances recientes en citometría de masas multiplexadas han definido aún más la heterogeneidad regional de la microglía, analizando el fenotipo celular de cinco regiones diferentes del SNC de nueve donantes humanos, lo que permite el inmunofenotipado a gran escala de la microglía humana30. Actualmente, tales enfoques se encuentran en sus etapas iniciales, lo que hace que los estudios en animales sean una solución viable para el estudio de la glía regional en el desarrollo de enfermedades del SNC. Finalmente, recientemente también se ha descrito heterogeneidad regional en oligodendrocitos. La secuenciación de ARN unicelular en 5072 células individuales de 10 regiones del SNC juvenil y adulto identificó 13 subpoblaciones distintas en diferentes etapas de diferenciación31. Es importante destacar que también se encontró que a medida que los oligodendrocitos maduraron a partir de OPC, sus perfiles transcripcionales divergieron y sus fenotipos funcionales cambiaron, destacando la heterogeneidad de oligodendrocitos dentro del SNC31.
Por lo tanto, comprender la heterogeneidad regional de las diversas células residentes del SNC en el contexto de sus diversas neuronas vecinas y otras glías puede proporcionar una justificación importante para el desarrollo futuro de nuevas terapias para tratar trastornos neuroinflamatorios y neurodegenerativos. Si bien este protocolo se centra en la extracción, aislamiento e identificación de subpoblaciones gliales, proporciona un punto de partida conveniente para el examen de su función. Además, se puede adaptar y combinar con modelos de ratón transgénico para estudiar los mecanismos genéticos asociados con la biología de las células gliales. También se puede utilizar para examinar las respuestas de las células gliales entre sí en ensayos de cocultivo. Los pasos descritos representan un método rentable y de alto rendimiento para extraer y aislar diferentes poblaciones gliales del SNC que luego se pueden adaptar a una amplia variedad de parámetros experimentales. Cabe señalar; Sin embargo, que el método descrito aquí utiliza neonatos debido a los niveles más bajos de mielinización y la alta densidad de la glía proliferante. Por estas razones, es técnicamente más factible aislar la glía viable de los recién nacidos en comparación con los animales adultos. Por lo tanto, las diferencias fenotípicas en la glía neonatal en comparación con la glía adulta deben considerarse durante el diseño experimental y la interpretación de los datos.
Disclosures
Los autores tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Morgan Psenicka por la edición y discusión del manuscrito y al Dr. Grahame Kidd por su ayuda en el formato de la figura. Este trabajo fue apoyado por NIAID K22 AI125466 (JLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
| 12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
| 50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
| B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
| DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
| Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
| Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
| Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
| Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
| Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
| L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
| Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
| Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
| Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
| Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
| Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
| Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
| Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
| Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
| Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
| Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
| Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
| Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |
References
- Fields, R. D., et al. Glial Biology in Learning and Cognition. The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Nuriya, M., Hirase, H.
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).
- Kierdorf, K., Prinz, M.
- Hertz, L., Chen, Y. Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning. Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).
- Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).
- Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R.
- Sharif, Y., et al. Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease. Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).
- von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. Glial Cells and Integrity of the Nervous System. Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H.
- Liu, R., et al. Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor. Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Witting, A., Moller, T. Microglia cell culture: a primer for the novice. Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).
- Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma. Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).
- Stevens, B. Glia: much more than the neuron's side-kick. Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).
- Fields, R. D., et al. Glial biology in learning and cognition. Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).
- Hartenstein, V., Giangrande, A. Connecting the nervous and the immune systems in evolution. Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).
- Emsley, J. G., Macklis, J. D. Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS. Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).
- Chaboub, L. S., Deneen, B. Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development. Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bottcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).
- Marques, S., et al. Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system. Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).
