Summary
Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.
Abstract
De hier gepresenteerde methoden demonstreren laboratoriumprocedures voor de dissectie van vier verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel (CZS) van muizenne neonaten voor de isolatie van gliale subpopulaties. Het doel van de procedure is om microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC's) en astrocyten uit corticale, cerebellaire, hersenstam- en ruggenmergweefsel te dissociëren om verdere in vitro analyse te vergemakkelijken. De CNS-regio-isolatieprocedures maken het mogelijk om regionale heterogeniteit tussen glia in meerdere celkweeksystemen te bepalen. Snelle CZS-regio-isolatie wordt uitgevoerd, gevolgd door de mechanische verwijdering van hersenvliezen om meningeale celverontreiniging van glia te voorkomen. Dit protocol combineert zachte weefseldissociatie en plating op een gespecificeerde matrix die is ontworpen om de celintegriteit en -hechting te behouden. Het isoleren van gemengde glia uit meerdere CZS-regio's biedt een uitgebreide analyse van potentieel heterogene glia terwijl het gebruik van individuele proefdieren wordt gemaximaliseerd. Bovendien, na dissociatie van regionaal weefsel, worden gemengde glia verder onderverdeeld in meerdere celtypen, waaronder microglia, OPC's en astrocyten voor gebruik in een enkel celtype, celkweekplaatinzetstukken of co-kweeksystemen. Over het algemeen bieden de gedemonstreerde technieken een uitgebreid protocol van brede toepasbaarheid voor zorgvuldige dissectie van vier individuele CZS-regio's van muizenne neonaten en omvatten ze methoden voor de isolatie van drie individuele gliaceltypen om regionale heterogeniteit in een willekeurig aantal in vitro celkweeksystemen of -testen te onderzoeken.
Introduction
Glia zijn noodzakelijk voor een goede neuronale functie in het CZS. Ze zijn samengesteld uit drie grote subpopulaties, astrocyten, oligodendrocyten en microglia, elk met een andere, maar onmisbare rol1. Zonder de juiste gliaceldiversiteit en -activiteit zou de neuronale functie ernstig worden beïnvloed, wat leidt tot CZS-stoornissen. Glia zijn in staat om neurotransmissie te beïnvloeden, en elk celtype doet dit op een unieke manier. Gliacellen in de hersenen hebben het vermogen om onderling te communiceren, evenals met neuronale cellen, om een goede CZS-functie te vergemakkelijken2. Oligodendrocyten verhogen de snelheid van elektrische transmissie door de vorming van een myelineschede, die de clustering van ionkanalen op de knooppunten van Ranvier, de plaatsen van neuronale actiepotentiaalgeneratie3, vergemakkelijkt. Microglia zijn van cruciaal belang voor het snoeien van synapsen door synaptische transmissie te monitoren en neuronale verbindingen na verwonding te "herbedradigen"4. Bovendien zijn microglia de meest voorkomende residente immuuncel van het CZS, die fungeert als de primaire vorm van gastheerverdediging tegen pathogenen5. Astrocyten kunnen de synaptische transmissie tussen neuronen reguleren door de concentratie van extracellulair kalium6 te wijzigen. Ze hebben ook een rol bij het beheersen van de lokale bloedstroom7, het vrijgeven en opnemen van neuromodulerende elementen8, en hebben een sleutelrol in het onderhoud van de bloed-hersenbarrière9. Elk gliaal subtype is dus van cruciaal belang voor de CNS-functie, omdat defecten in elk type al lang in verband worden gebracht met een breed scala aan pathologische toestanden, waaronder psychiatrische ziekten, epilepsie en neurodegeneratieve aandoeningen10.
Het grootste obstakel in de studie van CNS-pathobiologie is het onvermogen om menselijke cellen te onderzoeken in de context van hun micro-ecologische niche. Menselijk biopsieweefsel wordt het meest postmortem verzameld en cellen kunnen gemakkelijk worden beschadigd of verloren gaan tijdens de extractie en verwerking. Bovendien is het een uitdaging om menselijke cellen gedurende enige tijd in leven en levensvatbaar te houden zonder onsterfelijke cellijnen uit tumoren af te leiden, op welk moment ze niet langer nauwkeurig hun normale fysiologische eigenschappen weerspiegelen 11,12. Bovendien is er een aanzienlijke hoeveelheid regionale heterogeniteit tussen individuele gliaceltypen 13,14,15, en het verkrijgen van regionale CZS-monsters van individuele patiënten is bijna onmogelijk. Als zodanig is het noodzakelijk om alternatieve modellen te ontwikkelen om de bijdrage van regionale glia in specifieke CZS-aandoeningen te bestuderen.
Hier beschrijven we een in vitro systeem met behulp van muis CNS regio-specifieke isolatie van meerdere gliale subpopulaties, waardoor de manipulatie en kwantificering van microglia, oligodendrocyte precursor cellen (OPC's), die aanleiding geven tot volwassen oligodendrocyten, en astrocyten mogelijk maken. Elke populatie kan onafhankelijk worden geïsoleerd en onderworpen aan een breed scala aan experimentele technieken, waaronder behandeling van geneesmiddelen of moleculen, immunocytochemie, eiwit / RNA-extractie en -analyse en andere co-kweeksystemen, afhankelijk van de experimentele noodzaak. Bovendien levert deze isolatietechniek een hoog celgetal op, waardoor elke gliale populatie op een manier met hoge doorvoer kan worden gekarakteriseerd en onderzocht. Het maakt ook de studie van CNS-celdifferentiatie, groei en proliferatie mogelijk als reactie op een breed scala aan micro-omgevingsstimuli op een gecontroleerde manier om verstorende factoren te voorkomen die typisch aanwezig zijn in een in vivo omgeving. Ten slotte vergemakkelijkt deze celisolatietechniek de manipulatie van gliacelpopulaties binnen verschillende CZS-regio's om te onderzoeken hoe regionale glia met elkaar interageren en reageren op verschillende stimuli, waardoor precisie en reproduceerbaarheid mogelijk zijn.
Protocol
OPMERKING: Alle dierstudies zijn geautoriseerd en goedgekeurd door het Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Bereid media en benodigdheden voor op dissectie
OPMERKING: Alle buffer- en mediarecepten zijn opgenomen in tabel 1. Deze procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een door weefselkweek aangewezen bioveiligheidskast.
- Bereid en steriel filter mixed glia media (MGM). Dit kan de dag ervoor en bewaard worden bij 4 °C.
- Verdun fibronectine in een concentratie van 1:100 met steriel H2O. Het volume verdunde fibronectine is afhankelijk van het aantal jongen en het CZS-gebied dat voor het experiment wordt gebruikt. Gebruik een T25-kolf voor 1 cortex, een T25-kolf voor 2-4 cerebella, een T25-kolf voor 2-4 hersenstengels en een T25-kolf voor 2-4 ruggenmerg.
OPMERKING: Het combineren van weefsel uit dezelfde regio met behulp van de hierboven genoemde criteria zal adequate dissociatie mogelijk maken zonder het hieronder beschreven protocol te wijzigen. Het combineren van meer weefsel dan beschreven in stap 1.2 vereist verdere optimalisatie van dissociatiereagensconcentraties. - Pipetteer 3 ml verdunde fibronectine in T25-kolven bij kamertemperatuur en laat 2 minuten zitten.
- Aspirateer de fibronectine en laat kolven een nacht drogen met het deksel van de kolf losgemaakt.
2. Cortex, cerebellum, hersenstam en ruggenmergresectie
OPMERKING: Deze procedure kan op de benchtop worden uitgevoerd en vereist een dissectiebereik. Gebruik een strikte aseptische techniek voor alle stappen van de procedure en minimaliseer de blootstelling van weefsel aan de kamerlucht. Houd alle media gekoeld op ijs tijdens de dissectie om maximaal weefselbehoud te garanderen. Als alternatief kan deze procedure worden uitgevoerd in een kap die het gebruik van een interne dissectiescope mogelijk maakt.
- Veeg alle gebieden af met 70% ethanol.
- Pipetteer 10 ml PBS/antibioticumoplossing (PAS) in een petrischaaltje van 10 cm. Bereid één petrischaaltje voor elke pup die moet worden ontleed. Zet op ijs om de oplossing gekoeld te houden.
- Pipetteer in een gedesinfecteerde weefselkweekkap 9 ml DMEM (zonder toevoegingen) in 4 afzonderlijke conische buizen van 15 ml, één voor elk CNS-gebied, vervang buisdoppen en zet op ijs. Plaats een ijsemmer met buizen binnen handbereik van de dissectiescope.
- Plaats de petrischaal van 10 cm, bereid in stap 2.2, op de gedesinfecteerde dissectieschaal.
- Verdoof en euthanaseer muizenjong volgens institutioneel protocol en verwijder het hoofd door snelle onthoofding met een scherpe schaar.
OPMERKING: Postnatale dag (P) 3-5 pups worden gebruikt. Oudere pups hebben een meer ontwikkeld CZS en zijn mogelijk geen adequate bron van uitdijende gliacellen. Jongere pups (P) 0-2 kunnen een hoger aantal glia opleveren en kunnen worden gebruikt; ruggenmergweefsel is echter erg moeilijk te ontleden op deze jonge leeftijd vanwege de grootte. - Reinig de huid van de pup met 70% ethanol.
- Knip met een fijne schaar de cutane laag langs de middellijn van het hoofd van het dier, begin caudaal en beweeg rostral, totdat de snuit wordt bereikt. Vermijd diep in de schedel te snijden om weefselschade te voorkomen.
- Hengel het hoofd naar beneden, trek de huidlaag naar elke kant van de schedel en gebruik een veerschaar, maak een incisie langs de middellijn van de schedel, beginnend bij het foramen magnum, opnieuw caudaal tot rostral snijdend.
- Trek met een tang met fijne punt de schedelhelften naar de rechter- en linkerkant, waardoor de cortex, het cerebellum en de hersenstam worden blootgesteld.
- Eenmaal blootgesteld, til de hersenen voorzichtig uit de schedel en in de petrischaal van 10 cm die in stap 2.2 is bereid. Zorg ervoor dat de hersenen onbeschadigd blijven om de anatomische structuur te behouden, met de achterhersenen bevestigd.
- Gebruik fijne, gebogen tippen met de punt van de tang naar boven gericht, knijp het cerebellum af. Verwijder de hersenvliezen en plaats in de daarvoor bestemde conische buis van 15 ml in een ijsemmer.
- Zorg ervoor dat de hersenstam direct ventraal is naar het cerebellum en zichtbaar is na verwijdering van het cerebellum. Verwijder het met een fijne tang, verwijder hersenvliezen en plaats het in de daarvoor bestemde conische buis van 15 ml in een ijsemmer.
- Scheid de middenhersenen van de cortex, verwijder corticale hersenvliezen en plaats in de aangewezen conische buis van 15 ml in een ijsemmer.
- Om het ruggenmerg te verwijderen, plaatst u de onthoofde muisjong in rugligging (liggend met het gezicht naar boven) met de afgehakte wervelkolom verhoogd naar de onderzoeker.
- Spuit opnieuw met 70% ethanol.
- Snijd langs de zijkanten van de wervelkolom, in een rostrale tot caudale richting, door de ribbenkast totdat de achterpoten worden bereikt. Duw tijdens het snijden de inwendige organen terug totdat de wervelkolom zichtbaar is.
- Snijd langs elke zijdelingse zijde van de wervelkolom totdat deze is geïsoleerd en plaats deze in de petrischaal van 10 cm die in stap 2.2 is bereid.
- Met ventrale kant omhoog, met behulp van een fijne veerschaar, afwisselend het snijden van de rechter- en linkerkant van elke wervel totdat het lumbale gebied wordt bereikt om het ruggenmergweefsel bloot te leggen.
- Verwijder voorzichtig het ruggenmerg en de hersenvliezen met een fijne tiptang onder de ontleedmicroscoop. Plaats in de aangewezen conische buis van 15 ml in een ijsemmer.
- Herhaal stap 2.5.-2.19 voor elk jong, waarbij weefsel uit hetzelfde gebied wordt gecombineerd om te voldoen aan de criteria die zijn uiteengezet in stap 1.2 voor elke bereide T25-kolf.
LET OP: Verwijder de hersenvliezen zo volledig mogelijk. Als er een aanzienlijke hoeveelheid hersenvliezen achterblijft, zal het fibroblastachtige fenotype van meningeale cellen de celcultuur ontgroeien en overweldigen. Meerdere ruggenmerg, van hetzelfde fenotype, kunnen worden gecombineerd om een specifieke celcultuur te genereren. Zorg ervoor dat er geen overbevolking van cellen optreedt, wat kan leiden tot gliale apoptose en differentiële fenotypen.
3. Weefseldissociatie
OPMERKING: Alle volgende procedures worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek aangewezen bioveiligheidskast met behulp van aseptische techniek en steriele materialen.
- Voeg 1 ml 0,05% trypsine met 0,53 mM EDTA toe aan elke 15 ml conische buis van 9 ml DMEM en weefsel om weefsellysis te beginnen.
OPMERKING: DMEM bevat een grote hoeveelheid calciumchloride, die kan fungeren als een remmer van trypsine. Als de dissociatie niet volledig is volgens de beschreven stappen, kan Hanks' Balanced Salt Solution zonder calcium of magnesium worden gebruikt. Na trypsinisatie kan het enzym worden geneutraliseerd door een trypsineremmer toe te voegen, hoewel calcium terug aan de oplossing moet worden toegevoegd omdat het een cofactor is voor DNase I, dat in volgende stappen wordt gebruikt. - Triturate met een 10 ml pipet ongeveer 20x.
- Breng de celsuspensies over in lege conische buizen van 50 ml.
- Incubeer de oplossing bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 15 minuten en roer de lysaten na 8 minuten voorzichtig.
- Voeg 5 ml MGM en 200 μL (5 mg/ml) DNase I toe aan elke buis voor een eindconcentratie van 50 μg/ml.
- Trituur elk lysaat met een 10 ml pipet 10x.
- Laat de celsuspensies 3 minuten op kamertemperatuur zitten om niet-gedissocieerd weefsel aan de onderkant van de buizen te laten bezinken.
- Breng de celsuspensies over naar nieuwe conische buizen van 50 ml, waarbij het niet-gedissocieerde weefsel achterblijft.
OPMERKING: De hierboven beschreven lysis- en trituratiestappen beperken de hoeveelheid niet-gedissocieerd weefsel aanzienlijk. - Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C zonder rem.
- Aspirateer het supernatant en resuspendeer de resterende celpellets in 5 ml MGM.
- Trituur de pellet met een 5 ml pipet 20x.
- Plaats de 5 ml celsuspensies op gecoate T25-kolven.
- Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 en verander in eerste instantie na 24 uur van media om celresten te verwijderen.
OPMERKING: Sommige protocollen raden een eerste mediawijziging na 72 uur aan. Optimalisatie van deze stap kan nodig zijn. - Voer elke 48-72 uur een 100% mediaverandering uit met MGM totdat cellen 80% confluent zijn (ongeveer 5-7 dagen).
OPMERKING: Alle media moeten worden opgewarmd tot 37 °C voordat de media veranderen.
4. Microglia isolatie
- Zodra gemengde gliaculturen 80% samenvloeiing hebben bereikt, bereidt u kolven voor op schudden door deksels aan te spannen en af te sluiten met paraffinefilm.
- Om microglia uit gemengde gliaculturen te verwijderen, bevestigt u kolven horizontaal op een orbitale schudder in een incubator van 37 °C. Schud kolven op 15 x g gedurende 1 uur.
- Verwijder de media en pipet in een conische buis van 15 ml. Spoel kolven twee keer met 3 ml warme MGM en voeg was toe aan de conische buizen van 15 ml. Dit zijn de microglia.
- Voeg 5 ml warme, verse MGM toe aan de kweekkolven.
- Hersluitkolven met paraffinefilm, zet kolven horizontaal vast op de schudder en schud bij 15 x g bij 37 °C gedurende 15 uur voor scheiding van OPC's van astrocyten.
OPMERKING: Deze stap kan 's nachts worden uitgevoerd, maar de schudtijd van 15 uur is van cruciaal belang omdat overmatige tijd kan leiden tot celdood. - Centrifugeer het supernatant uit stap 4.3. bij 300 x g gedurende 3 min en kweek microglia volgens standaardprotocollen16 of gebruik voor een biologische test.
5. Oligodendrocyten precursor celisolatie
OPMERKING: Bij het plateren van OPC's na de eerste isolatie, moeten ze worden verguld op een poly-D-lysine-gecoat oppervlak (steriele plaat of afdekslip). Bereid deze materialen voor voordat deze sectie is voltooid.
- Verwijder na 15 uur schudden het supernatant uit de kolven en leg op steriele petrischaal van 100 mm.
- Incubeer het supernatant bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 minuten, wervel na 15 minuten om resterende microglia te verwijderen, omdat deze zich zeer snel aan het gerecht hechten. Voor deze stap kunnen niet met weefselkweek behandelde petrischalen worden gebruikt.
- Verwijder niet-hechtende celsupernatant, telling en plaat op een poly-D-lysine-gecoat oppervlak. Meestal zijn 7.500-10.000 OPC's verguld / cm2.
- Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ten minste 1 uur (tot 6 uur), adem vervolgens voorzichtig 95% van de media op en voeg langzaam warme OPC Media toe, waarbij media tegen de wand van de put worden gepipetteerd om verstoring van OPC's tot een minimum te beperken. Wissel de media om de 48 uur totdat de cellen klaar zijn voor gebruik.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat slechts één put tegelijk wordt gewijzigd. OPC's zijn gevoelig en zijn vooral intolerant voor droge omstandigheden. De toevoeging van PDGF-AA in OPC-media is om de OPC-rijping in oligodendrocyten te vertragen. Deze factor kan worden uitgesloten van kweekmedia als de experimentele focus volwassen oligodendrocyten is.
6. Astrocyten isolatie
- Na 15 uur schudden, supernatant verwijderen en kolven 2x spoelen met warme 1x PBS.
- Voeg 4 ml 0,05% trypsine met 0,53 mM EDTA toe en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 5 minuten of totdat de cellen zijn opgeheven. Om ervoor te zorgen dat astrocyten zijn opgetild, visualiseer je ze met behulp van een standaard breedveldmicroscoop. Astrocyten zullen bolvormig lijken na trypsinisatie.
- Zodra astrocyten zijn losgemaakt, zet u de kolf verticaal en voegt u 4 ml MGM toe. Triturate om te mengen.
- Pipetteer astrocyten in een conische buis van 15 ml, centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.
- Resuspendeert astrocyten in Astrocyte Media en plaat op fibronectine-gecoat oppervlak zoals beschreven in stap 1.2. of gebruik voor biologische testen.
OPMERKING: 20 ng / ml murine fibroblastgroeifactor kan worden toegevoegd tijdens de eerste mediaverandering om de astrocytencultuur te helpen vaststellen. Bovendien kan standaard gelatinecoating een goedkoop alternatief zijn voor fibronectine.
7. Identificatie en isolatie van microglia, OPC's, astrocyten en volwassen oligodendrocyten met behulp van immunocytochemie
- Zodra de vergulde cellen de juiste confluentie hebben bereikt, verwijdert u voorzichtig media en fixeert u hechtende cellen met behulp van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten. Doe deze stap in een bioveiligheidskast.
OPMERKING: Pipet bij het aanzuigen of toevoegen van oplossingen met zachte druk om celloslating te voorkomen. - Spoel PFA langzaam aan en was vervolgens cellen 3x met 1x PBS gedurende 5 min.
- Bereid de juiste blokkeringsoplossing met 10% serum en 0,1% Triton X-100 in 1x PBS.
OPMERKING: De serumbron weerspiegelt het gastheerdier waarin het secundaire antilichaam is opgewekt. Als het secundaire antilichaam bijvoorbeeld geitenantikonijn is, is het juiste blokkerende serum normaal geitenserum. Evenzo, als het secundaire antilichaam ezel anti-konijn is, moet het blokkerende serum normaal ezelsserum zijn. - Voeg de blokkerende oplossing toe totdat de cellen volledig zijn bedekt. Blok gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid een antilichaam verdunningsoplossing (9 ml 1x PBS, 0,01 g runderserumalbumine, 30 μL Triton X-100). Als alternatief kunnen antilichamen worden verdund in de blokkerende oplossing die is beschreven in stap 6.3.
- Verdun primaire antilichamen die specifiek zijn voor het volgende in antilichaamverdunningsmiddel of blokkerende oplossing:
- Microglia: geïoniseerd calciumbindend adaptermolecuul 1 (Iba1) bij een verdunning van 1:250 (2,4 μg/ml).
- OPC's: neuraal/gliaal antigeen 2 (NG2) bij een verdunning van 1:200 (5 μg/ml).
- Rijpe oligodendrocyten: myeline basiseiwit (MBP) bij een verdunning van 1:400 (concentratie is partijafhankelijk en optimalisatie kan nodig zijn).
- Astrocyten: glial fibrillary acidic protein (GFAP) bij een verdunning van 1:400(0,25 μg/ml)17.
OPMERKING: Meng geen primaire antilichamen die bij dezelfde soort zijn gekweekt.
OPMERKING: GFAP zal op betrouwbare wijze witte stof astrocyten labelen. Voor astrocyten van grijze stof moet mogelijk een alternatieve marker worden gebruikt.
- Incubeer primair antilichaam 's nachts bij 4 °C (bij zachte agitatie heeft de voorkeur).
- Was 3x met 1x PBS gedurende 5 minuten om het primaire antilichaam te verwijderen.
- Incubeer cellen met geschikte secundaire antilichamen bij een verdunning van 1:400 in antilichaamverdunningsmiddel of blokkerende oplossing beschermd tegen licht.
OPMERKING: Secundaire antilichamen worden geconjugeerd aan een fluorofoor die kan worden verwisseld afhankelijk van de beschikbare microscoopparameters. Zodra fluorescerende secundaire antilichamen zijn aangebracht, beschermt u zoveel mogelijk tegen licht. - Incubeer secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, waardoor de blootstelling aan licht wordt beperkt.
- Was 3 keer met 1x PBS gedurende 5 minuten om overtollig secundair antilichaam te verwijderen.
- Om kernen te labelen, gebruikt u een 1:1.000 DAPI/PBS-oplossing en incubeert u cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Was 3x met 1x PBS gedurende 5 min in het donker.
- Om te monteren, brengt u montagemedia aan en laat u in het donker drogen voordat u beeld krijgt.
OPMERKING: Gemonteerde dia's kunnen 2-3 dagen bij kamertemperatuur worden bewaard. Verplaats voor langdurige opslag dia's naar 4 °C. Beeld binnen een week voor maximaal signaal. Alle representatieve beelden zijn in beeld gebracht op een confocale microscoop; omgekeerde fluorescerende microscopen worden echter ook aanbevolen.
Representative Results
Representatieve gegevens die hieronder worden weergegeven, illustreren dat IFNγ-signalering opc-differentiatie en rijping beïnvloedt. Zonder de aanwezigheid van IFNγ-receptor (IFNγR) differentiëren corticale OPC's niet zo gemakkelijk in volwassen myeliniserende oligodendrocyten, wat blijkt uit de afwezigheid van MBP-kleuring (figuur 1). Omdat oligodendrocyten en astrocyten zijn afgeleid van een gemeenschappelijke voorloper, hebben we GFAP-expressie geanalyseerd, die astrocyten labelt. We ontdekten dat IFNγR-deficiënte cellen sterk GFAP tot expressie brengen, wat suggereert dat ze mogelijk een astrocytisch fenotype aannemen, wat eerdere rapporten bevestigt19.
Aanvullend bewijs voor regionale heterogeniteit in CZS-cellen wordt aangetoond door verschillende astrocytenmorfologie zoals gezien in astrocyten uit de cortex, het cerebellum, de hersenstam en het ruggenmerg (figuur 2). Van belang is dat astrocyten uit hetzelfde gebied ook morfologische heterogeniteit kunnen vertonen, wat het idee ondersteunt dat dit gliale subtype zeer dynamisch is. De verschillen in cellulaire architectuur zijn suggestief voor functionele diversiteit en dus is het vermogen om gliale populaties te isoleren noodzakelijk om fenotypische reacties te bestuderen in afwezigheid en aanwezigheid van micro-omgevingsstimuli.
Oligodendrocyten zijn van cruciaal belang voor de myelinisatie van neuronale axonen en zijn noodzakelijk voor een goede czs-reparatie en -functie. OPC's geven aanleiding tot hun volwassen tegenhangers, waardoor het van cruciaal belang is om de biologie achter hun vermogen om te differentiëren te begrijpen. Cytokinesignalering beïnvloedt het gedrag van stamcellen en immuuncellen aanzienlijk. Het is dus belangrijk om te begrijpen hoe regionale responsen van OPC's kunnen variëren tot differentiële cytokinestimulatie (figuur 3), wat van invloed kan zijn op hun vermogen om te differentiëren in volwassen myeliniserende oligodendrocyten.
Figuur 1: Representatieve gegevens die OPC-differentiatie laten zien in WT- en IFNγR-/- muizen in aanwezigheid van exogene IFNγ. Corticale OPC's werden geïsoleerd uit (A) WT en (B) IFNγR-/- P4 muisjongen volgens de hierboven beschreven procedure. Cellen werden behandeld met 1 ng / ml IFNγ gedurende 48 uur, vervolgens gefixeerd en gekleurd om celdifferentiatie af te bakenen. OPC's werden gelabeld voor NG2 en GFAP om degenen te identificeren die een astrocytisch fenotype aannamen. Evenzo werden OPC's ook gelabeld voor NG2 en MBP om degenen te identificeren die onderscheidden in volwassen oligodendrocyten. Schaalbalk = 20 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve gegevens die regionale heterogeniteit in astrocytenmorfologie aantonen. Astrocyten uit cortex, cerebellum, hersenstam en ruggenmerg werden geïsoleerd uit P4-muispups met behulp van het hierboven beschreven protocol en gelabeld voor GFAP (groen) door immunocytochemie na 48 uur in cultuur. Schaalbalk = 20 μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve gegevens die differentiële responsen van regionale OPC's op cytokines aantonen. OPC's werden geïsoleerd uit de hersenstam en het ruggenmerg van P4-muizenpups met behulp van het hierboven beschreven protocol. Cellen werden behandeld met toenemende concentraties (1-10 ng/ml) van (A) IFNγ of (B) interleukine (IL)-17 om de differentiële invloed van cytokine op het vermogen van regionale OPC's om te differentiëren in myeliniserende oligodendrocyten te onderzoeken. Na een incubatie van 48 uur met gespecificeerde cytokines werden OPC's gefixeerd en gelabeld voor NG2 (groen) en MBP (rood). Schaalbalk = 20 μM. Gegevens vertegenwoordigen ± SEM. **, p < 0.01; , blz < 0,001; , p < 0,0001 door 2-weg ANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| PBS/Antibioticum Oplossing (PAS): | ||
| 1,0 ml | 100X Antibioticum / Antimycotic met 10.000 eenheden / ml penicilline en 10.000 mg / ml streptomycine | |
| 25 mg/ml | Amfotericine B | |
| 99 ml | 1x PBS | |
| Gemengde Glia Media (MGM) | ||
| 88 ml | 1X DMEM (hoge glucose, w / L-glutamine, w / Na pyruvaat) | |
| 10 ml | Warmte-geïnactiveerde FBS | |
| 1,0 ml | L-Glutamine (100x) | |
| 1,0 ml | Antibioticum/antimycotisch | |
| OPC Media (50 ml) | ||
| 49 ml | Neurobasale media | |
| 1,0 ml | B27 supplement (50X) | |
| 10 ng/ml | PDGF-AA | |
| OPMERKING: PDGF-AA wordt voorafgaand aan elke mediawijziging opnieuw toegevoegd. | ||
| Astrocyte Media (1 L) | ||
| 764 ml | MEM met Earle's zouten die glutamine bevatten | |
| 36 ml | Glucose (gebruik 100 mg/ml voorraad voor de uiteindelijke concentie van 20 mM) | |
| 100 ml | Warmte-geïnactiveerde FBS | |
| 100 ml | Warmte-geïnactiveerd paardenserum | |
| 10 ml | Glutamine (gebruik 200 mM voorraad indien niet opgenomen in voorraadmedium) | |
| OPTIONEEL: 10 ng/ml recombinante epidermale groeifactor van de muis | ||
| OPMERKING: Steriel filter alle media en bewaar bij 4°C tot gebruik. | ||
Tabel 1: Buffer- en mediarecepten.
Discussion
In dit protocol beschrijven we de isolatie van de drie belangrijkste gliacelsubpopulaties van het CZS van muizen: microglia, OPC's en astrocyten. Een belangrijke tegenslag voor het onderzoek naar neurodegeneratieve en neuro-inflammatoire CZS-ziekten is het ontbreken van primaire menselijke cellen en weefsels, met name die welke regionaal zijn en van dezelfde patiënt. In de meeste gevallen zijn menselijke CZS-cellijnen afgeleid van getransformeerde, onsterfelijk gemaakte kankercellen die mogelijk geen nauwkeurige weergaven zijn van hun normale fysiologische gedrag 20,21,22. Er zijn dus alternatieve methoden nodig om CZS-celfenotypen op een gecontroleerde manier te bestuderen. Bovendien maakt de diversiteit van neurologische gliacelpopulaties het noodzakelijk om elk subtype zowel onafhankelijk van elkaar als in co-kweekomstandigheden te onderzoeken om zowel hun celautonoom als niet-autonome functies opnieuw samen te vatten. Gliacellen hebben een breed scala aan kritieke functies in het CZS, variërend van neuronale ondersteuning23, leren / cognitie24,25 en CNS immunologische responsen26. Als zodanig is het noodzakelijk om de moleculaire en cellulaire functies van elke gliale subpopulatie in een fysiologische en pathologische context te begrijpen. Om dit te doen, bieden we hier een betrouwbare methode voor de extractie en isolatie van levensvatbare glia-subtypen. Vanwege praktische en ethische beperkingen in het onderzoek van menselijke proefpersonen, zijn diermodellen momenteel de meest relevante surrogaten voor menselijke gliacelbiologie. In het bijzonder zijn muizen ideale modeldieren omdat hun genoom kan worden gemanipuleerd en geanalyseerd om bepaalde moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gezondheid en ziekte verder te ontleden. Daarom is de succesvolle verwijdering en scheiding van murine microglia, OPC's en astrocyten een belangrijk hulpmiddel om de functies van glia te onderzoeken tijdens fysiologische, neurodegeneratieve of neuro-inflammatoire aandoeningen.
Dit protocol kan worden geoptimaliseerd om de regionale heterogeniteit van CNS-cellen te onderzoeken. Het wordt steeds duidelijker dat glia regionale heterogeniteit in vorm en functie vertonen. Astrocyten zijn regionaal divers en vertonen een duidelijke morfologie, afhankelijk van hun locatie binnen het CZS27. Bovendien kan de dichtheid van astrocyten en hun mitotische index anatomische regio's definiëren, wat de hypothese ondersteunt dat regionale astrocyten heterogeniteit moleculaire en functionele verschillen kan weerspiegelen op basis van hun locatie binnen het CZS28. Microgliale regionale heterogeniteit wordt ook actief onderzocht, hoewel de onderliggende mechanismen en functionele gevolgen van microgliadiversiteit in de ontwikkeling of het gedrag van het CZS momenteel onduidelijk zijn. Het is echter bekend dat volwassen microglia diversiteit vertonen in celnummer, cel- en subcellulaire structuren en moleculaire handtekeningen29. Bovendien hebben recente ontwikkelingen in gemultiplexte massacytometrie de regionale heterogeniteit van microglia verder gedefinieerd, waarbij cellulair fenotype uit vijf verschillende CZS-regio's van negen menselijke donoren wordt geanalyseerd, waardoor grootschalige immunofenotypering van menselijke microglia30 mogelijk is. Momenteel bevinden dergelijke benaderingen zich in hun ontluikende stadia, waardoor dierstudies een haalbare oplossing zijn voor de studie van regionale glia in de ontwikkeling van CZS-ziekten. Ten slotte is onlangs ook regionale heterogeniteit beschreven in oligodendrocyten. Eencellige RNA-sequencing op 5072 individuele cellen uit 10 regio's van juveniel en volwassen CZS identificeerde 13 verschillende subpopulaties in verschillende stadia van differentiatie31. Belangrijk is ook dat naarmate oligodendrocyten uit OPC's rijpten, hun transcriptionele profielen uiteenliepen en hun functionele fenotypen veranderden, wat oligodendrocyten heterogeniteit binnen het CZS31 benadrukte.
Het begrijpen van regionale heterogeniteit van de verschillende residente CZS-cellen in de context van hun diverse naburige neuronen en andere glia kan dus een belangrijke reden zijn voor de toekomstige ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve aandoeningen. Hoewel dit protocol zich richt op de extractie, isolatie en identificatie van gliale subpopulaties, biedt het een handig startpunt voor het onderzoek van hun functie. Bovendien kan het worden aangepast en gecombineerd met transgene muismodellen om genetische mechanismen te bestuderen die verband houden met gliacelbiologie. Het kan ook worden gebruikt om de reacties van gliacellen op elkaar te onderzoeken in co-kweektests. De geschetste stappen vertegenwoordigen een kostenefficiënte en high-throughput methode voor het extraheren en isoleren van verschillende CNS-glialpopulaties die vervolgens kunnen worden aangepast aan een breed scala aan experimentele parameters. Opgemerkt moet worden; echter, dat de hier beschreven methode neonaten gebruikt vanwege de lagere niveaus van myelinisatie en hoge dichtheid van prolifererende glia. Om deze redenen is het technisch haalbaarder om levensvatbare glia van pasgeborenen te isoleren in vergelijking met volwassen dieren. De fenotypische verschillen in neonatale glia in vergelijking met volwassen glia moeten dus worden overwogen tijdens het experimentele ontwerp en de interpretatie van gegevens.
Disclosures
De auteurs hebben belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We bedanken Morgan Psenicka voor het bewerken en bespreken van manuscripten en Dr. Grahame Kidd voor hulp bij het opmaken van figuren. Dit werk werd ondersteund door NIAID K22 AI125466 (JLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
| 12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
| 50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
| B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
| DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
| Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
| Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
| Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
| Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
| Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
| L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
| Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
| Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
| Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
| Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
| Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
| Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
| Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
| Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
| Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
| Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
| Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
| Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |
References
- Fields, R. D., et al. Glial Biology in Learning and Cognition. The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Nuriya, M., Hirase, H.
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).
- Kierdorf, K., Prinz, M.
- Hertz, L., Chen, Y. Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning. Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).
- Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).
- Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R.
- Sharif, Y., et al. Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease. Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).
- von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. Glial Cells and Integrity of the Nervous System. Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H.
- Liu, R., et al. Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor. Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Witting, A., Moller, T. Microglia cell culture: a primer for the novice. Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).
- Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma. Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).
- Stevens, B. Glia: much more than the neuron's side-kick. Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).
- Fields, R. D., et al. Glial biology in learning and cognition. Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).
- Hartenstein, V., Giangrande, A. Connecting the nervous and the immune systems in evolution. Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).
- Emsley, J. G., Macklis, J. D. Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS. Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).
- Chaboub, L. S., Deneen, B. Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development. Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bottcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).
- Marques, S., et al. Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system. Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).
