Summary
ここでは、マウスCNSからの複数のグリア細胞集団のin vitro単離のためのプロトコルを提示します。この方法では、局所ミクログリア、希突起膠細胞前駆細胞、およびアストロサイトの分離を可能にし、さまざまな培養システムにおけるそれぞれの表現型を研究することができます。
Abstract
ここで提示された方法は、グリア亜集団の分離のためにマウス新生児から中枢神経系(CNS)の4つの異なる領域を解剖するための実験室手順を示しています。この手順の目的は、ミクログリア、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)、およびアストロサイトを皮質、小脳、脳幹、および脊髄組織から解離させて、さらなるin vitro分析を容易にすることです。CNS領域単離手順により、複数の細胞培養システムにおけるグリア間の局所的な不均一性を決定できます。迅速なCNS領域の単離が行われ、続いて髄膜の機械的除去が行われ、グリアの髄膜細胞汚染が防止されます。このプロトコルは、細胞の完全性と接着性を維持するように設計された特定のマトリックス上での穏やかな組織解離とメッキを組み合わせたものです。複数のCNS領域から混合グリアを分離することで、個々の実験動物を最大限に活用しながら、潜在的に不均一なグリアの包括的な分析が可能になります。さらに、局所組織の解離に続いて、混合グリアはさらにミクログリア、OPC、およびアストロサイトを含む複数の細胞タイプに分割され、単一細胞タイプ、細胞培養プレートインサート、または共培養システムのいずれかで使用されます。全体として、実証された技術は、マウス新生児からの4つの個々のCNS領域の注意深い解剖のための幅広い適用性の包括的なプロトコルを提供し、任意の数のin vitro細胞培養システムまたはアッセイにおける局所的な不均一性を調べるための3つの個々のグリア細胞タイプの単離方法を含みます。
Introduction
グリアは、中枢神経系における適切な神経機能に必要です。それらは、星状細胞、希突起膠細胞、およびミクログリアの3つの主要な亜集団で構成されており、それぞれが異なるが不可欠な役割を持っています1。適切なグリア細胞の多様性と活動がなければ、神経機能は深刻な影響を受け、中枢神経系障害につながります。グリアは神経伝達に影響を与えることができ、各細胞型は独自の方法で影響を及ぼします。脳内のグリア細胞は、適切なCNS機能を促進するために、神経細胞と同様にそれらの間で通信する能力を持っています2。希突起膠細胞は、ミエリン鞘の形成を通じて電気伝達の速度を増加させ、ニューロン活動電位生成3の部位であるランビエのノードでのイオンチャネルのクラスタリングを促進します。ミクログリアは、シナプス伝達を監視し、損傷後のニューロン接続を「再配線」することにより、シナプスの剪定に重要です4。さらに、ミクログリアはCNSの最も豊富な常在免疫細胞であり、病原体に対する宿主防御の主要な形態として作用する5。アストロサイトは、細胞外カリウム6の濃度を修飾することにより、ニューロン間のシナプス伝達を調節することができる。また、局所的な血流7の制御、神経調節要素の放出と取り込み8、血液脳関門の維持9にも重要な役割を果たしています。したがって、各グリアサブタイプはCNS機能にとって重要であり、あらゆるタイプの欠陥は、精神疾患、てんかん、および神経変性状態を含む多種多様な病理学的状態に長い間関連してきた10。
CNS病理生物学の研究における最大の障害は、微小環境ニッチの文脈でヒト細胞を調査できないことです。ヒト生検組織は死後に最も多く採取され、細胞は抽出および処理中に容易に損傷または失われる可能性があります。さらに、腫瘍から不死化細胞株を誘導することなく、ヒト細胞をin vitroで長期間生き続け、生存させることは課題であり、その時点でそれらはもはやそれらの正常な生理学的特性を正確に反映しなくなる11,12。さらに、個々のグリア細胞タイプ間にはかなりの量の局所的な不均一性があり13、14、15、個々の患者から局所CNSサンプルを取得することはほぼ不可能です。そのため、特定のCNS障害における局所グリアの寄与を研究するための代替モデルを開発する必要があります。
ここでは、成熟希突起膠細胞を生じさせるミクログリア、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)、および星状細胞の操作と定量を可能にする、複数のグリア亜集団のマウスCNS領域特異的分離を使用したin vitroシステムについて説明します。各集団を個別に分離し、実験の必要性に応じて、薬物または分子処理、免疫細胞化学、タンパク質/RNA抽出および分析、およびその他の共培養システムを含むさまざまな実験技術にかけることができます。さらに、この単離技術は高い細胞数をもたらし、ハイスループットな方法で各グリア集団の特性評価と調査を可能にします。また、in vivo設定に通常存在する交絡因子を回避するために、制御された方法で多種多様な微小環境刺激に応答するCNS細胞の分化、成長、および増殖の研究を可能にします。最後に、この細胞単離技術は、異なるCNS領域内のグリア細胞集団の操作を容易にし、局所グリアが互いにどのように相互作用し、さまざまな刺激に応答するかを調査し、精度と再現性を可能にします。
Protocol
注:すべての動物実験は、クリーブランドクリニックラーナー研究所の施設動物管理および使用委員会によって承認および承認されました。
1.解剖用の培地と消耗品を準備します
メモ: すべてのバッファおよびメディアレシピを 表 1 に示します。この手順は、組織培養で指定されたバイオセーフティキャビネット内で無菌条件下で行われます。
- 混合グリア培地(MGM)を調製し、滅菌濾過する。これは前日に行い、4°Cで保存することができます。
- フィブロネクチンを滅菌H2Oで1:100の濃度で希釈する。希釈されたフィブロネクチンの量は、実験に使用された子犬の数とCNS領域によって異なります。1つの皮質に1つのT25フラスコ、2〜4小脳に1つのT25フラスコ、2〜4の脳幹に1つのT25フラスコ、2〜4の脊髄に1つのT25フラスコを使用します。
注:上記の基準を使用して同じ領域の組織を組み合わせると、以下に説明するプロトコルを変更することなく、適切な解離が可能になります。ステップ1.2に記載したよりも多くの組織を組み合わせるには、解離試薬濃度のさらなる最適化が必要になります。 - 希釈したフィブロネクチン3 mLを室温でT25フラスコにピペットで入れ、2分間放置します。
- フィブロネクチンを吸引し、フラスコの蓋を緩めた状態でフラスコを一晩乾燥させます。
2.皮質、小脳、脳幹、脊髄解離
注:この手順はベンチトップで行うことができ、解剖スコープが必要です。手順のすべてのステップに厳格な無菌技術を使用し、室内の空気への組織の暴露を最小限に抑えます。解剖中はすべての培地を氷上で冷やして、組織を最大限に保存してください。あるいは、この手順は、内部解剖スコープの使用を可能にするフード内で行うことができます。
- 70%エタノールですべての領域を拭きます。
- 10 mLのPBS/抗生物質溶液(PAS)を10 cmのペトリ皿にピペットで入れます。解剖する子犬ごとに1つのペトリ皿を準備します。溶液を冷やしておくために氷の上に置きます。
- 消毒した組織培養フードで、9 mLのDMEM(添加物なし)を4本の別々の15 mLコニカルチューブ(CNS領域ごとに1本ずつ)にピペットし、チューブキャップを交換し、氷上に置きます。解剖スコープから届く距離内にチューブ付きのアイスバケツを置きます。
- ステップ2.2で調製した10cmのシャーレを消毒した解剖スコープステージに置く。
- 施設のプロトコルに従ってマウスの子犬を麻酔して安楽死させ、鋭いハサミで迅速に斬首して頭を取り除きます。
注:出生後(P)3〜5匹の子犬が使用されます。年配の子犬はより発達したCNSを持っており、グリア細胞を拡大する適切な供給源ではない可能性があります。若い子犬(P)0-2は、より多くのグリアを産出する可能性があり、使用することができます。しかし、脊髄組織は、サイズのためにこの若い年齢で解剖することは非常に困難です。 - 70%エタノールを使用して子犬の皮膚をきれいにします。
- 細かいハサミを使用して、鼻に達するまで、尾側から始めて吻側を動かしながら、動物の頭の正中線に沿って皮膚層を切ります。組織の損傷を避けるために、頭蓋骨に深く切り込むことは避けてください。
- 頭を下に傾け、皮膚層を頭蓋骨の両側に引き、スプリングハサミを使用して、頭蓋骨の正中線に沿って、大孔から始めて切開し、再び尾側から吻側に切断します。
- 先端の細かい鉗子で、頭蓋骨の半分を左右に引っ張り、皮質、小脳、脳幹を露出させます。
- 露出したら、脳を頭蓋骨からそっと持ち上げ、ステップ2.2で準備した10cmのペトリ皿に入れます。解剖学的構造を維持するために、後脳を取り付けた状態で、脳が損傷を受けていないことを確認してください。
- 鉗子の先端を上に向けて、先端が湾曲した細かい鉗子を使用して、小脳をつまみます。髄膜を取り除き、アイスバケット内の指定された15mLコニカルチューブに入れます。
- 脳幹が小脳の直接腹側にあり、小脳の除去後に見えることを確認してください。先端の細かい鉗子でそれを取り除き、髄膜を取り除き、アイスバケット内の指定された15mLのコニカルチューブに入れます。
- 中脳を皮質から分離し、皮質髄膜を取り除き、アイスバケット内の指定された15mLの円錐管に入れます。
- 脊髄を取り外すには、切断されたマウスの子犬を仰臥位(上向きに横たわっている)に置き、切断された脊柱を研究者に向かって持ち上げます。
- 70%エタノールを再度スプレーします。
- 脊柱の外側に沿って、吻側から尾方向に、後肢に達するまで胸郭を通して切断します。切断しながら、脊柱が見えるまで内臓を押し戻します。
- 脊柱の各側面に沿って分離されるまで切断し、ステップ2.2で準備した10cmのペトリ皿に入れます。
- 腹側を上にして、細かいスプリングハサミを使用して、各椎骨の右側と左側を腰部に到達するまで交互に切断し、脊髄組織を露出させます。
- 解剖顕微鏡の下で、先端の細かい鉗子で脊髄と髄膜をそっと取り除きます。アイスバケット内の指定された15mLコニカルチューブに入れます。
- 子犬ごとに手順2.5.〜2.19を繰り返し、同じ領域の組織を組み合わせて、準備されたT25フラスコごとに手順1.2で概説した基準に適合させます。
注意: 髄膜をできるだけ完全に取り除きます。かなりの量の髄膜が残っている場合、髄膜細胞の線維芽細胞様表現型が増殖し、細胞培養を圧倒します。特定の細胞培養物を生成するために、等しい表現型の複数の脊髄を組み合わせることができる。グリアポトーシスや表現型の差別化につながる可能性のある細胞の過密が起こらないように注意してください。
3.組織解離
注:以下の手順はすべて、無菌技術と滅菌材料を使用して、滅菌組織培養で指定されたバイオセーフティキャビネットで実行されます。
- 0.53 mM EDTAを含む0.05%トリプシンを1 mL 9 mL DMEMおよび組織の各15 mLコニカルチューブに追加して、組織溶解を開始します。
注:DMEMには、トリプシンの阻害剤として機能する可能性のある塩化カルシウムが大量に含まれています。概説された手順に従って解離が完了しない場合は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクスバランス塩溶液を使用できます。トリプシン処理後、トリプシン阻害剤を添加することで酵素を中和できますが、カルシウムは後続のステップで使用されるDNase Iの補因子であるため、溶液に戻す必要があります。 - 10 mLピペットで約20倍に粉砕します。
- 細胞懸濁液を空の50 mLコニカルチューブに移します。
- この溶液を37°C、5%CO2 で15分間インキュベートし、8分後にライセートを穏やかに撹拌する。
- 5 mLのMGMと200 μL(5 mg/mL)のDNase Iを各チューブに加え、最終濃度は50 μg/mLになります。
- 各ライセートを10 mLピペットで10倍粉砕します。
- 細胞懸濁液を室温で3分間放置して、解離していない組織がチューブの底に定着できるようにします。
- 細胞懸濁液を新しい50 mLコニカルチューブに移し、解離していない組織を残します。
注:上記の溶解および粉砕ステップは、解離していない組織の量を大幅に制限します。 - チューブを300 x g で4°Cで3分間、ブレーキなしで遠心分離します。
- 上清を吸引し、残りの細胞ペレットを5 mLのMGMに再懸濁します。
- ペレットを5 mLピペットで20倍に粉砕します。
- 5 mL 細胞懸濁液をコーティングされた T25 フラスコにプレートします。
- 細胞を37°C、5%CO2 でインキュベートし、24時間後に最初に培地を交換して細胞破片を除去します。
メモ: 一部のプロトコルでは、72 時間後に最初のメディア交換を推奨しています。このステップの最適化が必要になる場合があります。 - 細胞が80%コンフルエントになるまで、MGMで48〜72時間ごとに100%の培地交換を実行します(約5〜7日)。
メモ: メディアを交換する前に、すべてのメディアを 37 °C に温める必要があります。
4. ミクログリアの分離
- 混合グリア培養が80%のコンフルエントに達したら、蓋を締め、パラフィンフィルムで密封して振とう用のフラスコを準備します。
- 混合グリア培養物からミクログリアを除去するには、フラスコを37°Cのインキュベーター内のオービタルシェーカーに水平に固定します。フラスコを15 x g で1時間振とうします。
- 培地とピペットを取り出し、15 mLのコニカルチューブに入れます。フラスコを3 mLの温かいMGMで2回すすぎ、15 mLのコニカルチューブに洗浄を加えます。これらはミクログリアです。
- 5 mLの温かく新鮮なMGMを培養フラスコに加えます。
- フラスコをパラフィンフィルムで再密封し、フラスコをシェーカーで水平に固定し、15 x g で37°Cで15時間振とうして、アストロサイトからOPCを分離します。
注:この手順は一晩で実行できますが、過剰な時間は細胞死を引き起こす可能性があるため、15時間の振とう時間が重要です。 - ステップ4.3の上清を遠心分離する。300 x g で3分間、標準プロトコル16 に従ってミクログリアを培養するか、生物学的アッセイに使用します。
5. 希突起膠細胞前駆細胞単離
注意: 最初の分離後にOPCをメッキする場合は、ポリDリジンコーティングされた表面(滅菌プレートまたはカバースリップ)にメッキする必要があります。このセクションを完了する前に、これらの資料を準備してください。
- 15時間振とうした後、フラスコから上清を取り除き、滅菌済みの100 mmペトリ皿にプレートします。
- 上清を37°C、5%CO2 で30分間インキュベートし、15分後に旋回させて残りのミクログリアを除去します。非組織培養処理ペトリ皿をこの工程に用いてもよい。
- 非接着性細胞上清を除去し、カウントし、ポリD-リジンコーティングされた表面上のプレートにします。通常、7,500〜10,000個のOPCがメッキ/ cm2です。
- 37°C、5%CO2 で少なくとも1時間(最大6時間)インキュベートし、95%の培地を穏やかに吸引し、温かいOPC培地をゆっくりと加え、培地をウェルの壁にピペッティングしてOPCの破壊を最小限に抑えます。細胞が使用可能になるまで、48時間ごとに培地を交換してください。
注: 一度に 1 つのウェルのみを交換することが重要です。OPCは敏感であり、特に乾燥条件に耐性がありません。OPC培地へのPDGF-AAの添加は、希突起膠細胞へのOPC成熟を遅らせることである。この因子は、実験の焦点が成熟希突起膠細胞である場合、培地から除外され得る。
6.アストロサイトの分離
- 15時間振とうした後、上清を取り除き、フラスコを温かい1x PBSで2回すすぎます。
- 0.53 mM EDTAを含む0.05%トリプシン4 mLを加え、37°C、5%CO2 で5分間、または細胞が持ち上げられるまでインキュベートします。星状細胞が浮き上がったことを確認するには、標準の広視野顕微鏡を使用して星状細胞を視覚化します。アストロサイトは、トリプシン処理後に球状に見えます。
- アストロサイトが剥離したら、フラスコを垂直に立て、4 mL MGMを加えます。粉砕して混ぜる。
- アストロサイトを15 mLのコニカルチューブにピペットで入れ、300 x g で5分間遠心分離します。
- ステップ1.2の説明に従って、アストロサイト培地およびプレートをフィブロネクチンコーティング表面に再懸濁します。または生物学的アッセイに使用します。
注:20 ng/mLのマウス線維芽細胞増殖因子は、最初の培地交換時に添加して、星状細胞培養の確立に役立てることができます。さらに、標準的なゼラチンコーティングは、フィブロネクチンの低コストの代替品であり得る。
7. 免疫細胞化学を用いたミクログリア、OPC、アストロサイト、成熟希突起膠細胞の同定と単離
- 播種した細胞が適切なコンフルエントに達したら、培地を静かに取り除き、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して接着細胞を10分間固定します。バイオセーフティキャビネットでこのステップを実行します。
注:溶液を吸引または追加するときは、細胞の剥離を防ぐために穏やかな圧力でピペットで留めてください。 - PFAをゆっくりと吸引し、細胞を1x PBSで3回5分間洗浄します。
- 1x PBSで10%血清と0.1%Triton X-100を使用して適切なブロッキング溶液を調製します。
注:血清源は、二次抗体が産生された宿主動物を反映しています。例えば、二次抗体がヤギ抗ウサギである場合、適切なブロッキング血清は正常ヤギ血清である。同様に、二次抗体がロバ抗ウサギである場合、ブロッキング血清は正常なロバ血清でなければなりません。 - 細胞が完全に覆われるまでブロッキング溶液を追加します。室温で1時間ブロックします。
- 抗体希釈液(1x PBSの9 mL、ウシ血清アルブミン0.01 g、Triton X-10030 μL)を準備します。あるいは、抗体は、ステップ6.3に記載されるブロッキング溶液中で希釈することができる。
- 以下に特異的な一次抗体を抗体希釈液またはブロッキング溶液で希釈する:
- ミクログリア:イオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)を1:250希釈(2.4 μg/mL)。
- OPC:神経/グリア抗原2(NG2)を1:200希釈(5 μg/mL)。
- 成熟希突起膠細胞:1:400希釈のミエリン塩基性タンパク質(MBP)(濃度はロットに依存し、最適化が必要な場合があります)。
- アストロサイト:グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)を1:400希釈(0.25 μg/mL)17。
注:同じ種で育てられた一次抗体を混合しないでください。
注:GFAPは白質星状細胞を確実に標識します。灰白質星状細胞の場合、代替マーカーを使用する必要がある場合があります。
- 一次抗体を4°Cで一晩インキュベートします(穏やかな攪拌が好ましい)。
- 1x PBSで3回5分間洗浄し、一次抗体を除去します。
- 適切な二次抗体を含む細胞を、抗体希釈液または光から保護されたブロッキング溶液中で1:400に希釈してインキュベートします。
注:二次抗体は蛍光色素に結合しており、利用可能な顕微鏡パラメータに応じて交換できます。蛍光二次抗体を塗布したら、できるだけ光から保護してください。 - 二次抗体を室温で1時間インキュベートし、光への曝露を制限します。
- 1x PBSで5分間3回洗浄して、余分な二次抗体を除去します。
- 核を標識するには、1:1,000 DAPI/PBS溶液を使用し、暗所で室温で5分間細胞をインキュベートします。
- 暗闇の中で3x PBSで5分間5x洗浄します。
- マウントするには、封入剤を塗布し、暗所で乾かしてからイメージングします。
注意: マウントされたスライドは、室温で2〜3日間保存できます。長期保存の場合は、スライドを4°Cに移動します。 最大の信号を得るために1週間以内に画像。すべての代表的な画像は共焦点顕微鏡で画像化されています。ただし、倒立蛍光顕微鏡も推奨されます。
Representative Results
以下に示す代表的なデータは、IFNγシグナル伝達がOPCの分化と成熟に影響を与えることを示しています。IFNγ受容体(IFNγR)が存在しないと、皮質OPCは成熟髄鞘形成希突起膠細胞に容易に分化せず、MBP染色がないことからも明らかです(図1)。希突起膠細胞とアストロサイトは共通の前駆細胞に由来するため、アストロサイトを標識するGFAP発現を解析しました。我々は、IFNγR欠損細胞がGFAPを強く発現していることを発見し、それらが星状細胞表現型を採用している可能性があることを示唆しており、以前の報告を裏付けています19。
CNS細胞の局所的な不均一性に関するさらなる証拠は、皮質、小脳、脳幹、および脊髄からの星状細胞に見られるように、星状細胞の形態が異なることによって証明されています(図2)。注目すべきことに、同じ領域の星状細胞も形態学的不均一性を示す可能性があり、このグリアサブタイプが非常に動的であるという考えを支持しています。細胞構造の違いは機能の多様性を示唆しているため、微小環境刺激の不在下および存在下での表現型応答を研究するには、グリア集団を分離する能力が必要です。
希突起膠細胞は、ニューロン軸索の髄鞘形成に不可欠であり、適切なCNS修復および機能に必要である。OPCは成熟した対応物を生み出し、分化能力の背後にある生物学を理解することが重要になります。サイトカインシグナル伝達は、幹細胞と免疫細胞の挙動に大きく影響します。したがって、OPCの局所応答がサイトカイン刺激の違いによってどのように変化するかを理解することが重要であり(図3)、成熟髄鞘形成希突起膠細胞への分化能力に影響を与える可能性があります。
図1:外因性IFNγの存在下でのWTおよびIFNγR-/- マウスにおけるOPC分化を示す代表的なデータ。皮質OPCは、上記に概説した手順に従って、( A )WTおよび (B) IFNγR-/- P4マウスの子犬から単離されました。細胞を1 ng/mL IFNγで48時間処理した後、固定および染色して細胞分化を描写しました。OPCは、星状細胞表現型を採用しているものを同定するために、NG2およびGFAPについて標識された。同様に、OPCはNG2およびMBPについても標識され、成熟希突起膠細胞に分化しているものを同定した。スケールバー= 20μM。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アストロサイトの形態における地域的な不均一性を示す代表的なデータ。 皮質、小脳、脳幹、および脊髄からの星状細胞を、上記のプロトコルを使用してP4マウスの子犬から単離し、培養48時間後に免疫細胞化学によってGFAP(緑色)を標識しました。スケールバー= 20μM。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サイトカインに対する地域OPCの異なる応答を示す代表的なデータ。 OPCは、上記のプロトコルを使用して、P4マウスの子犬の脳幹および脊髄から分離されました。細胞を、有髄希突起膠細胞に分化する局所OPCの能力に対するサイトカインの異なる影響を調べるために、(A)IFNγまたは(B)インターロイキン(IL)-17の濃度 ( 1〜10 ng / mL ) で処理されました。特定のサイトカインで48時間インキュベートした後、OPCを固定し、NG2(緑)とMBP(赤)について標識しました。スケールバー= 20μM。データはSEM±平均を表す。 **, p < 0.01;, p < 0.001;, p < 0.0001 2-way ANOVAによる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| PBS /抗生物質溶液(PAS): | ||
| 1.0ミリリットル | 10,000単位/mLのペニシリンおよび10,000 mg/mLのストレプトマイシンを含む100X抗生物質/抗真菌剤 | |
| 25ミリグラム/ミリリットル | アムホテリシンB | |
| 99ミリリットル | 1X PBS | |
| ミックスグリアメディア(MGM) | ||
| 88ミリリットル | 1X DMEM (高グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸Na含有) | |
| 10ミリリットル | 熱不活性化FBS | |
| 1.0ミリリットル | L-グルタミン (100X) | |
| 1.0ミリリットル | 抗生物質/抗真菌薬 | |
| OPC培地 (50mL) | ||
| 49ミリリットル | 神経基礎培地 | |
| 1.0ミリリットル | B27サプリメント(50X) | |
| 10 ng/ml | PDGF-AA | |
| 注: PDGF-AA は、各メディア交換の前に新しく追加されます。 | ||
| アストロサイト培地 (1 L) | ||
| 764ミリリットル | グルタミンを含むアール塩を用いたMEM | |
| 36ミリリットル | グルコース(20 mMの最終濃縮には100 mg/mLストックを使用) | |
| 100ミリリットル | 熱不活性化FBS | |
| 100ミリリットル | 熱不活性化馬血清 | |
| 10ミリリットル | グルタミン(ストック培地に含まれていない場合は200 mMストックを使用) | |
| オプション:10 ng/mL組換えマウス上皮成長因子 | ||
| 注意: すべての培地を滅菌ろ過し、使用するまで4°Cで保管してください。 | ||
表 1: バッファーとメディアのレシピ。
Discussion
このプロトコルでは、マウスCNSからの3つの主要なグリア細胞亜集団(ミクログリア、OPC、およびアストロサイト)の単離について説明します。神経変性および神経炎症性CNS疾患の調査における大きな後退は、一次ヒト細胞および組織、特に局所的で同じ患者由来のものの欠如である。ほとんどの場合、ヒトCNS細胞株は形質転換された不死化癌細胞に由来し、正常な生理学的挙動を正確に表していない可能性があります20、21、22。したがって、制御された方法でCNS細胞表現型を研究するには、代替方法が必要である。さらに、神経学的グリア細胞集団の多様性は、細胞の自律機能と非自律機能の両方を再現するために、互いに独立して、また共培養条件で各サブタイプを調べる必要があります。グリア細胞は、神経細胞サポート23、学習/認知24,25、およびCNS免疫学的応答26に至るまで、CNSにおいて多種多様な重要な機能を有する。そのため、各グリア亜集団の分子および細胞機能を生理学的および病理学的文脈で理解する必要があります。そのために、生存可能なグリアサブタイプの抽出と単離のための信頼できる方法をここに提供します。ヒト被験者の研究における実用的および倫理的制約のために、動物モデルは現在、ヒトグリア細胞生物学にとって最も関連性の高い代用物です。特に、マウスは、ゲノムを操作および分析して、健康と病気の根底にある特定の分子メカニズムをさらに解剖できるため、理想的なモデル動物です。したがって、マウスミクログリア、OPC、および星状細胞の除去と分離の成功は、生理学的、神経変性、または神経炎症状態におけるグリアの機能を調べるための重要なツールです。
このプロトコルは、CNS細胞の局所的不均一性を探索するように最適化することができる。グリアは形態と機能において地域的な不均一性を示すことがますます明らかになりつつある。アストロサイトは地域的に多様であり、CNS27内の位置に応じて異なる形態を示します。さらに、アストロサイトの密度とその有糸分裂指数は解剖学的領域を定義することができ、局所的なアストロサイトの不均一性はCNS28内の位置に基づく分子的および機能的違いを反映している可能性があるという仮説を支持しています。ミクログリアの局所的不均一性も活発に研究されていますが、CNSの発生または行動におけるミクログリアの多様性の根底にあるメカニズムと機能的影響は現在不明です。しかし、成体のミクログリアは、細胞数、細胞および細胞内構造、および分子シグネチャに多様性を示すことが知られています29。さらに、マルチプレックスマスサイトメトリーの最近の進歩は、ミクログリアの局所的不均一性をさらに定義し、9人のヒトドナーの5つの異なるCNS領域からの細胞表現型を分析し、ヒトミクログリアの大規模なイムノフェノタイピングを可能にしました30。現在、そのようなアプローチは初期段階にあり、動物実験はCNS疾患の発症における局所グリアの研究のための実行可能な解決策となっています。最後に、希突起膠細胞においても最近、局所的な不均一性が記載されている。幼若および成体CNSの10領域からの5072個の個別細胞に対する単一細胞RNAシーケンシングにより、分化の異なる段階にわたる13の異なる亜集団が同定された31。重要なことに、希突起膠細胞がOPCから成熟するにつれて、それらの転写プロファイルが分岐し、それらの機能的表現型が変化し、CNS31内の希突起膠細胞の不均一性を強調することもわかりました。
したがって、多様な隣接ニューロンおよび他のグリアの状況における様々な常在CNS細胞の局所的不均一性を理解することは、神経炎症性および神経変性疾患を治療するための新しい治療法の将来の開発のための重要な理論的根拠を提供するかもしれない。このプロトコルは、グリア亜集団の抽出、分離、および同定に焦点を当てていますが、それらの機能を調べるための便利な出発点を提供します。さらに、グリア細胞生物学に関連する遺伝的メカニズムを研究するために、トランスジェニックマウスモデルに適合させて組み合わせることができます。また、共培養アッセイにおけるグリア細胞の相互に対する応答を調べるためにも使用できます。概説されたステップは、さまざまなCNSグリア集団を抽出および分離するコスト効率の高いハイスループットの方法を表しており、さまざまな実験パラメーターに適合させることができます。注意する必要があります。しかしながら、本明細書に記載の方法は、髄鞘形成のレベルが低く、増殖グリアの密度が高いために新生児を利用する。これらの理由から、成体動物と比較して、新生児から生存グリアを単離することは技術的により実現可能である。したがって、成人グリアと比較した新生児グリアの表現型の違いは、実験デザインおよびデータ解釈中に考慮する必要があります。
Disclosures
著者は開示すべき利益相反を持っています。
Acknowledgments
原稿の編集と議論をしてくれたモーガン・プセニカと、図のフォーマットを支援してくれたグラハム・キッド博士に感謝します。この作業は、NIAID K22 AI125466(JLW)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
| 12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
| 50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
| B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
| DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
| Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
| Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
| Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
| Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
| Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
| L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
| Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
| Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
| Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
| Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
| Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
| Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
| Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
| Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
| Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
| Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
| Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
| Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |
References
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