Summary
Här presenterar vi ett protokoll för in vitro-isolering av flera gliacellspopulationer från ett mus-CNS. Denna metod möjliggör segregering av regionala mikroglia, oligodendrocytprekursorceller och astrocyter för att studera fenotyperna hos var och en i en mängd olika odlingssystem.
Abstract
De metoder som presenteras här demonstrerar laboratorieprocedurer för dissektion av fyra olika regioner i centrala nervsystemet (CNS) från murina nyfödda för isolering av gliala subpopulationer. Syftet med förfarandet är att dissociera mikroglia, oligodendrocytstamceller (OPC) och astrocyter från kortikal, cerebellär, hjärnstam och ryggmärgsvävnad för att underlätta ytterligare in vitro-analys. CNS-regionens isoleringsförfaranden möjliggör bestämning av regional heterogenitet bland glia i flera cellodlingssystem. Snabb CNS-regionisolering utförs, följt av mekaniskt avlägsnande av meninges för att förhindra meningealcellkontaminering av glia. Detta protokoll kombinerar mild vävnadsdissociation och plätering på en specificerad matris utformad för att bevara cellintegritet och vidhäftning. Att isolera blandad glia från flera CNS-regioner ger en omfattande analys av potentiellt heterogen glia samtidigt som användningen av enskilda försöksdjur maximeras. Dessutom, efter dissociation av regional vävnad, delas blandad glia vidare in i flera celltyper inklusive mikroglia, OPC och astrocyter för användning i antingen encellstyp, cellodlingsplattinsatser eller samodlingssystem. Sammantaget ger de demonstrerade teknikerna ett omfattande protokoll med bred tillämplighet för noggrann dissektion av fyra enskilda CNS-regioner från murina nyfödda och inkluderar metoder för isolering av tre individuella gliacelltyper för att undersöka regional heterogenitet i valfritt antal in vitro-cellodlingssystem eller analyser.
Introduction
Glia är nödvändiga för korrekt neuronal funktion i CNS. De består av tre stora delpopulationer, astrocyter, oligodendrocyter och mikroglia, var och en med en annan, men ändå oumbärlig roll1. Utan rätt glialcellsdiversitet och aktivitet skulle neuronal funktion påverkas allvarligt, vilket leder till CNS-försämring. Glia kan påverka neurotransmission, och varje celltyp gör det på ett unikt sätt. Gliaceller i hjärnan har kapacitet att kommunicera med varandra, liksom med neuronala celler, för att underlätta korrekt CNS-funktion2. Oligodendrocyter ökar hastigheten på elektrisk överföring genom bildandet av en myelinmantel, vilket underlättar klustringen av jonkanaler vid noderna i Ranvier, platserna för neuronal åtgärdspotential generation3. Microglia är avgörande för beskärning av synapser genom att övervaka synaptisk överföring och "omkoppla" neuronala anslutningar efter skada4. Dessutom är microglia den vanligaste bosatta immuncellen i CNS, som fungerar som den primära formen av värdförsvar mot patogener5. Astrocyter kan reglera synaptisk överföring mellan neuroner genom att modifiera koncentrationen av extracellulärt kalium6. De har också roller i att kontrollera lokalt blodflöde7, frigöra och ta upp neuromodulerande element8, och har en nyckelroll i underhåll av blod-hjärnbarriären9. Således är varje glial subtyp kritisk för CNS-funktion, eftersom defekter av vilken typ som helst länge har associerats med en mängd olika patologiska tillstånd, inklusive psykiatriska sjukdomar, epilepsi och neurodegenerativa tillstånd10.
Det största hindret i studien av CNS-patobiologi är oförmågan att undersöka mänskliga celler i samband med deras mikromiljönisch. Mänsklig biopsivävnad är mest samlad post-mortem och celler kan lätt skadas eller förloras under extraktion och bearbetning. Dessutom är det en utmaning att hålla mänskliga celler levande och livskraftiga in vitro under någon längre tid utan att härleda odödliga cellinjer från tumörer, vid vilken tidpunkt de inte längre exakt återspeglar deras normala fysiologiska egenskaper11,12. Dessutom finns det en betydande mängd regional heterogenitet bland enskilda gliacelltyper13,14,15, och att få regionala CNS-prover från enskilda patienter är nästan omöjligt. Som sådan är det nödvändigt att utveckla alternativa modeller för att studera bidraget från regional glia i specifika CNS-störningar.
Här beskriver vi ett in vitro-system med hjälp av mus CNS-regionspecifik isolering av flera gliala subpopulationer, vilket möjliggör manipulation och kvantifiering av mikroglia, oligodendrocytprekursorceller (OPC), som ger upphov till mogna oligodendrocyter och astrocyter. Varje population kan isoleras oberoende och utsättas för en mängd olika experimentella tekniker inklusive läkemedels- eller molekylbehandling, immunocytokemi, protein / RNA-extraktion och analys och andra samodlingssystem beroende på experimentell nödvändighet. Dessutom ger denna isoleringsteknik högt cellantal, vilket möjliggör karakterisering och undersökning av varje glialpopulation på ett sätt med hög genomströmning. Det möjliggör också studier av CNS-celldifferentiering, tillväxt och proliferation som svar på en mängd olika mikromiljöstimuli på ett kontrollerat sätt för att undvika förvirrande faktorer som vanligtvis finns i en in vivo-miljö. Slutligen underlättar denna cellisoleringsteknik manipuleringen av gliacellspopulationer inom olika CNS-regioner för att undersöka hur regional glia interagerar med varandra och svarar på varierande stimuli, vilket möjliggör precision och reproducerbarhet.
Protocol
OBS: Alla djurstudier godkändes och godkändes av Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Förbered media och förnödenheter för dissektion
OBS: Alla buffert- och medierecept finns i tabell 1. Denna procedur utförs under sterila förhållanden i ett vävnadsodlingsbetecknat biosäkerhetsskåp.
- Förbered och sterilt filter blandat glia media (MGM). Detta kan göras dagen innan och förvaras vid 4 °C.
- Späd fibronektin vid en koncentration på 1:100 med steriltH2O. Volymen av utspädd fibronektin beror på antalet valpar och CNS-regionen som används för experimentet. Använd en T25-kolv för 1 cortex, en T25-kolv för 2-4 cerebella, en T25-kolv för 2-4 hjärnstammar och en T25-kolv för 2-4 ryggmärg.
OBS: Att kombinera vävnad från samma region med hjälp av de kriterier som anges ovan möjliggör adekvat dissociation utan att ändra protokollet som beskrivs nedan. Att kombinera mer vävnad än vad som beskrivs i steg 1.2 kommer att kräva ytterligare optimering av dissociationsreagenskoncentrationerna. - Pipettera över 3 ml utspätt fibronektin till T25-kolvar vid rumstemperatur och låt sitta i 2 min.
- Aspirera fibronektinet och låt kolvarna torka över natten med kolvlocket lossnat.
2. Cortex, cerebellum, hjärnstam och ryggmärgsdissektion
OBS: Denna procedur kan göras på bänkskivan och kräver ett dissektionsomfång. Använd strikt aseptisk teknik för alla steg i proceduren och minimera vävnadsexponering för rumsluften. Håll alla medier kylda på is under dissektion för att säkerställa maximal vävnadsbevarande. Alternativt kan denna procedur göras i en huva som tillåter användning av ett internt dissektionsomfång.
- Torka av alla områden med 70% etanol.
- Pipettera över 10 ml PBS/antibiotikalösning (PAS) till en 10 cm petriskål. Förbered en petriskål för varje valp som ska dissekeras. Ställ på is för att hålla lösningen kyld.
- I en desinficerad vävnadsodlingshuv, pipettera 9 ml DMEM (utan tillsatser) i 4 separata 15 ml koniska rör, en för varje CNS-region, byt ut rörlock och lägg på is. Placera ishink med rör inom räckhåll från dissektionsomfånget.
- Placera 10 cm petriskål tillagad i steg 2.2 på desinficerad dissektionsomfång.
- Bedöva och avliva musvalp enligt institutionellt protokoll och ta bort huvudet genom snabb halshuggning med skarp sax.
OBS: Postnatal dag (P) 3-5 valpar används. Äldre valpar har ett mer utvecklat CNS och kanske inte är en tillräcklig källa till expanderande gliaceller. Yngre valpar (P) 0-2 kan ge ett högre antal glia och kan användas; Ryggmärgsvävnad är emellertid mycket svår att dissekera i denna unga ålder på grund av storlek. - Rengör valpens hud med 70% etanol.
- Använd fin sax, skär det kutana skiktet längs mittlinjen på djurets huvud, börja kaudalt och flytta rostralt tills det når snuten. Undvik att skära djupt in i skallen för att undvika vävnadsskador.
- Vinkla huvudet ner, dra kutant lager till varje sida av skallen och använd fjädersax, gör ett snitt längs skallens mittlinje, börja vid foramen magnum, återigen skär caudal till rostral.
- Med finspetsade pincett drar du skallhalvorna till höger och vänster sida och exponerar cortex, cerebellum och hjärnstammen.
- När den är exponerad, lyft försiktigt hjärnan ur skallen och in i den 10 cm petriskål som bereds i steg 2.2. Se till att hjärnan förblir oskadad för att bevara anatomisk struktur, med bakhjärnan fäst.
- Använd fina, böjda spetsar med pincettens punkt uppåt, kläm av lillhjärnan. Ta bort hjärnhinnorna och placera i det avsedda 15 ml koniska röret i ishinken.
- Se till att hjärnstammen är direkt ventral mot cerebellum och är synlig efter avlägsnande av cerebellum. Ta bort den med finspetsade pincett, ta bort hjärnhinnor och placera i angivet 15 ml koniskt rör i ishink.
- Separera mellanhjärnan från cortex, ta bort kortikala meninges och placera i det utsedda 15 ml koniska röret i ishinken.
- För att ta bort ryggmärgen, placera den halshuggna musvalpen i ryggläge (liggande ansiktet uppåt) med den avskurna ryggraden upphöjd mot utredaren.
- Spraya igen med 70% etanol.
- Skär längs ryggradens laterala sidor, i rostral till kaudal riktning, genom ribbburet tills det når bakbenen. Under skärning, tryck tillbaka de inre organen tills ryggraden är synlig.
- Skär längs varje sidosida av ryggraden tills den är isolerad och lägg i den 10 cm petriskål som beretts i steg 2.2.
- Med ventral sida uppåt, med hjälp av fin fjädersax, alternera skärning av höger och vänster sida av varje ryggkota tills du når ländryggen för att exponera ryggmärgsvävnaden.
- Ta försiktigt bort ryggmärgen och hjärnhinnorna med finspetsade tångar under dissekeringsmikroskopet. Placera i angivet 15 ml koniskt rör i ishink.
- Upprepa steg 2.5–2.19 för varje unge och kombinera vävnad från samma region för att uppfylla kriterierna i steg 1.2 för varje beredd T25-kolv.
OBS: Ta bort hjärnhinnorna så fullständigt som möjligt. Om en betydande mängd meninges kvarstår kommer den fibroblastliknande fenotypen av meningealceller att växa ut och överväldiga cellkulturen. Flera ryggmärgar, av lika fenotyp, kan kombineras för att generera en specifik cellodling. Var noga med att se till att överbeläggning av celler inte uppstår, vilket kan leda till glial apoptos och differentiella fenotyper.
3. Vävnadsdissociation
OBS: Alla följande procedurer utförs i ett sterilt vävnadsodlingsbetecknat biosäkerhetsskåp med aseptisk teknik och sterila material.
- Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin innehållande 0,53 mM EDTA till varje 15 ml koniskt rör med 9 ml DMEM och vävnad för att påbörja vävnadslys.
DMEM innehåller en hög mängd kalciumklorid, som kan fungera som en hämmare av trypsin. Om dissociationen inte är fullständig enligt de beskrivna stegen kan Hanks balanserade saltlösning utan kalcium eller magnesium användas. Efter trypsinisering kan enzymet neutraliseras genom att tillsätta en trypsinhämmare, även om kalcium bör tillsättas tillbaka till lösningen eftersom det är en kofaktor för DNas I, som används i efterföljande steg. - Triturat med en 10 ml pipett ca 20x.
- Överför cellsuspensionerna till tomma 50 ml koniska rör.
- Inkubera lösningen vid 37 °C, 5 %CO2 i 15 minuter och rör försiktigt om lysaterna efter 8 minuter.
- Tillsätt 5 ml MGM och 200 μl (5 mg/ml) DNas I till varje rör för en slutlig koncentration på 50 μg/ml.
- Tritulera varje lysat med en 10 ml pipett 10x.
- Låt cellsuspensionerna sitta i 3 minuter vid rumstemperatur så att icke-dissocierad vävnad kan sätta sig i botten av rören.
- Överför cellsuspensionerna till nya 50 ml koniska rör och lämna den icke-dissocierade vävnaden.
OBS: Lys- och triturationsstegen som beskrivs ovan begränsar signifikant mängden icke-dissocierad vävnad. - Centrifugera rören vid 300 x g i 3 minuter vid 4 °C utan broms.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera de återstående cellpelletsna i 5 ml MGM.
- Triturate pelleten med en 5 ml pipett 20x.
- Plätera 5 ml cellsuspensioner på belagda T25-kolvar.
- Inkubera cellerna vid 37 °C, 5 %CO2 och byt media initialt efter 24 timmar för att avlägsna cellrester.
Vissa protokoll rekommenderar en första medieändring efter 72 timmar. Optimering av detta steg kan krävas. - Utför en 100% medieförändring med MGM var 48-72: e timme tills cellerna är 80% sammanflytande (cirka 5-7 dagar).
OBS: Alla medier måste värmas till 37 °C innan media ändras.
4. Microglia isolering
- När blandade gliakulturer har nått 80% sammanflöde, förbered kolvarna för skakning genom att dra åt locken och försegla med paraffinfilm.
- För att avlägsna mikroglia från blandade glialkulturer, säkra kolvarna horisontellt på en orbital shaker inuti en 37 °C inkubator. Skaka kolvarna i 15 x g i 1 timme.
- Ta bort media och pipett i ett 15 ml koniskt rör. Skölj kolvarna två gånger med 3 ml varm MGM och tillsätt tvätt till de 15 ml koniska rören. Dessa är microglia.
- Tillsätt 5 ml varm, färsk mgm till odlingskolvarna.
- Återförslut kolvarna med paraffinfilm, säkra kolvarna horisontellt på skakapparaten och skaka vid 15 x g vid 37 °C i 15 timmar för separation av OPC från astrocyter.
OBS: Detta steg kan göras över natten, men skakningstiden på 15 timmar är kritisk eftersom överskottstid kan leda till celldöd. - Centrifugera supernatanten från steg 4.3. vid 300 x g i 3 min och odlingsmikroglia enligt standardprotokoll16 eller användning för en biologisk analys.
5. Oligodendrocytprekursorcellisolering
OBS: Vid plätering av OPC efter initial isolering måste de pläteras på en poly-D-lysinbelagd yta (steril platta eller täckglidning). Förbered dessa material innan detta avsnitt är klart.
- Efter 15 timmars skakning, ta bort supernatanten från kolvarna och plåten på steril 100 mm petriskål.
- Inkubera supernatanten vid 37 °C, 5%CO2 i 30 min, virvla efter 15 min för att ta bort återstående mikroglia, eftersom dessa mycket snabbt fäster vid skålen. Icke-vävnadsodlingsbehandlade petriskålar kan användas för detta steg.
- Ta bort icke-vidhäftande cellsupernatant, räkna och platta på en poly-D-lysinbelagd yta. Vanligtvis är 7 500-10 000 OPC pläterade/cm2.
- Inkubera vid 37 °C, 5%CO2 i minst 1 timme (upp till 6 timmar), sug sedan försiktigt 95% av media och tillsätt långsamt varma OPC Media, pipetterande media mot brunnens vägg för att minimera störningar av OPC. Byt media var 48: e timme tills cellerna är redo att användas.
OBS: Det är viktigt att endast en brunn ändras åt gången. OPC är känsliga och är särskilt intoleranta mot torra förhållanden. Tillägget av PDGF-AA i OPC-media är att fördröja OPC-mognad till oligodendrocyter. Denna faktor kan uteslutas från odlingsmedier om det experimentella fokuset är mogna oligodendrocyter.
6. Astrocytisolering
- Efter 15 h skaka, ta bort supernatant och skölj kolvarna 2x med varm 1x PBS.
- Tillsätt 4 ml 0,05 % trypsin innehållande 0,53 mM EDTA och inkubera vid 37 °C, 5 % CO2i 5 minuter eller tills cellerna har lyft. För att säkerställa att astrocyter har lyft, visualisera dem med ett vanligt bredfältmikroskop. Astrocyter kommer att visas sfäriska efter trypsinisering.
- När astrocyterna har lossnat, ställ kolven vertikalt och tillsätt 4 ml MGM. Triturate att blanda.
- Pipettera astrocyter i ett 15 ml koniskt rör, centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Återsuspendera astrocyter i astrocytmedia och platta på fibronektinbelagd yta enligt beskrivningen i steg 1.2. eller använd för biologisk analys.
OBS: 20 ng / ml murin fibroblast tillväxtfaktor kan läggas till under den första medieförändringen för att hjälpa till att etablera astrocytkulturen. Dessutom kan standardgelatinbeläggning vara ett billigt alternativ till fibronektin.
7. Identifiering och isolering av mikroglia, OPCs, astrocyter och mogna oligodendrocyter med hjälp av immunocytokemi
- När pläterade celler har nått lämplig sammanflöde, ta försiktigt bort media och fixera vidhäftande celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minuter. Gör detta steg i ett biosäkerhetsskåp.
OBS: När du aspirerar eller lägger till lösningar, pipettera med försiktigt tryck för att förhindra cellavskiljning. - Aspirera långsamt PFA och tvätta sedan cellerna 3x med 1x PBS i 5 min.
- Förbered lämplig blockeringslösning med 10% serum och 0,1% Triton X-100 i 1x PBS.
OBS: Serumkällan återspeglar värddjuret där den sekundära antikroppen föddes. Till exempel, om den sekundära antikroppen är get-antikanin, är det lämpliga blockerande serumet normalt getserum. På samma sätt, om den sekundära antikroppen är åsna anti-kanin, bör det blockerande serumet vara normalt åsneserum. - Tillsätt blockeringslösning tills cellerna är helt täckta. Blockera i 1 h vid rumstemperatur.
- Bered en antikroppsutspädningslösning (9 ml 1x PBS, 0,01 g bovint serumalbumin, 30 μL Triton X-100). Alternativt kan antikroppar spädas i den blockerande lösning som beskrivs i steg 6.3.
- Späd primära antikroppar som är specifika för följande i antikroppsutspädningsmedel eller blockerande lösning:
- Microglia: joniserad kalciumbindande adaptermolekyl 1 (Iba1) vid en utspädning på 1:250 (2,4 μg/ml).
- OPCs: neuralt/glialt antigen 2 (NG2) vid en utspädning på 1:200 (5 μg/ml).
- Mogna oligodendrocyter: myelinbasiskt protein (MBP) vid en utspädning på 1:400 (koncentrationen är mycket beroende och optimering kan vara nödvändig).
- Astrocyter: glialfibrillärt surt protein (GFAP) vid en utspädning på 1:400(0,25 μg/ml)17.
OBS: Blanda inte primära antikroppar uppfödda i samma art.
GFAP kommer på ett tillförlitligt sätt att märka astrocyter av vit substans. För grå substansastrocyter kan en alternativ markör behöva användas.
- Inkubera primär antikropp över natten vid 4 °C (med mild omrörning är att föredra).
- Tvätta 3x med 1x PBS i 5 min för att ta bort den primära antikroppen.
- Inkubera celler med lämpliga sekundära antikroppar vid en utspädning på 1:400 i antikroppsutspädningsmedel eller blockerande lösning skyddad från ljus.
OBS: Sekundära antikroppar konjugeras till en fluorofor som kan bytas ut beroende på tillgängliga mikroskopparametrar. När fluorescerande sekundära antikroppar har applicerats, skydda mot ljus så mycket som möjligt. - Inkubera sekundär antikropp i 1 h vid rumstemperatur, vilket begränsar exponeringen för ljus.
- Tvätta 3 gånger med 1x PBS i 5 min för att ta bort överflödig sekundär antikropp.
- För att märka kärnor, använd en 1: 1,000 DAPI / PBS-lösning och inkubera celler i 5 minuter vid rumstemperatur i mörkret.
- Tvätta 3x med 1x PBS i 5 min i mörkret.
- För att montera, applicera monteringsmedia och låt torka i mörkret innan du bildar.
OBS: Monterade bilder kan förvaras vid rumstemperatur i 2-3 dagar. För långvarig lagring, flytta bilderna till 4 °C. Bild inom en vecka för maximal signal. Alla representativa bilder har avbildats på ett konfokalmikroskop; Inverterade fluorescerande mikroskop rekommenderas dock också.
Representative Results
Representativa data som visas nedan illustrerar att IFNγ-signalering påverkar OPC-differentiering och mognad. Utan närvaro av IFNγ-receptor (IFNγR) differentieras inte kortikala OPC till mogna myeliniserande oligodendrocyter lika lätt, vilket framgår av frånvaron av MBP-färgning (Figur 1). Eftersom oligodendrocyter och astrocyter härrör från en gemensam stamfader analyserade vi GFAP-uttryck, som märker astrocyter. Vi fann att IFNγR-bristfälliga celler starkt uttrycker GFAP som tyder på att de kan anta en astrocytisk fenotyp, vilket bekräftar tidigare rapporter19.
Ytterligare bevis för regional heterogenitet i CNS-celler bevisas av varierande astrocytmorfologi som ses i astrocyter från cortex, cerebellum, hjärnstam och ryggmärg (figur 2). Observera att astrocyter från samma region också kan uppvisa morfologisk heterogenitet, vilket stöder uppfattningen att denna gliala subtyp är mycket dynamisk. Skillnaderna i cellulär arkitektur tyder på funktionell mångfald och därmed är förmågan att isolera glialpopulationer nödvändig för att studera fenotypiska svar i frånvaro och närvaro av mikromiljöstimuli.
Oligodendrocyter är avgörande för myelinering av neuronala axoner och är nödvändiga för korrekt CNS-reparation och funktion. OPC ger upphov till sina mogna motsvarigheter, vilket gör det viktigt att förstå biologin bakom deras förmåga att differentiera. Cytokinsignalering påverkar signifikant stam- och immuncellsbeteende. Därför är det viktigt att förstå hur regionala svar från OPC kan variera till differentiell cytokinstimulering (figur 3), vilket kan påverka deras förmåga att differentiera till mogna myeliniserande oligodendrocyter.
Figur 1: Representativa data som visar OPC-differentiering i WT- och IFNγR-/- möss i närvaro av exogen IFNγ. Kortikala OPC isolerades från ( A ) WT och (B) IFNγR-/- P4-musungar enligt proceduren som beskrivs ovan. Celler behandlades med 1 ng / ml IFNγ i 48 timmar, fixerades sedan och färgades för att avgränsa celldifferentiering. OPC märktes för NG2 och GFAP för att identifiera de som antog en astrocytisk fenotyp. På samma sätt märktes OPC också för NG2 och MBP för att identifiera de som differentierades till mogna oligodendrocyter. Skalstreck = 20 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa data som visar regional heterogenitet i astrocytmorfologi. Astrocyter från cortex, cerebellum, hjärnstam och ryggmärg isolerades från P4-musungar med hjälp av protokollet som beskrivs ovan och märktes för GFAP (grönt) med immunocytokemi efter 48 timmar i odling. Skalstreck = 20 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa data som visar differentiella svar från regionala OPC på cytokiner. OPC isolerades från hjärnstammen och ryggmärgen hos P4-musungar med hjälp av protokollet som beskrivs ovan. Celler behandlades med ökande koncentrationer (1-10 ng/ml) av (A) IFNγ eller (B) interleukin ( IL ) -17 för att undersöka cytokinets differentiella påverkan på förmågan hos regionala OPCs att differentiera till myeliniserande oligodendrocyter. Efter en 48 timmars inkubation med specificerade cytokiner fixerades och märktes OPC för NG2 (grön) och MBP (röd). Skalstreck = 20 μM. Data representerar medel ± SEM. **, p < 0,01; , s < 0,001; , s < 0,0001 av 2-vägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PBS/antibiotikalösning (PAS): | ||
| 1,0 ml | 100X Antibiotikum/Antimykotika innehållande 10 000 enheter/ml penicillin och 10 000 mg/ml streptomycin | |
| 25 mg/ml | Amfotericin B | |
| 99 ml | 1X PBS | |
| Blandade Glia Media (MGM) | ||
| 88 ml | 1X DMEM (hög glukos, w / L-glutamin, w / Na pyruvat) | |
| 10 ml | Värmeinaktiverad FBS | |
| 1,0 ml | L-glutamin (100X) | |
| 1,0 ml | Antibiotika/Antimykotika | |
| OPC-media (50ml) | ||
| 49 ml | Neurobasala medier | |
| 1,0 ml | B27 tillägg (50X) | |
| 10 ng/ml | PDGF-AA | |
| PDGF-AA läggs till färskt före varje medieändring. | ||
| Astrocyt Media (1 L) | ||
| 764 ml | MEM med Earles salter som innehåller glutamin | |
| 36 ml | Glukos (använd 100 mg/ml lager för slutlig koncentrat på 20 mM) | |
| 100 ml | Värmeinaktiverad FBS | |
| 100 ml | Värmeinaktiverat hästserum | |
| 10 ml | Glutamin (använd 200 mM lager om det inte ingår i lagermedium) | |
| VALFRITT: 10 ng / ml rekombinant mus epidermal tillväxtfaktor | ||
| OBS: Sterilt filtrera alla medier och förvara vid 4 °C tills det används. | ||
Tabell 1: Buffert- och medierecept.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi isoleringen av de tre stora glialcellsunderpopulationerna från musens CNS: microglia, OPC och astrocyter. Ett stort bakslag för undersökningen av neurodegenerativa och neuroinflammatoriska CNS-sjukdomar är bristen på primära mänskliga celler och vävnader, särskilt de som är regionala och från samma patient. I de flesta fall härrör mänskliga CNS-cellinjer från transformerade, odödliga cancerceller som kanske inte är korrekta representationer av deras normala fysiologiska beteende20,21,22. Således är alternativa metoder nödvändiga för att studera CNS-cellfenotyper på ett kontrollerat sätt. Dessutom gör mångfalden av neurologiska gliacellspopulationer det nödvändigt att undersöka varje subtyp både oberoende av varandra, såväl som i samodlingsförhållanden för att rekapitulera både deras cellautonoma och icke-autonoma funktioner. Gliaceller har en mängd olika kritiska funktioner i CNS, allt från neuronalt stöd23, inlärning / kognition 24,25 och CNS immunologiska svar26. Som sådan är det nödvändigt att förstå de molekylära och cellulära funktionerna hos varje glial delpopulation i ett fysiologiskt och patologiskt sammanhang. För att göra det tillhandahåller vi här en pålitlig metod för extraktion och isolering av livskraftiga glia-subtyper. På grund av praktiska och etiska begränsningar i försökspersonernas forskning är djurmodeller för närvarande de mest relevanta surrogaten för mänsklig gliacellsbiologi. I synnerhet är möss idealiska modelldjur eftersom deras genom kan manipuleras och analyseras för att ytterligare dissekera särskilda molekylära mekanismer som ligger till grund för hälsa och sjukdom. Därför är framgångsrikt avlägsnande och separation av murina mikroglia, OPC och astrocyter ett viktigt verktyg för att undersöka gliafunktionerna under fysiologiska, neurodegenerativa eller neuroinflammatoriska tillstånd.
Detta protokoll kan optimeras för att utforska CNS-cellens regionala heterogenitet. Det blir allt tydligare att glia uppvisar regional heterogenitet i form och funktion. Astrocyter är regionalt olika och visar distinkt morfologi beroende på deras plats inom CNS27. Dessutom kan tätheten av astrocyter och deras mitotiska index definiera anatomiska regioner, vilket stöder hypotesen att regional astrocytheterogenitet kan återspegla molekylära och funktionella skillnader baserat på deras placering inom CNS28. Mikroglial regional heterogenitet är också under aktiv undersökning, även om de underliggande mekanismerna och funktionella konsekvenserna av mikrogliadiversitet i CNS-utveckling eller beteende för närvarande är oklara. Det är dock känt att vuxna mikroglia visar mångfald i cellantal, cell- och subcellulära strukturer och molekylära signaturer29. Dessutom har de senaste framstegen inom multiplexerad masscytometri ytterligare definierat den regionala heterogeniteten hos microglia, analyserat cellulär fenotyp från fem olika CNS-regioner hos nio mänskliga givare, vilket möjliggör storskalig immunofenotypning av human microglia30. För närvarande är sådana tillvägagångssätt i sina begynnande stadier, vilket gör djurstudier till en livskraftig lösning för studier av regional glia i CNS-sjukdomsutveckling. Slutligen har regional heterogenitet också nyligen beskrivits i oligodendrocyter. Encells RNA-sekvensering på 5072 enskilda celler från 10 regioner av juvenil och vuxen CNS identifierade 13 distinkta delpopulationer över olika stadier av differentiering31. Viktigt var också att det visade sig att när oligodendrocyter mognade från OPCs divergerade deras transkriptionsprofiler och deras funktionella fenotyper förändrades, vilket belyser oligodendrocyt heterogenitet inom CNS31.
Att förstå regional heterogenitet hos de olika bosatta CNS-cellerna i samband med deras olika närliggande neuroner och andra glia kan således ge viktig motivering för den framtida utvecklingen av nya terapier för att behandla neuroinflammatoriska och neurodegenerativa störningar. Medan detta protokoll fokuserar på extraktion, isolering och identifiering av gliala delpopulationer, ger det en bekväm utgångspunkt för undersökningen av deras funktion. Dessutom kan den anpassas och kombineras med transgena musmodeller för att studera genetiska mekanismer associerade med gliacellsbiologi. Det kan också användas för att undersöka glialcellernas svar på varandra i samodlingsanalyser. De skisserade stegen representerar en kostnadseffektiv och genomströmningsmetod för att extrahera och isolera olika CNS-glialpopulationer som sedan kan anpassas till en mängd olika experimentella parametrar. Det bör noteras; Men att metoden som beskrivs här använder nyfödda på grund av de lägre nivåerna av myelinering och hög densitet av prolifererande glia. Av dessa skäl är det tekniskt mer genomförbart att isolera livskraftig glia från nyfödda jämfört med vuxna djur. De fenotypiska skillnaderna i neonatal glia jämfört med vuxen glia bör därför beaktas vid experimentell design och datatolkning.
Disclosures
Författarna har intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Morgan Psenicka för manuskriptredigering och diskussion och Dr. Grahame Kidd för hjälp med figurformatering. Detta arbete stöddes av NIAID K22 AI125466 (JLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
| 12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
| 50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
| B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
| DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
| Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
| Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
| Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
| Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
| Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
| L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
| Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
| Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
| Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
| Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
| Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
| Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
| Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
| Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
| Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
| Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
| Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
| Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |
References
- Fields, R. D., et al. Glial Biology in Learning and Cognition. The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Nuriya, M., Hirase, H.
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).
- Kierdorf, K., Prinz, M.
- Hertz, L., Chen, Y. Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning. Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).
- Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).
- Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R.
- Sharif, Y., et al. Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease. Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).
- von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. Glial Cells and Integrity of the Nervous System. Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H.
- Liu, R., et al. Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor. Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Witting, A., Moller, T. Microglia cell culture: a primer for the novice. Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).
- Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma. Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).
- Stevens, B. Glia: much more than the neuron's side-kick. Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).
- Fields, R. D., et al. Glial biology in learning and cognition. Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).
- Hartenstein, V., Giangrande, A. Connecting the nervous and the immune systems in evolution. Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).
- Emsley, J. G., Macklis, J. D. Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS. Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).
- Chaboub, L. S., Deneen, B. Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development. Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bottcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).
- Marques, S., et al. Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system. Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).
