Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.
Abstract
I metodi qui presentati dimostrano procedure di laboratorio per la dissezione di quattro diverse regioni del sistema nervoso centrale (SNC) da neonati murini per l'isolamento di sottopopolazioni gliali. Lo scopo della procedura è quello di dissociare microglia, cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) e astrociti dal tessuto corticale, cerebellare, del tronco cerebrale e del midollo spinale per facilitare ulteriori analisi in vitro. Le procedure di isolamento della regione del SNC consentono di determinare l'eterogeneità regionale tra le glia in più sistemi di coltura cellulare. Viene eseguito un rapido isolamento della regione del SNC, seguito dalla rimozione meccanica delle meningi per prevenire la contaminazione delle cellule meningee della glia. Questo protocollo combina la dissociazione delicata dei tessuti e la placcatura su una matrice specificata progettata per preservare l'integrità e l'aderenza cellulare. L'isolamento della glia mista da più regioni del SNC fornisce un'analisi completa di glia potenzialmente eterogenee, massimizzando al contempo l'uso di singoli animali da esperimento. Inoltre, dopo la dissociazione del tessuto regionale, le glia miste sono ulteriormente suddivise in più tipi di cellule tra cui microglia, OPC e astrociti per l'uso in un singolo tipo di cellula, inserti di piastre di coltura cellulare o sistemi di co-coltura. Nel complesso, le tecniche dimostrate forniscono un protocollo completo di ampia applicabilità per un'attenta dissezione di quattro singole regioni del SNC da neonati murini e includono metodi per l'isolamento di tre singoli tipi di cellule di glia per esaminare l'eterogeneità regionale in qualsiasi numero di sistemi o saggi di coltura cellulare in vitro.
Introduction
Le glia sono necessarie per una corretta funzione neuronale nel SNC. Sono composti da tre sottopopolazioni principali, astrociti, oligodendrociti e microglia, ognuna con un ruolo diverso, ma indispensabile1. Senza la corretta diversità e attività delle cellule gliali, la funzione neuronale sarebbe gravemente compromessa, portando a compromissione del SNC. Le glia sono in grado di influenzare la neurotrasmissione e ogni tipo di cellula lo fa in modo unico. Le cellule gliali nel cervello hanno la capacità di comunicare tra loro, così come con le cellule neuronali, al fine di facilitare la corretta funzione del SNC2. Gli oligodendrociti aumentano la velocità di trasmissione elettrica attraverso la formazione di una guaina mielinica, che facilita il raggruppamento dei canali ionici ai nodi di Ranvier, i siti di generazione potenziale di azione neuronale3. Le microglia sono fondamentali per la potatura delle sinapsi monitorando la trasmissione sinaptica e "ricablando" le connessioni neuronali dopo la lesione4. Inoltre, le microglia sono la cellula immunitaria residente più abbondante del SNC, agendo come forma primaria di difesa dell'ospite contro i patogeni5. Gli astrociti possono regolare la trasmissione sinaptica tra i neuroni modificando la concentrazione di potassio extracellulare6. Hanno anche ruoli nel controllo del flusso sanguigno locale7, nel rilascio e nell'assorbimento degli elementi neuromodulatori8 e hanno un ruolo chiave nel mantenimento della barriera emato-encefalica9. Pertanto, ogni sottotipo gliale è fondamentale per la funzione del SNC, poiché i difetti di qualsiasi tipo sono stati a lungo associati a un'ampia varietà di stati patologici, tra cui malattie psichiatriche, epilessia e condizioni neurodegenerative10.
Il più grande ostacolo nello studio della patobiologia del SNC è l'incapacità di studiare le cellule umane nel contesto della loro nicchia microambientale. Il tessuto bioptico umano è la maggior parte raccolto post-mortem e le cellule possono essere facilmente danneggiate o perse durante l'estrazione e la lavorazione. Inoltre, è una sfida mantenere le cellule umane vive e vitali in vitro per un certo periodo di tempo senza derivare linee cellulari immortalizzate dai tumori, a quel punto non riflettono più accuratamente le loro normali proprietà fisiologiche11,12. Inoltre, esiste una quantità significativa di eterogeneità regionale tra i singoli tipi di cellule gliali13,14,15 e ottenere campioni regionali del SNC dai singoli pazienti è quasi impossibile. Come tale, è necessario sviluppare modelli alternativi per studiare il contributo della glia regionale in specifici disturbi del SNC.
Qui, descriviamo un sistema in vitro che utilizza l'isolamento specifico della regione del SNC di topo di più sottopopolazioni gliali, consentendo la manipolazione e la quantificazione di microglia, cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), che danno origine a oligodendrociti maturi e astrociti. Ogni popolazione può essere isolata in modo indipendente e sottoposta a un'ampia varietà di tecniche sperimentali tra cui il trattamento di farmaci o molecole, immunocitochimica, estrazione e analisi di proteine / RNA e altri sistemi di co-coltura a seconda delle necessità sperimentali. Inoltre, questa tecnica di isolamento produce un elevato numero di cellule, consentendo la caratterizzazione e l'indagine di ciascuna popolazione gliale in modo ad alto rendimento. Consente inoltre lo studio della differenziazione, della crescita e della proliferazione delle cellule del SNC in risposta a un'ampia varietà di stimoli microambientali in modo controllato al fine di evitare fattori confondenti che sono tipicamente presenti in un ambiente in vivo. Infine, questa tecnica di isolamento cellulare facilita la manipolazione delle popolazioni di cellule gliali all'interno di diverse regioni del SNC per studiare come le glia regionali interagiscono tra loro e rispondono a stimoli variabili, consentendo precisione e riproducibilità.
Protocol
NOTA: Tutti gli studi sugli animali sono stati autorizzati e approvati dal Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparare i mezzi e le forniture per la dissezione
NOTA: tutte le ricette relative al buffer e ai supporti sono riportate nella tabella 1. Questa procedura viene eseguita in condizioni sterili in una coltura tissutale designata armadietto di biosicurezza.
- Preparare e sterilizzare i media gliari misti filtranti (MGM). Questo può essere fatto il giorno prima e conservato a 4 °C.
- Fibronectina diluita ad una concentrazione di 1:100 con H2O sterile. Il volume della fibronectina diluita dipenderà dal numero di cuccioli e dalla regione del SNC utilizzata per l'esperimento. Utilizzare un matraccio T25 per 1 corteccia, un matraccio T25 per 2-4 cerebella, un matraccio T25 per 2-4 tronchi cerebrali e un matraccio T25 per 2-4 midollo spinale.
NOTA: La combinazione di tessuti provenienti dalla stessa regione utilizzando i criteri sopra elencati consentirà un'adeguata dissociazione senza alterare il protocollo descritto di seguito. La combinazione di più tessuto di quanto descritto nella fase 1.2 richiederà un'ulteriore ottimizzazione delle concentrazioni di reagenti di dissociazione. - Pipettare 3 mL di fibronectina diluita in palloni T25 a temperatura ambiente e lasciare riposare per 2 minuti.
- Aspirare la fibronectina e lasciare asciugare i palloni per una notte con il coperchio del pallone allentato.
2. Dissezione della corteccia, del cervelletto, del tronco cerebrale e del midollo spinale
NOTA: questa procedura può essere eseguita sul piano di lavoro e richiede un ambito di dissezione. Utilizzare una rigorosa tecnica asettica per tutte le fasi della procedura e ridurre al minimo l'esposizione dei tessuti all'aria ambiente. Mantenere tutti i fluidi refrigerati sul ghiaccio durante la dissezione per garantire la massima conservazione dei tessuti. In alternativa, questa procedura potrebbe essere eseguita in un cappuccio che consente l'uso di un cannocchiale di dissezione interno.
- Pulire tutte le aree con etanolo al 70%.
- Pipettare 10 mL di PBS/soluzione antibiotica (PAS) in una capsula di Petri da 10 cm. Prepara una capsula di Petri per ogni cucciolo da sezionare. Mettere su ghiaccio per mantenere la soluzione fredda.
- In una cappa di coltura di tessuti disinfettata, pipettare 9 mL di DMEM (senza additivi) in 4 tubi conici separati da 15 ml, uno per ogni regione del SNC, sostituire i tappi dei tubi e mettere su ghiaccio. Posizionare il secchiello del ghiaccio con i tubi a breve distanza dall'oscilloscopio di dissezione.
- Posizionare la capsula di Petri di 10 cm preparata al punto 2.2 sullo stadio di dissezione dell'oscilloscopio disinfettato.
- Anestetizzare ed eutanasia il cucciolo di topo secondo il protocollo istituzionale e rimuovere la testa con una rapida decapitazione con forbici affilate.
NOTA: Giorno postnatale (P) Vengono utilizzati 3-5 cuccioli. I cuccioli più anziani hanno un SNC più sviluppato e potrebbero non essere una fonte adeguata di cellule gliali in espansione. I cuccioli più giovani (P) 0-2 possono produrre un numero maggiore di glia e possono essere utilizzati; Tuttavia, il tessuto del midollo spinale è molto difficile da sezionare in questa giovane età a causa delle dimensioni. - Pulire la pelle del cucciolo usando etanolo al 70%.
- Usando le forbici sottili, tagliare lo strato cutaneo lungo la linea mediana della testa dell'animale, iniziando caudalmente e spostando rostrale, fino a raggiungere il muso. Evitare di tagliare profondamente nel cranio per evitare danni ai tessuti.
- Inclinando la testa verso il basso, tirare lo strato cutaneo su ciascun lato del cranio e usando le forbici a molla, fare un'incisione lungo la linea mediana del cranio, iniziando dal forame magno, tagliando di nuovo da caudale a rostrale.
- Con una pinza a punta fine, tirare le metà del cranio verso i lati destro e sinistro, esponendo la corteccia, il cervelletto e il tronco cerebrale.
- Una volta esposto, sollevare delicatamente il cervello dal cranio e nella capsula di Petri di 10 cm preparata nel passaggio 2.2. Assicurarsi che il cervello rimanga intatto per preservare la struttura anatomica, con il cervello posteriore attaccato.
- Usando una pinza fine a punta curva con la punta della pinza rivolta verso l'alto, pizzica il cervelletto. Rimuovere le meningi e metterle in un apposito tubo conico da 15 ml nel secchiello del ghiaccio.
- Assicurarsi che il tronco cerebrale sia direttamente ventrale al cervelletto e sia visibile dopo la rimozione del cervelletto. Rimuoverlo con una pinza a punta fine, rimuovere le meningi e metterlo in un tubo conico da 15 ml designato nel secchiello del ghiaccio.
- Separare il mesencefalo dalla corteccia, rimuovere le meningi corticali e posizionare in un tubo conico designato da 15 ml nel secchiello del ghiaccio.
- Per rimuovere il midollo spinale, posizionare il cucciolo di topo decapitato in posizione supina (sdraiato a faccia in su) con la colonna vertebrale recisa sollevata verso lo sperimentatore.
- Spruzzare nuovamente con etanolo al 70%.
- Tagliare lungo i lati laterali della colonna vertebrale, in direzione da rostrale a caudale, attraverso la gabbia toracica fino a raggiungere gli arti posteriori. Durante il taglio, spingere indietro gli organi interni fino a quando la colonna vertebrale è visibile.
- Tagliare lungo ciascun lato laterale della colonna vertebrale fino a isolarlo e posizionarlo nella capsula di Petri di 10 cm preparata al punto 2.2.
- Con il lato ventrale verso l'alto, usando sottili forbici a molla, alternare il taglio dei lati destro e sinistro di ciascuna vertebra fino a raggiungere la regione lombare per esporre il tessuto del midollo spinale.
- Rimuovere delicatamente il midollo spinale e le meningi con una pinza a punta fine al microscopio da dissezione. Mettere in un apposito tubo conico da 15 mL nel secchiello del ghiaccio.
- Ripetere i passaggi da 2.5.-2.19 per ogni cucciolo, combinando tessuto della stessa regione per soddisfare i criteri delineati al punto 1.2 per ogni matraccio T25 preparato.
NOTA: Rimuovere le meningi il più completamente possibile. Se rimane una quantità significativa di meningi, il fenotipo simile ai fibroblasti delle cellule meningee supererà e travolgerà la coltura cellulare. Più midollo spinale, di uguale fenotipo, possono essere combinati al fine di generare una specifica coltura cellulare. Fare attenzione a garantire che non si verifichi un sovraffollamento delle cellule, che può portare all'apoptosi gliale e ai fenotipi differenziali.
3. Dissociazione tissutale
NOTA: Tutte le seguenti procedure vengono eseguite in una coltura di tessuto sterile denominata armadio di biosicurezza utilizzando tecnica asettica e materiali sterili.
- Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,05% contenente 0,53 mM EDTA a ciascun tubo conico da 15 mL di DMEM da 9 mL e tessuto per iniziare la lisi tissutale.
NOTA: DMEM contiene un'elevata quantità di cloruro di calcio, che può agire come inibitore della tripsina. Se la dissociazione non è completa seguendo i passaggi descritti, è possibile utilizzare la soluzione salina bilanciata di Hanks senza calcio o magnesio. Dopo la tripsinizzazione, l'enzima può essere neutralizzato aggiungendo un inibitore della tripsina, anche se il calcio deve essere aggiunto nuovamente alla soluzione in quanto è un cofattore per la DNasi I, che viene utilizzato nelle fasi successive. - Triturare con una pipetta da 10 mL circa 20x.
- Trasferire le sospensioni cellulari in tubi conici vuoti da 50 ml.
- Incubare la soluzione a 37 °C, 5% CO2 per 15 minuti, agitando delicatamente i lisati dopo 8 minuti.
- Aggiungere 5 ml di MGM e 200 μL (5 mg/ml) di DNasi I a ciascuna provetta per una concentrazione finale di 50 μg/ml.
- Triturare ogni lisato con una pipetta da 10 mL 10x.
- Lasciare riposare le sospensioni cellulari per 3 minuti a temperatura ambiente per consentire al tessuto non dissociato di depositarsi sul fondo dei tubi.
- Trasferire le sospensioni cellulari in nuovi tubi conici da 50 ml, lasciando dietro di sé il tessuto non dissociato.
NOTA: Le fasi di lisi e triturazione sopra descritte limitano significativamente la quantità di tessuto non dissociato. - Centrifugare i tubi a 300 x g per 3 minuti a 4 °C senza freno.
- Aspirare il surnatante e risospendere i pellet cellulari rimanenti in 5 mL di MGM.
- Triturare il pellet con una pipetta da 5 mL 20x.
- Placcare le sospensioni di celle da 5 mL su matraccio T25 rivestiti.
- Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 e cambiare i mezzi inizialmente dopo 24 ore per rimuovere i detriti cellulari.
NOTA: Alcuni protocolli raccomandano un cambio iniziale del supporto dopo 72 ore. Potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione di questo passaggio. - Eseguire un cambio di media al 100% con MGM ogni 48-72 ore fino a quando le cellule sono confluenti all'80% (circa 5-7 giorni).
NOTA: tutti i fluidi devono essere riscaldati a 37 °C prima di cambiare il fluido.
4. Isolamento della microglia
- Una volta che le colture miste di glia hanno raggiunto l'80% di confluenza, preparare i palloni per l'agitazione serrando i coperchi e sigillando con pellicola di paraffina.
- Per rimuovere la microglia dalle colture gliali miste, fissare orizzontalmente i palloni su uno shaker orbitale all'interno di un'incubatrice a 37 °C. Agitare i palloni a 15 x g per 1 ora.
- Rimuovere il fluido e la pipetta in un tubo conico da 15 ml. Risciacquare due volte i palloni con 3 mL di MGM caldo, aggiungendo il lavaggio ai tubi conici da 15 ml. Queste sono le microglia.
- Aggiungere 5 ml di MGM caldo e fresco ai palloni di coltura.
- Richiudere i palloni con pellicola di paraffina, fissare i palloni orizzontalmente sull'agitatore e agitare a 15 x g a 37 °C per 15 ore per la separazione degli OPC dagli astrociti.
NOTA: Questo passaggio può essere eseguito durante la notte, ma il tempo di agitazione di 15 ore è fondamentale in quanto il tempo in eccesso può causare la morte cellulare. - Centrifugare il surnatante dal punto 4.3. a 300 x g per 3 min e coltura microglia secondo protocolli standard16 o utilizzare per un saggio biologico.
5. Isolamento delle cellule precursori degli oligodendrociti
NOTA: Quando si placcano OPC dopo l'isolamento iniziale, devono essere placcati su una superficie rivestita di poliD-lisina (piastra sterile o vetrino di copertura). Preparare questi materiali prima del completamento di questa sezione.
- Dopo 15 ore di agitazione, rimuovere il surnatante dai palloni e placcare su una capsula di Petri sterile da 100 mm.
- Incubare il surnatante a 37 °C, 5% CO2 per 30 minuti, ruotando dopo 15 minuti per rimuovere le microglia rimanenti, poiché queste aderiranno molto rapidamente al piatto. Per questa fase possono essere utilizzate piastre di Petri non trattate con colture tissutali.
- Rimuovere il surnatante cellulare non aderente, contare e placcare su una superficie rivestita di poli-D-lisina. Tipicamente, 7.500-10.000 OPC sono placcati/cm2.
- Incubare a 37 °C, 5% CO2 per almeno 1 ora (fino a 6 ore), quindi aspirare delicatamente il 95% del fluido e aggiungere lentamente il mezzo OPC caldo, pipettando il fluido contro la parete del pozzo per ridurre al minimo l'interruzione degli OPC. Cambiare il supporto ogni 48 ore fino a quando le celle sono pronte per l'uso.
NOTA: È fondamentale che venga sostituito un solo pozzo alla volta. Gli OPC sono sensibili e sono particolarmente intolleranti alle condizioni asciutte. L'aggiunta di PDGF-AA nei terreni OPC ritarda la maturazione di OPC in oligodendrociti. Questo fattore può essere escluso dai terreni di coltura se il focus sperimentale sono gli oligodendrociti maturi.
6. Isolamento degli astrociti
- Dopo 15 ore di agitazione, rimuovere il surnatante e sciacquare i palloni 2x con 1x PBS caldo.
- Aggiungere 4 mL di tripsina allo 0,05% contenente 0,53 mM EDTA e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 5 minuti o fino a quando le cellule non si sono sollevate. Per garantire che gli astrociti si siano sollevati, visualizzarli utilizzando un microscopio a campo largo standard. Gli astrociti appariranno sferici dopo tripsinizzazione.
- Una volta che gli astrociti si sono staccati, posizionare il pallone verticalmente e aggiungere 4 mL di MGM. Triturare per mescolare.
- Pipettare gli astrociti in un tubo conico da 15 ml, centrifugare a 300 x g per 5 min.
- Risospendere gli astrociti nei mezzi di astrociti e placcarli sulla superficie rivestita di fibronectina come descritto al punto 1.2. o utilizzare per il saggio biologico.
NOTA: Il fattore di crescita dei fibroblasti murini di 20 ng / mL può essere aggiunto durante il primo cambio di terreno per aiutare a stabilire la coltura degli astrociti. Inoltre, il rivestimento standard di gelatina può essere un'alternativa a basso costo alla fibronectina.
7. Identificazione e isolamento di microglia, OPC, astrociti e oligodendrociti maturi mediante immunocitochimica
- Una volta che le cellule placcate hanno raggiunto la confluenza appropriata, rimuovere delicatamente il mezzo e fissare le cellule aderenti usando il 4% di paraformaldeide (PFA) per 10 minuti. Fai questo passaggio in un armadio di biosicurezza.
NOTA: Quando si aspirano o si aggiungono soluzioni, pipettare con una leggera pressione per evitare il distacco della cella. - Aspirare lentamente il PFA, quindi lavare le celle 3x con 1x PBS per 5 minuti.
- Preparare una soluzione bloccante appropriata utilizzando il 10% di siero e lo 0,1% di Triton X-100 in 1x PBS.
NOTA: La fonte di siero riflette l'animale ospite in cui è stato allevato l'anticorpo secondario. Ad esempio, se l'anticorpo secondario è l'anti-coniglio di capra, il siero bloccante appropriato è il siero di capra normale. Allo stesso modo, se l'anticorpo secondario è l'anti-coniglio dell'asino, il siero bloccante dovrebbe essere un normale siero d'asino. - Aggiungere la soluzione di blocco fino a quando le celle sono completamente coperte. Bloccare per 1 h a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione di diluente anticorpale (9 ml di 1x PBS, 0,01 g di albumina sierica bovina, 30 μL Triton X-100). In alternativa, gli anticorpi possono essere diluiti nella soluzione bloccante descritta al punto 6.3.
- Anticorpi primari diluiti specifici per quanto segue in soluzione anticorpale diluente o bloccante:
- Microglia: molecola 1 dell'adattatore legante il calcio ionizzato (Iba1) ad una diluizione di 1:250 (2,4 μg/ml).
- OPC: antigene neurale/gliale 2 (NG2) ad una diluizione 1:200 (5 μg/mL).
- Oligodendrociti maturi: proteina basica della mielina (MBP) ad una diluizione di 1:400 (la concentrazione è dipendente dal lotto e può essere necessaria un'ottimizzazione).
- Astrociti: proteina acida fibrillare gliale (GFAP) ad una diluizione 1:400 (0,25 μg/ml)17.
NOTA: Non mescolare anticorpi primari allevati nella stessa specie.
NOTA: GFAP etichetterà in modo affidabile gli astrociti della sostanza bianca. Per gli astrociti della materia grigia, potrebbe essere necessario utilizzare un marcatore alternativo.
- Incubare l'anticorpo primario per una notte a 4 °C (è preferibile agitare delicatamente).
- Lavare 3 volte con 1x PBS per 5 minuti per rimuovere l'anticorpo primario.
- Incubare le cellule con anticorpi secondari appropriati ad una diluizione 1:400 in diluente anticorpale o soluzione bloccante protetta dalla luce.
NOTA: Gli anticorpi secondari sono coniugati ad un fluoroforo che può essere scambiato a seconda dei parametri del microscopio disponibili. Una volta applicati gli anticorpi secondari fluorescenti, proteggere il più possibile dalla luce. - Incubare l'anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente, limitando l'esposizione alla luce.
- Lavare 3 volte con 1x PBS per 5 minuti per rimuovere l'anticorpo secondario in eccesso.
- Per etichettare i nuclei, utilizzare una soluzione 1:1.000 DAPI/PBS e incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Lavare 3x con 1x PBS per 5 minuti al buio.
- Per il montaggio, applicare il supporto di montaggio e lasciare asciugare al buio prima di immaginare.
NOTA: I vetrini montati possono essere conservati a temperatura ambiente per 2-3 giorni. Per una conservazione a lungo termine, spostare i vetrini a 4 °C. Immagine entro una settimana per il segnale massimo. Tutte le immagini rappresentative sono state riprese al microscopio confocale; Tuttavia, si raccomandano anche microscopi fluorescenti invertiti.
Representative Results
I dati rappresentativi mostrati di seguito illustrano che la segnalazione IFNγ influenza la differenziazione e la maturazione dell'OPC. Senza la presenza del recettore IFNγ (IFNγR), gli OPC corticali non si differenziano in oligodendrociti mielinizzanti maturi come facilmente, il che è evidenziato dall'assenza di colorazione MBP (Figura 1). Poiché gli oligodendrociti e gli astrociti derivano da un progenitore comune, abbiamo analizzato l'espressione GFAP, che etichetta gli astrociti. Abbiamo scoperto che le cellule carenti di IFNγR esprimono fortemente GFAP suggerendo che potrebbero adottare un fenotipo astrocitico, confermando i rapporti precedenti19.
Ulteriori prove di eterogeneità regionale nelle cellule del SNC sono evidenziate dalla variazione della morfologia degli astrociti come si vede negli astrociti della corteccia, del cervelletto, del tronco cerebrale e del midollo spinale (Figura 2). Da notare, gli astrociti della stessa regione possono anche mostrare eterogeneità morfologica, supportando l'idea che questo sottotipo gliale sia altamente dinamico. Le differenze nell'architettura cellulare sono indicative della diversità funzionale e quindi la capacità di isolare le popolazioni gliali è necessaria per studiare le risposte fenotipiche in assenza e presenza di stimoli microambientali.
Gli oligodendrociti sono fondamentali per la mielinizzazione degli assoni neuronali e sono necessari per la corretta riparazione e funzione del SNC. Gli OPC danno origine alle loro controparti mature, rendendo fondamentale comprendere la biologia alla base della loro capacità di differenziazione. La segnalazione delle citochine influenza significativamente il comportamento delle cellule staminali e immunitarie. Pertanto, è importante capire come le risposte regionali delle OPC possono variare alla stimolazione differenziale delle citochine (Figura 3), che può influire sulla loro capacità di differenziarsi in oligodendrociti mielinizzanti maturi.
Figura 1: Dati rappresentativi che mostrano la differenziazione OPC in topi WT e IFNγR-/- in presenza di IFNγ esogeno. Le OPC corticali sono state isolate da ( A ) WT e (B) cuccioli di topo IFNγR-/- P4 seguendo la procedura sopra descritta. Le cellule sono state trattate con 1 ng/mL IFNγ per 48 ore, quindi fissate e colorate per delineare la differenziazione cellulare. Gli OPC sono stati marcati per NG2 e GFAP per identificare quelli che stavano adottando un fenotipo astrocitico. Allo stesso modo, gli OPC sono stati anche etichettati per NG2 e MBP per identificare quelli che si stavano differenziando in oligodendrociti maturi. Barra di scala = 20 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Dati rappresentativi che dimostrano l'eterogeneità regionale nella morfologia degli astrociti. Gli astrociti della corteccia, del cervelletto, del tronco cerebrale e del midollo spinale sono stati isolati da cuccioli di topo P4 utilizzando il protocollo sopra descritto ed etichettati per GFAP (verde) mediante immunocitochimica dopo 48 ore in coltura. Barra di scala = 20 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Dati rappresentativi che dimostrano le risposte differenziali delle OPC regionali alle citochine. Gli OPC sono stati isolati dal tronco cerebrale e dal midollo spinale dei cuccioli di topo P4 utilizzando il protocollo sopra descritto. Le cellule sono state trattate con concentrazioni crescenti (1-10 ng/ml) di (A) IFNγ o (B) interleuchina ( IL ) -17 al fine di studiare l'influenza differenziale delle citochine sulla capacità delle OPC regionali di differenziarsi in oligodendrociti mielinizzanti. Dopo un'incubazione di 48 ore con citochine specificate, gli OPC sono stati fissati ed etichettati per NG2 (verde) e MBP (rosso). Barra di scala = 20 μM. I dati rappresentano i mezzi ± SEM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 da ANOVA a 2 vie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| PBS/Soluzione antibiotica (PAS): | ||
| 1,0 ml | 100X antibiotico/antimicotico contenente 10.000 unità/mL di penicillina e 10.000 mg/ml di streptomicina | |
| 25 mg/ml | Amfotericina B | |
| 99 ml | 1X PBS | |
| Mixed Glia Media (MGM) | ||
| 88 ml | 1X DMEM (alto contenuto di glucosio, con L-glutammina, con Na piruvato) | |
| 10 ml | FBS inattivato dal calore | |
| 1,0 ml | L-Glutammina (100X) | |
| 1,0 ml | Antibiotico/Antimicotico | |
| Supporti OPC (50mL) | ||
| 49 ml | Mezzi neurobasali | |
| 1,0 ml | Supplemento B27 (50X) | |
| 10 ng/ml | PDGF-AA | |
| NOTA: PDGF-AA viene aggiunto di nuovo prima di ogni cambio di supporto. | ||
| Astrociti Media (1 L) | ||
| 764 ml | MEM con sali di Earle contenenti glutammina | |
| 36 ml | Glucosio (utilizzare 100 mg/mL di brodo per la concentrazione finale di 20 mM) | |
| 100 ml | FBS inattivato dal calore | |
| 100 ml | Siero di cavallo inattivato dal calore | |
| 10 ml | Glutammina (utilizzare 200 mM di brodo se non incluso nel terreno di partenza) | |
| OPZIONALE: 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico epidermico di topo ricombinante | ||
| NOTA: filtrare tutti i fluidi sterili e conservare a 4°C fino all'uso. | ||
Tabella 1: Buffer e ricette multimediali.
Discussion
In questo protocollo, descriviamo l'isolamento delle tre principali sottopopolazioni di cellule gliali dal SNC di topo: microglia, OPC e astrociti. Una grave battuta d'arresto per lo studio delle malattie neurodegenerative e neuroinfiammatorie del SNC è la mancanza di cellule e tessuti umani primari, in particolare quelli regionali e dello stesso paziente. Nella maggior parte dei casi, le linee cellulari del SNC umano derivano da cellule tumorali trasformate e immortalizzate che potrebbero non essere rappresentazioni accurate del loro normale comportamento fisiologico20,21,22. Pertanto, sono necessari metodi alternativi per studiare i fenotipi delle cellule del SNC in modo controllato. Inoltre, la diversità delle popolazioni di cellule gliali neurologiche rende necessario studiare ogni sottotipo sia indipendentemente l'uno dall'altro, sia in condizioni di co-coltura al fine di ricapitolare sia le loro funzioni autonome che non autonome cellulare. Le cellule gliali hanno un'ampia varietà di funzioni critiche nel SNC che vanno dal supporto neuronale23, all'apprendimento / cognizione 24,25 e alle risposte immunologiche del SNC26. Come tale, è necessario comprendere le funzioni molecolari e cellulari di ciascuna sottopopolazione gliale in un contesto fisiologico e patologico. Per fare ciò, forniamo qui un metodo affidabile per l'estrazione e l'isolamento di sottotipi di glia vitali. A causa dei vincoli pratici ed etici nella ricerca del soggetto umano, i modelli animali sono attualmente i surrogati più rilevanti per la biologia delle cellule gliali umane. In particolare, i topi sono animali modello ideali in quanto il loro genoma può essere manipolato e analizzato per sezionare ulteriormente particolari meccanismi molecolari alla base della salute e della malattia. Pertanto, la rimozione e la separazione di microglia murina, OPC e astrociti è uno strumento chiave per studiare le funzioni della glia durante condizioni fisiologiche, neurodegenerative o neuroinfiammatorie.
Questo protocollo può essere ottimizzato per esplorare l'eterogeneità regionale delle cellule del SNC. Sta diventando sempre più chiaro che le glia mostrano eterogeneità regionale nella forma e nella funzione. Gli astrociti sono diversi a livello regionale e mostrano morfologia distinta a seconda della loro posizione all'interno del SNC27. Inoltre, la densità degli astrociti e il loro indice mitotico possono definire regioni anatomiche, supportando l'ipotesi che l'eterogeneità degli astrociti regionali possa riflettere differenze molecolari e funzionali basate sulla loro posizione all'interno del SNC28. Anche l'eterogeneità regionale microgliale è oggetto di studio attivo, sebbene i meccanismi sottostanti e le conseguenze funzionali della diversità della microglia nello sviluppo o nel comportamento del SNC non siano attualmente chiari. Tuttavia, è noto che le microglia adulte mostrano diversità nel numero di cellule, nelle strutture cellulari e subcellulari e nelle firme molecolari29. Inoltre, i recenti progressi nella citometria di massa multipla hanno ulteriormente definito l'eterogeneità regionale della microglia, analizzando il fenotipo cellulare da cinque diverse regioni del SNC di nove donatori umani, consentendo l'immunofenotipizzazione su larga scala della microglia umana30. Attualmente, tali approcci sono nelle loro fasi nascenti, rendendo gli studi sugli animali una soluzione praticabile per lo studio della glia regionale nello sviluppo della malattia del SNC. Infine, l'eterogeneità regionale è stata recentemente descritta anche negli oligodendrociti. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula su 5072 singole cellule provenienti da 10 regioni del SNC giovanile e adulto ha identificato 13 sottopopolazioni distinte in diversi stadi di differenziazione31. È importante sottolineare che è stato anche scoperto che quando gli oligodendrociti maturavano dalle OPC, i loro profili trascrizionali divergevano e i loro fenotipi funzionali cambiavano, evidenziando l'eterogeneità degli oligodendrociti all'interno del SNC31.
Pertanto, la comprensione dell'eterogeneità regionale delle varie cellule residenti del SNC nel contesto dei loro diversi neuroni vicini e di altre glia può fornire un razionale importante per lo sviluppo futuro di nuove terapie per il trattamento di disturbi neuroinfiammatori e neurodegenerativi. Mentre questo protocollo si concentra sull'estrazione, l'isolamento e l'identificazione delle sottopopolazioni gliali, fornisce un comodo punto di partenza per l'esame della loro funzione. Inoltre, può essere adattato e combinato con modelli murini transgenici al fine di studiare i meccanismi genetici associati alla biologia delle cellule gliali. Può anche essere usato per esaminare le risposte delle cellule gliali l'una all'altra in saggi di co-coltura. I passaggi delineati rappresentano un metodo economico e ad alto rendimento per estrarre e isolare diverse popolazioni gliali del SNC che possono quindi essere adattate a un'ampia varietà di parametri sperimentali. Va notato; Tuttavia, che il metodo qui descritto utilizza neonati a causa dei livelli più bassi di mielinizzazione e alta densità di glia proliferante. Per questi motivi, è tecnicamente più fattibile isolare la glia vitale dai neonati rispetto agli animali adulti. Le differenze fenotipiche nella glia neonatale rispetto alla glia adulta dovrebbero quindi essere considerate durante il disegno sperimentale e l'interpretazione dei dati.
Disclosures
Gli autori hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Morgan Psenicka per la modifica e la discussione del manoscritto e il Dr. Grahame Kidd per l'assistenza nella formattazione delle figure. Questo lavoro è stato supportato da NIAID K22 AI125466 (JLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
| 12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
| 50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
| B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
| DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
| Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
| Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
| Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
| Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
| Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
| L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
| Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
| Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
| Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
| Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
| Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
| Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
| Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
| Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
| Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
| Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
| Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
| Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |
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