Summary
Her præsenterer vi en protokol for in vitro-isolering af flere gliacellepopulationer fra en mus CNS. Denne metode giver mulighed for adskillelse af regionale microglia, oligodendrocytprecursorceller og astrocytter for at studere fænotyperne af hver i en række kultursystemer.
Abstract
De metoder, der præsenteres her, viser laboratorieprocedurer for dissektion af fire forskellige regioner i centralnervesystemet (CNS) fra murine nyfødte til isolering af glial subpopulationer. Formålet med proceduren er at adskille microglia, oligodendrocytprogenitorceller (OPC'er) og astrocytter fra kortikale, cerebellar, hjernestamme og rygmarvsvæv for at lette yderligere in vitro-analyse. CNS-regionens isolationsprocedurer gør det muligt at bestemme regional heterogenitet blandt glia i flere cellekultursystemer. Hurtig CNS-regionisolering udføres efterfulgt af mekanisk fjernelse af meninges for at forhindre meningealcelleforurening af glia. Denne protokol kombinerer blid vævsdissociation og plettering på en specificeret matrix designet til at bevare celleintegritet og vedhæftning. Isolering af blandet glia fra flere CNS-regioner giver en omfattende analyse af potentielt heterogen glia, samtidig med at brugen af individuelle forsøgsdyr maksimeres. Derudover er blandet glia efter dissociation af regionalt væv yderligere opdelt i flere celletyper, herunder microglia, OPC'er og astrocytter til brug i enten enkeltcelletype, cellekulturpladeindsatser eller samkultursystemer. Samlet set giver de demonstrerede teknikker en omfattende protokol med bred anvendelighed til omhyggelig dissektion af fire individuelle CNS-regioner fra murine nyfødte og inkluderer metoder til isolering af tre individuelle gliacelletyper til undersøgelse af regional heterogenitet i et hvilket som helst antal in vitro-cellekultursystemer eller assays.
Introduction
Glia er nødvendige for korrekt neuronal funktion i CNS. De består af tre store underpopulationer, astrocytter, oligodendrocytter og microglia, hver med en anden, men alligevel uundværlig rolle1. Uden den rette gliacellediversitet og aktivitet ville neuronal funktion blive alvorligt påvirket, hvilket fører til CNS-svækkelse. Glia er i stand til at påvirke neurotransmission, og hver celletype gør det på en unik måde. Gliaceller i hjernen har kapacitet til at kommunikere indbyrdes såvel som med neuronale celler for at lette korrekt CNS-funktion2. Oligodendrocytter øger hastigheden af elektrisk transmission gennem dannelsen af en myelinskede, hvilket letter klyngedannelsen af ionkanaler ved knudepunkterne i Ranvier, stederne for neuronal handlingspotentialegeneration 3. Microglia er kritiske for beskæring af synapser ved at overvåge synaptisk transmission og "rewiring" neuronale forbindelser efter skade4. Derudover er microglia den mest rigelige residente immuncelle i CNS, der fungerer som den primære form for værtsforsvar mod patogener5. Astrocytter kan regulere synaptisk transmission mellem neuroner ved at ændre koncentrationen af ekstracellulær kalium6. De har også roller i at kontrollere lokal blodgennemstrømning7, frigive og optage neuromodulerende elementer8 og har en nøglerolle i vedligeholdelse af blod-hjerne-barriere9. Således er hver glialundertype kritisk for CNS-funktion, da defekter i enhver type længe har været forbundet med en lang række patologiske tilstande, herunder psykiatriske sygdomme, epilepsi og neurodegenerative tilstande10.
Den største hindring i studiet af CNS patobiologi er manglende evne til at undersøge humane celler i forbindelse med deres mikromiljømæssige niche. Humant biopsivæv er mest indsamlet post mortem, og celler kan let blive beskadiget eller tabt under ekstraktion og forarbejdning. Desuden er det en udfordring at holde humane celler i live og levedygtige in vitro i længere tid uden at udlede udødeliggjorte cellelinjer fra tumorer, på hvilket tidspunkt de ikke længere nøjagtigt afspejler deres normale fysiologiske egenskaber11,12. Derudover er der en betydelig mængde regional heterogenitet blandt individuelle gliacelletyper13,14,15, og det er næsten umuligt at få regionale CNS-prøver fra individuelle patienter. Som sådan er det nødvendigt at udvikle alternative modeller til at studere bidraget fra regional glia i specifikke CNS-lidelser.
Her beskriver vi et in vitro-system ved hjælp af mus CNS-regionsspecifik isolering af flere glial-subpopulationer, hvilket muliggør manipulation og kvantificering af microglia, oligodendrocytprecursorceller (OPC'er), som giver anledning til modne oligodendrocytter og astrocytter. Hver population kan uafhængigt isoleres og udsættes for en lang række eksperimentelle teknikker, herunder lægemiddel- eller molekylebehandling, immuncytokemi, protein / RNA-ekstraktion og analyse og andre samkultursystemer afhængigt af eksperimentel nødvendighed. Derudover giver denne isolationsteknik et højt celleantal, hvilket giver mulighed for karakterisering og undersøgelse af hver glialpopulation på en måde med høj kapacitet. Det muliggør også undersøgelse af CNS-celledifferentiering, vækst og spredning som reaktion på en lang række mikromiljømæssige stimuli på en kontrolleret måde for at undgå forvirrende faktorer, der typisk er til stede i en in vivo-indstilling. Endelig letter denne celleisoleringsteknik manipulation af gliacellepopulationer inden for forskellige CNS-regioner for at undersøge, hvordan regional glia interagerer med hinanden og reagerer på varierende stimuli, hvilket giver mulighed for præcision og reproducerbarhed.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev godkendt og godkendt af Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forbered medier og forsyninger til dissektion
BEMÆRK: Alle buffer- og medieopskrifter findes i tabel 1. Denne procedure udføres under sterile forhold i et vævskultur, der er udpeget til biosikkerhedsskab.
- Forbered og sterilt filter blandet gliamedie (MGM). Dette kan gøres dagen før og opbevares ved 4 °C.
- Fortynd fibronectin i en koncentration på 1:100 med sterilH2O. Mængden af fortyndet fibronectin afhænger af antallet af hvalpe og CNS-region, der anvendes til eksperimentet. Brug en T25-kolbe til 1 cortex, en T25-kolbe til 2-4 cerebella, en T25-kolbe til 2-4 hjernestængler og en T25-kolbe til 2-4 rygmarv.
BEMÆRK: Kombination af væv fra samme region ved hjælp af ovenstående kriterier vil muliggøre tilstrækkelig dissociation uden at ændre protokollen beskrevet nedenfor. Kombination af mere væv end beskrevet i trin 1.2 vil kræve yderligere optimering af dissociationsreagenskoncentrationer. - Pipetter 3 ml fortyndet fibronectin i T25-kolber ved stuetemperatur og lad det sidde i 2 min.
- Aspiraner fibronectin, og lad kolber tørre natten over med kolbelåg løsnet.
2. Cortex, cerebellum, hjernestamme og rygmarvsdissektion
BEMÆRK: Denne procedure kan udføres på bordpladen og kræver et dissektionsomfang. Brug streng aseptisk teknik til alle trin i proceduren og minimer vævseksponering for rumluften. Hold alle medier kølet på is under dissektion for at sikre maksimal vævskonservering. Alternativt kan denne procedure udføres i en hætte, der tillader brug af et internt dissektionsomfang.
- Tør alle områder af med 70% ethanol.
- Pipetter 10 ml PBS/antibiotisk opløsning (PAS) i en 10 cm petriskål. Forbered en petriskål til hver hvalp, der skal dissekeres. Sæt på is for at holde opløsningen kølet.
- I en desinficeret vævskulturhætte pipetteres 9 ml DMEM (uden tilsætningsstoffer) i 4 separate 15 ml koniske rør, et for hver CNS-region, udskifter rørhætter og lægges på is. Placer isspand med rør inden for rækkevidde fra dissektionsomfanget.
- Der anbringes 10 cm petriskål tilberedt i trin 2.2 på desinficeret dissektionsomfang.
- Anæstetiser og afliv musehvalp i henhold til institutionel protokol og fjern hovedet ved hurtig halshugning med skarp saks.
BEMÆRK: Postnatal dag (P) 3-5 hvalpe bruges. Ældre hvalpe har en mere udviklet CNS og er muligvis ikke en tilstrækkelig kilde til ekspanderende gliaceller. Yngre hvalpe (P) 0-2 kan give et højere antal glia og kan bruges; Rygmarvsvæv er imidlertid meget vanskeligt at dissekere i denne unge alder på grund af størrelse. - Rengør hvalpens hud med 70% ethanol.
- Brug en fin saks til at skære det kutane lag langs midten af dyrets hoved, starte caudalt og bevæge rostral, indtil du når snuden. Undgå at skære dybt ind i kraniet for at undgå vævsskader.
- Fisker hovedet ned, trækker kutant lag til hver side af kraniet og bruger fjedersaks, lav et snit langs kraniet midterlinjen, startende ved foramen magnum, igen skære kaudal til rostral.
- Med finspidset tang skal du trække kraniet halvt til højre og venstre side og udsætte cortex, cerebellum og hjernestamme.
- Når den er udsat, løftes hjernen forsigtigt ud af kraniet og ind i 10 cm petriskålen tilberedt i trin 2.2. Sørg for, at hjernen forbliver ubeskadiget for at bevare anatomisk struktur med baghjernen fastgjort.
- Brug fine, buede tang med spidsen af tangen vendt opad, klem lillehjernen af. Fjern hjernehinderne og læg dem i et konisk rør på 15 ml i isspanden.
- Sørg for, at hjernestammen er direkte ventral til lillehjernen og er synlig efter fjernelse af cerebellum. Fjern det med finspidset tang, fjern meninges, og læg det i udpeget 15 ml konisk rør i isspand.
- Adskil mellemhjernen fra cortex, fjern kortikale meninges, og læg i udpeget 15 ml konisk rør i isspand.
- For at fjerne rygmarven skal du placere den halshuggede musehvalp i liggende stilling (liggende med ansigtet opad) med den afskårne rygsøjle hævet mod efterforskeren.
- Spray igen med 70% ethanol.
- Skær langs de laterale sider af rygsøjlen, i en rostral til kaudal retning, gennem brystkassen, indtil den når bagbenene. Under skæring skal du skubbe de indre organer tilbage, indtil rygsøjlen er synlig.
- Skær langs hver sideside af rygsøjlen, indtil den er isoleret, og læg den i 10 cm petriskålen tilberedt i trin 2.2.
- Med ventral side opad, ved hjælp af fin fjedersaks, skiftevis skære højre og venstre side af hver hvirvler, indtil de når lænderegionen for at udsætte rygmarvsvævet.
- Fjern forsigtigt rygmarven og hjernehinderne med finspidset tang under dissekeringsmikroskopet. Anbring i udpeget 15 ml konisk rør i isspand.
- Trin 2.5.-2.19 gentages for hver hvalp, idet væv fra samme område kombineres, så det passer til kriterierne i trin 1.2 for hver forberedt T25-kolbe.
BEMÆRK: Fjern meninges så fuldstændigt som muligt. Hvis en betydelig mængde meninges forbliver, vil den fibroblastlignende fænotype af meningealceller vokse ud og overvælde cellekulturen. Flere rygmarv, af samme fænotype, kan kombineres for at generere en bestemt cellekultur. Pas på at sikre, at overfyldning af celler ikke forekommer, hvilket kan føre til glial apoptose og differentielle fænotyper.
3. Vævsdissociation
BEMÆRK: Alle følgende procedurer udføres i et sterilt vævskultur, der er udpeget som biosikkerhedsskab ved hjælp af aseptisk teknik og sterile materialer.
- Tilsæt 1 ml 0,05% trypsin indeholdende 0,53 mM EDTA til hvert 15 ml konisk rør på 9 ml DMEM og væv for at starte vævslysis.
BEMÆRK: DMEM indeholder en høj mængde calciumchlorid, som kan fungere som en hæmmer af trypsin. Hvis dissociationen ikke er fuldstændig efter de skitserede trin, kan Hanks 'Balancerede saltopløsning uden calcium eller magnesium anvendes. Efter trypsinisering kan enzymet neutraliseres ved at tilsætte en trypsinhæmmer, selvom calcium skal tilsættes tilbage til opløsningen, da det er en cofaktor for DNase I, som anvendes i efterfølgende trin. - Triturere med en 10 ml pipette ca. 20x.
- Overfør cellesuspensionerne til tomme 50 ml koniske rør.
- Opløsningen inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 15 min., og lysaterne omrøres forsigtigt efter 8 min.
- Der tilsættes 5 ml MGM og 200 μL (5 mg/ml) DNase I til hvert rør for en endelig koncentration på 50 μg/ml.
- Triturere hvert lysat med en 10 ml pipette 10x.
- Lad cellesuspensionerne sidde i 3 minutter ved stuetemperatur for at lade ikke-dissocieret væv sætte sig i bunden af rørene.
- Overfør cellesuspensionerne til nye 50 ml koniske rør, og efterlad det ikke-dissocierede væv.
BEMÆRK: De ovenfor beskrevne lysis- og triturationstrin begrænser signifikant mængden af ikke-dissocieret væv. - Centrifuger rørene ved 300 x g i 3 minutter ved 4 °C uden bremse.
- Aspirer supernatanten og suspender de resterende cellepiller i 5 ml MGM.
- Triturér pelleten med en 5 ml pipette 20x.
- Plade de 5 ml cellesuspensioner på coatede T25-kolber.
- Inkubere cellerne ved 37 °C, 5 % CO2 og skifte medie først efter 24 timer for at fjerne celleaffald.
BEMÆRK: Nogle protokoller anbefaler en indledende medieændring efter 72 timer. Optimering af dette trin kan være påkrævet. - Udfør en 100% medieændring med MGM hver 48-72 timer, indtil cellerne er 80% sammenflydende (ca. 5-7 dage).
BEMÆRK: Alle medier skal opvarmes til 37 °C, før mediet skifter.
4. Isolering af Microglia
- Når blandede gliakulturer har nået 80% sammenløb, skal du forberede kolber til omrystning ved at stramme låg og forsegle med paraffinfilm.
- For at fjerne microglia fra blandede gliakulturer skal du fastgøre kolber vandret på en orbital shaker inde i en 37 ° C inkubator. Ryst kolber ved 15 x g i 1 time.
- Fjern medier og pipette i et 15 ml konisk rør. Skyl kolber to gange med 3 ml varm MGM, og tilsæt vask til de 15 ml koniske rør. Disse er microglia.
- Tilsæt 5 ml varm, frisk MGM til dyrkningskolberne.
- Forsegl kolber igen med paraffinfilm, fastgør kolber vandret på rysteren, og ryst ved 15 x g ved 37 °C i 15 timer for adskillelse af OPC'er fra astrocytter.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres natten over, men rystetiden på 15 timer er kritisk, da overskydende tid kan resultere i celledød. - Supernatanten centrifugeres fra trin 4.3. ved 300 x g i 3 min og dyrkning microglia i henhold til standardprotokoller16 eller brug til et biologisk assay.
5. Oligodendrocyt forløber celle isolering
BEMÆRK: Ved plettering af OPC'er efter første isolering skal de belægges på en poly-D-lysinbelagt overflade (steril plade eller dækslip). Forbered disse materialer inden afslutningen af dette afsnit.
- Efter 15 timers rystelse fjernes supernatanten fra kolber og tallerken på steril 100 mm petriskål.
- Supernatanten inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 30 min, hvirvles efter 15 minutter for at fjerne resterende microglia, da disse meget hurtigt klæber til skålen. Petri-retter, der ikke er behandlet med væv, kan anvendes til dette trin.
- Fjern ikke-klæbende celle supernatant, tæller og plade på en poly-D-lysinbelagt overflade. Typisk er 7.500-10.000 OPC'er belagt/cm2.
- Inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i mindst 1 time (op til 6 timer), derefter forsigtigt opsuges 95% af mediet, og tilsæt langsomt varme OPC-medier, pipetteringsmedier mod brøndens væg for at minimere forstyrrelse af OPC'er. Skift medie hver 48. time, indtil cellerne er klar til brug.
BEMÆRK: Det er afgørende, at der kun skiftes én brønd ad gangen. OPC'er er følsomme og er især intolerante over for tørre forhold. Tilføjelsen af PDGF-AA i OPC-medier er at forsinke OPC-modning til oligodendrocytter. Denne faktor kan udelukkes fra kulturmedier, hvis det eksperimentelle fokus er modne oligodendrocytter.
6. Astrocyt isolering
- Efter 15 timers rystelse fjernes supernatant og skyllekolber 2x med varm 1x PBS.
- Der tilsættes 4 ml 0,05 % trypsin indeholdende 0,53 mM EDTA og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 5 minutter, eller indtil cellerne er løftet. For at sikre, at astrocytter er løftet, skal du visualisere dem ved hjælp af et standard vidvinkelmikroskop. Astrocytter vil virke sfæriske efter trypsinisering.
- Når astrocytter har løsnet sig, skal du stå kolbe lodret og tilføje 4 ml MGM. Triturere for at blande.
- Pipette astrocytter i et 15 ml konisk rør, centrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Resuspender astrocytter i Astrocyte Media og plade på fibronectinbelagt overflade som beskrevet i trin 1.2. eller brug til biologisk analyse.
BEMÆRK: 20 ng / ml murine fibroblast vækstfaktor kan tilføjes under den første medieændring for at hjælpe med at etablere astrocytkulturen. Derudover kan standard gelatinebelægning være et billigt alternativ til fibronectin.
7. Identifikation og isolering af microglia, OPC'er, astrocytter og modne oligodendrocytter ved anvendelse af immuncytokemi
- Når belagte celler har nået passende sammenløb, skal du forsigtigt fjerne medier og fiksere klæbende celler ved hjælp af 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter. Gør dette trin i et biosikkerhedsskab.
BEMÆRK: Når du aspirerer eller tilføjer opløsninger, pipetteres med let tryk for at forhindre celleløsrivelse. - Opsæt PFA langsomt, vask derefter celler 3x med 1x PBS i 5 min.
- Der fremstilles passende blokerende opløsning med 10% serum og 0,1% Triton X-100 i 1x PBS.
BEMÆRK: Serumkilde afspejler værtsdyret, hvor det sekundære antistof blev rejst. For eksempel, hvis det sekundære antistof er ged anti-kanin, er det passende blokerende serum normalt gedeserum. Ligeledes, hvis det sekundære antistof er æsel anti-kanin, bør det blokerende serum være normalt æselserum. - Tilsæt blokerende opløsning, indtil cellerne er helt dækket. Bloker i 1 time ved stuetemperatur.
- Der fremstilles en antistoffortyndingsopløsning (9 ml 1x PBS, 0,01 g bovin serumalbumin, 30 μL Triton X-100). Alternativt kan antistoffer fortyndes i den blokerende opløsning, der er beskrevet i trin 6.3.
- Fortynd primære antistoffer, der er specifikke for følgende i antistoffortyndingsmiddel eller blokerende opløsning:
- Microglia: ioniseret calciumbindende adaptermolekyle 1 (Iba1) ved en fortynding på 1:250 (2,4 μg/ml).
- OPC'er: neuralt /glialt antigen 2 (NG2) ved en fortynding på 1:200 (5 μg/ml).
- Modne oligodendrocytter: myelin basisk protein (MBP) ved en fortynding på 1:400 (koncentration er lotafhængig, og optimering kan være nødvendig).
- Astrocytter: glialfibrillært surt protein (GFAP) ved en fortynding på 1:400(0,25 μg/ml)17.
BEMÆRK: Bland ikke primære antistoffer, der er opdrættet i samme art.
BEMÆRK: GFAP vil pålideligt mærke astrocytter af hvidt stof. For astrocytter af gråt stof kan det være nødvendigt at anvende en alternativ markør.
- Inkubere primært antistof natten over ved 4 °C (med blid omrøring foretrækkes).
- Vask 3x med 1x PBS i 5 minutter for at fjerne det primære antistof.
- Inkubere celler med passende sekundære antistoffer ved en 1:400 fortynding i antistoffortyndingsmiddel eller blokerende opløsning beskyttet mod lys.
BEMÆRK: Sekundære antistoffer konjugeres til en fluorofor, som kan udskiftes afhængigt af tilgængelige mikroskopparametre. Når fluorescerende sekundære antistoffer er blevet påført, skal du beskytte mod lys så meget som muligt. - Inkuber sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur, hvilket begrænser eksponeringen for lys.
- Vask 3 gange med 1x PBS i 5 minutter for at fjerne overskydende sekundært antistof.
- For at mærke kerner skal du bruge en 1: 1.000 DAPI / PBS-opløsning og inkubere celler i 5 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Vask 3x med 1x PBS i 5 min i mørke.
- For at montere skal du anvende monteringsmedier og lade tørre i mørke før billeddannelse.
BEMÆRK: Monterede dias kan opbevares ved stuetemperatur i 2-3 dage. For langtidsopbevaring skal du flytte dias til 4 °C. Billede inden for en uge for maksimalt signal. Alle repræsentative billeder er blevet afbildet på et konfokalt mikroskop; Imidlertid anbefales også omvendte fluorescerende mikroskoper.
Representative Results
Repræsentative data vist nedenfor illustrerer, at IFNγ-signalering påvirker OPC-differentiering og modning. Uden tilstedeværelsen af IFNγ-receptor (IFNγR) differentierer kortikale OPC'er sig ikke til modne myeliniserende oligodendrocytter så let, hvilket fremgår af fraværet af MBP-farvning (figur 1). Da oligodendrocytter og astrocytter stammer fra en fælles stamfader, analyserede vi GFAP-ekspression, som mærker astrocytter. Vi fandt ud af, at IFNγR-mangelfulde celler stærkt udtrykker GFAP, hvilket tyder på, at de kan vedtage en astrocytisk fænotype, hvilket bekræfter tidligere rapporter19.
Yderligere beviser for regional heterogenitet i CNS-celler fremgår af varierende astrocytmorfologi som set i astrocytter fra cortex, cerebellum, hjernestamme og rygmarv (figur 2). Bemærk, at astrocytter fra samme region også kan udvise morfologisk heterogenitet, hvilket understøtter forestillingen om, at denne glialundertype er meget dynamisk. Forskellene i cellulær arkitektur tyder på funktionel mangfoldighed, og dermed er evnen til at isolere gliapopulationer nødvendig for at studere fænotypiske reaktioner i fravær og tilstedeværelse af mikromiljømæssige stimuli.
Oligodendrocytter er kritiske for myelinering af neuronale axoner og er nødvendige for korrekt CNS-reparation og funktion. OPC'er giver anledning til deres modne kolleger, hvilket gør det afgørende at forstå biologien bag deres evne til at differentiere. Cytokinsignalering påvirker stam- og immuncelleadfærd betydeligt. Det er således vigtigt at forstå, hvordan regionale reaktioner fra OPC'er kan variere til differentiel cytokinstimulering (figur 3), hvilket kan påvirke deres evne til at differentiere sig til modne myeliniserende oligodendrocytter.
Figur 1: Repræsentative data, der viser OPC-differentiering i WT- og IFNγR-/- mus i nærværelse af eksogene IFNγ. Kortikale OPC'er blev isoleret fra ( A ) WT og (B) IFNγR-/- P4 museunger efter proceduren beskrevet ovenfor. Celler blev behandlet med 1 ng / ml IFNγ i 48 timer, derefter fastgjort og farvet for at afgrænse celledifferentiering. OPC'er blev mærket til NG2 og GFAP for at identificere dem, der vedtog en astrocytisk fænotype. Ligeledes blev OPC'er også mærket for NG2 og MBP for at identificere dem, der differentierede sig til modne oligodendrocytter. Skala bar = 20 μM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative data, der viser regional heterogenitet i astrocytmorfologi. Astrocytter fra cortex, cerebellum, hjernestamme og rygmarv blev isoleret fra P4 museunger ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor og mærket for GFAP (grøn) ved immuncytokemi efter 48 timer i kultur. Skala bar = 20 μM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative data, der viser differentielle reaktioner fra regionale OPC'er på cytokiner. OPC'er blev isoleret fra hjernestammen og rygmarven hos P4-museunger ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor. Celler blev behandlet med stigende koncentrationer (1-10 ng/ml) af (A) IFNγ eller (B) interleukin (IL)-17 for at undersøge cytokinets differentielle indflydelse på regionale OPC'ers evne til at differentiere sig til myeliniserende oligodendrocytter. Efter en 48 timers inkubation med specificerede cytokiner blev OPC'er fikseret og mærket for NG2 (grøn) og MBP (rød). Skala bar = 20 μM. Data repræsenterer betyder ± SEM. **, p < 0,01; , s. < 0,001; , p < 0,0001 af 2-vejs ANOVA. Klik her for at se en større version af denne figur.
| PBS/Antibiotisk Opløsning (PAS): | ||
| 1,0 ml | 100X antibiotikum/antimykotikum indeholdende 10.000 enheder/ml penicillin og 10.000 mg/ml streptomycin | |
| 25 mg/ml | Amphotericin B | |
| 99 ml | 1X PBS | |
| Blandet Glia Media (MGM) | ||
| 88 ml | 1X DMEM (høj glukose, w / L-glutamin, w / Na pyruvat) | |
| 10 ml | Varmeinaktiveret FBS | |
| 1,0 ml | L-glutamin (100X) | |
| 1,0 ml | Antibiotika/antimykotisk | |
| OPC-medier (50 ml) | ||
| 49 ml | Neurobasale medier | |
| 1,0 ml | B27 tillæg (50X) | |
| 10 ng/ml | PDGF-AA | |
| BEMÆRK: PDGF-AA tilføjes frisk før hver medieændring. | ||
| Astrocyt Medier (1 L) | ||
| 764 ml | MEM med Earles salte indeholdende glutamin | |
| 36 ml | Glukose (brug 100 mg/ml lager til endelig koncentration på 20 mM) | |
| 100 ml | Varmeinaktiveret FBS | |
| 100 ml | Varmeinaktiveret hesteserum | |
| 10 ml | Glutamin (brug 200 mM lager, hvis det ikke er inkluderet i lagermedium) | |
| VALGFRIT: 10 ng/ml rekombinant museepidermal vækstfaktor | ||
| BEMÆRK: Sterilt filtrer alle medier og opbevares ved 4 °C, indtil det er brugt. | ||
Tabel 1: Buffer- og medieopskrifter.
Discussion
I denne protokol beskriver vi isoleringen af de tre store gliacelleunderpopulationer fra musens CNS: microglia, OPC'er og astrocytter. Et stort tilbageslag for undersøgelsen af neurodegenerative og neuroinflammatoriske CNS-sygdomme er manglen på primære humane celler og væv, især dem, der er regionale og fra samme patient. I de fleste tilfælde er humane CNS-cellelinjer afledt af transformerede, udødeliggjorte kræftceller, som muligvis ikke er nøjagtige repræsentationer af deres normale fysiologiske adfærd20,21,22. Således er alternative metoder nødvendige for at studere CNS-cellefænotyper på en kontrolleret måde. Desuden gør mangfoldigheden af neurologiske gliacellepopulationer det nødvendigt at undersøge hver subtype både uafhængigt af hinanden såvel som i samkulturforhold for at rekapitulere både deres celleautonome og ikke-autonome funktioner. Gliaceller har en bred vifte af kritiske funktioner i CNS lige fra neuronal støtte23, læring / kognition 24,25 og CNS immunologiske reaktioner26. Som sådan er det nødvendigt at forstå de molekylære og cellulære funktioner i hver glial subpopulation i en fysiologisk og patologisk sammenhæng. For at gøre det giver vi her en pålidelig metode til udvinding og isolering af levedygtige glia-undertyper. På grund af praktiske og etiske begrænsninger i menneskets forskning er dyremodeller i øjeblikket de mest relevante surrogater for human gliacellebiologi. Især mus er ideelle modeldyr, da deres genom kan manipuleres og analyseres for yderligere at dissekere bestemte molekylære mekanismer, der ligger til grund for sundhed og sygdom. Derfor er den vellykkede fjernelse og adskillelse af murinmikroglia, OPC'er og astrocytter et vigtigt redskab til at undersøge gliaens funktioner under fysiologiske, neurodegenerative eller neuroinflammatoriske tilstande.
Denne protokol kan optimeres til at udforske CNS-celle regional heterogenitet. Det bliver mere og mere klart, at glia udviser regional heterogenitet i form og funktion. Astrocytter er regionalt forskellige og viser forskellig morfologi afhængigt af deres placering inden for CNS27. Desuden kan tætheden af astrocytter og deres mitotiske indeks definere anatomiske regioner, hvilket understøtter hypotesen om, at regional astrocyt heterogenitet kan afspejle molekylære og funktionelle forskelle baseret på deres placering inden for CNS28. Microglial regional heterogenitet er også under aktiv undersøgelse, selvom de underliggende mekanismer og funktionelle konsekvenser af microglia-mangfoldighed i CNS-udvikling eller adfærd i øjeblikket er uklare. Det er imidlertid kendt, at voksen microglia viser mangfoldighed i celleantal, celle- og subcellulære strukturer og molekylære signaturer29. Desuden har de seneste fremskridt inden for multiplekset massecytometri yderligere defineret mikroglias regionale heterogenitet ved at analysere cellulær fænotype fra fem forskellige CNS-regioner med ni humane donorer, hvilket giver mulighed for storskala immunophenotyping af human microglia30. I øjeblikket er sådanne tilgange i deres spirende stadier, hvilket gør dyreforsøg til en levedygtig løsning til undersøgelse af regional glia i CNS sygdomsudvikling. Endelig er regional heterogenitet også for nylig blevet beskrevet i oligodendrocytter. Enkeltcellet RNA-sekventering på 5072 individuelle celler fra 10 regioner af juvenil og voksen CNS identificerede 13 forskellige subpopulationer på tværs af forskellige stadier af differentiering31. Det er vigtigt, at det også blev konstateret, at efterhånden som oligodendrocytter modnedes fra OPC'er, divergerede deres transkriptionelle profiler, og deres funktionelle fænotyper ændrede sig, hvilket fremhævede oligodendrocyt heterogenitet inden for CNS31.
Således kan forståelse af regional heterogenitet af de forskellige residente CNS-celler i forbindelse med deres forskellige naboneuroner og andre glia give vigtig begrundelse for den fremtidige udvikling af nye terapier til behandling af neuroinflammatoriske og neurodegenerative lidelser. Mens denne protokol fokuserer på ekstraktion, isolering og identifikation af glialunderpopulationer, giver den et bekvemt udgangspunkt for undersøgelsen af deres funktion. Desuden kan det tilpasses og kombineres med transgene musemodeller for at studere genetiske mekanismer forbundet med gliacellebiologi. Det kan også bruges til at undersøge gliaceller til hinanden i samkulturassays. De skitserede trin repræsenterer en omkostningseffektiv og høj kapacitet metode til udvinding og isolering af forskellige CNS glialpopulationer, som derefter kan tilpasses en lang række eksperimentelle parametre. Det skal bemærkes; imidlertid, at metoden beskrevet her anvender nyfødte på grund af de lavere niveauer af myelinering og høj densitet af prolifererende glia. Af disse grunde er det teknisk mere muligt at isolere levedygtig glia fra nyfødte sammenlignet med voksne dyr. De fænotypiske forskelle i neonatal glia sammenlignet med voksen glia bør derfor overvejes under eksperimentelt design og datafortolkning.
Disclosures
Forfatterne har interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Morgan Psenicka for manuskriptredigering og diskussion og Dr. Grahame Kidd for hjælp til figurformatering. Dette arbejde blev støttet af NIAID K22 AI125466 (JLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
| 12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
| 50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
| B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
| DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
| Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
| Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
| Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
| Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
| Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
| L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
| Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
| Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
| Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
| Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
| Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
| Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
| Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
| Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
| Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
| Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
| Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
| Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |
References
- Fields, R. D., et al. Glial Biology in Learning and Cognition. The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Nuriya, M., Hirase, H.
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).
- Kierdorf, K., Prinz, M.
- Hertz, L., Chen, Y. Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning. Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).
- Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).
- Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R.
- Sharif, Y., et al. Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease. Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).
- von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. Glial Cells and Integrity of the Nervous System. Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H.
- Liu, R., et al. Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor. Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Witting, A., Moller, T. Microglia cell culture: a primer for the novice. Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).
- Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma. Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).
- Stevens, B. Glia: much more than the neuron's side-kick. Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).
- Fields, R. D., et al. Glial biology in learning and cognition. Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
- Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).
- Hartenstein, V., Giangrande, A. Connecting the nervous and the immune systems in evolution. Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).
- Emsley, J. G., Macklis, J. D. Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS. Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).
- Chaboub, L. S., Deneen, B. Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development. Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).
- Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bottcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).
- Marques, S., et al. Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system. Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).
