Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’isolement in vitro de plusieurs populations de cellules gliales à partir d’un SNC de souris. Cette méthode permet la ségrégation de la microglie régionale, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des astrocytes pour étudier les phénotypes de chacun dans une variété de systèmes de culture.
Abstract
Les méthodes présentées ici démontrent des procédures de laboratoire pour la dissection de quatre régions différentes du système nerveux central (SNC) à partir de nouveau-nés murins pour l’isolement de sous-populations gliales. Le but de la procédure est de dissocier la microglie, les cellules progénitrices oligodendrocytaires (OPC) et les astrocytes des tissus corticaux, cérébelleux, du tronc cérébral et de la moelle épinière afin de faciliter une analyse in vitro ultérieure. Les procédures d’isolement de la région du SNC permettent de déterminer l’hétérogénéité régionale entre les glies dans plusieurs systèmes de culture cellulaire. Une isolation rapide de la région du SNC est effectuée, suivie de l’ablation mécanique des méninges pour prévenir la contamination des cellules méningées de la glie. Ce protocole combine une dissociation tissulaire douce et un placage sur une matrice spécifiée conçue pour préserver l’intégrité et l’adhésion des cellules. L’isolement des glies mixtes de plusieurs régions du SNC fournit une analyse complète des glies potentiellement hétérogènes tout en maximisant l’utilisation d’animaux de laboratoire individuels. De plus, après la dissociation des tissus régionaux, les glies mixtes sont divisées en plusieurs types de cellules, y compris la microglie, les OPC et les astrocytes pour une utilisation dans un type de cellule unique, des inserts de plaques de culture cellulaire ou des systèmes de co-culture. Dans l’ensemble, les techniques démontrées fournissent un protocole complet d’applicabilité large pour la dissection minutieuse de quatre régions individuelles du SNC à partir de nouveau-nés murins et comprennent des méthodes pour l’isolement de trois types individuels de cellules gliales afin d’examiner l’hétérogénéité régionale dans un nombre quelconque de systèmes ou de tests de culture cellulaire in vitro.
Introduction
Les glies sont nécessaires au bon fonctionnement neuronal du SNC. Ils sont composés de trois sous-populations principales, les astrocytes, les oligodendrocytes et la microglie, chacune ayant un rôle différent, mais indispensable1. Sans la diversité et l’activité appropriées des cellules gliales, la fonction neuronale serait gravement affectée, entraînant une déficience du SNC. Les glies sont capables d’influencer la neurotransmission, et chaque type de cellule le fait d’une manière unique. Les cellules gliales du cerveau ont la capacité de communiquer entre elles, ainsi qu’avec les cellules neuronales, afin de faciliter le bon fonctionnement du SNC2. Les oligodendrocytes augmentent la vitesse de transmission électrique grâce à la formation d’une gaine de myéline, ce qui facilite le regroupement des canaux ioniques au niveau des nœuds de Ranvier, sites d’action neuronale de générationde potentiel 3. Les microglies sont essentielles pour l’élagage des synapses en surveillant la transmission synaptique et en « reconnectant » les connexions neuronales à la suite d’une blessure4. En outre, les microglies sont la cellule immunitaire résidente la plus abondante du SNC, agissant comme la principale forme de défense de l’hôte contre les agents pathogènes5. Les astrocytes peuvent réguler la transmission synaptique entre les neurones en modifiant la concentration de potassium extracellulaire6. Ils jouent également un rôle dans le contrôle du flux sanguin local7, la libération et l’absorption d’éléments neuromodulateurs8, et jouent un rôle clé dans le maintien de la barrière hémato-encéphalique9. Ainsi, chaque sous-type glial est essentiel pour la fonction du SNC, car les défauts de tout type ont longtemps été associés à une grande variété d’états pathologiques, y compris les maladies psychiatriques, l’épilepsie et les affections neurodégénératives10.
Le plus grand obstacle dans l’étude de la pathobiologie du SNC est l’incapacité d’étudier les cellules humaines dans le contexte de leur niche microenvironnementale. Les tissus de biopsie humaine sont la plupart des tissus post-mortem prélevés et les cellules peuvent facilement être endommagées ou perdues pendant l’extraction et le traitement. En outre, il est difficile de maintenir les cellules humaines vivantes et viables in vitro pendant un certain temps sans dériver des lignées cellulaires immortalisées à partir de tumeurs, auquel cas elles ne reflètent plus avec précision leurs propriétés physiologiques normales11,12. De plus, il existe une hétérogénéité régionale importante entre les types individuels de cellules gliales13,14,15, et il est presque impossible d’obtenir des échantillons régionaux du SNC de patients individuels. En tant que tel, il est nécessaire de développer des modèles alternatifs pour étudier la contribution de la glie régionale dans des troubles spécifiques du SNC.
Ici, nous décrivons un système in vitro utilisant l’isolement spécifique de la région du SNC de la souris de multiples sous-populations gliales, permettant la manipulation et la quantification de la microglie, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC), qui donnent naissance à des oligodendrocytes matures, et des astrocytes. Chaque population peut être isolée indépendamment et soumise à une grande variété de techniques expérimentales, y compris le traitement médicamenteux ou moléculaire, l’immunocytochimie, l’extraction et l’analyse de protéines / ARN, et d’autres systèmes de co-culture en fonction de la nécessité expérimentale. De plus, cette technique d’isolement donne un nombre élevé de cellules, ce qui permet la caractérisation et l’étude de chaque population gliale de manière à haut débit. Il permet également d’étudier la différenciation, la croissance et la prolifération des cellules du SNC en réponse à une grande variété de stimuli microenvironnementaux de manière contrôlée afin d’éviter les facteurs de confusion qui sont généralement présents dans un environnement in vivo. Enfin, cette technique d’isolement cellulaire facilite la manipulation des populations de cellules gliales dans différentes régions du SNC pour étudier comment les glies régionales interagissent les unes avec les autres et répondent à divers stimuli, ce qui permet une précision et une reproductibilité.
Protocol
REMARQUE : Toutes les études sur les animaux ont été autorisées et approuvées par le Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Préparer les milieux et les fournitures pour la dissection
REMARQUE : Toutes les recettes de tampon et de média sont fournies dans le tableau 1. Cette procédure est effectuée dans des conditions stériles dans une culture tissulaire désignée enceinte de biosécurité.
- Préparer et filtrer stérile les milieux gliaux mélangés (MGM). Cela peut être fait la veille et conservé à 4 °C.
- Diluer la fibronectine à une concentration de 1:100 avec duH2Ostérile. Le volume de fibronectine diluée dépendra du nombre de petits et de la région du SNC utilisés pour l’expérience. Utilisez une fiole T25 pour 1 cortex, une fiole T25 pour 2-4 cérébelles, une fiole T25 pour 2-4 troncs cérébraux et une fiole T25 pour 2-4 moelle épinière.
REMARQUE: La combinaison de tissus de la même région en utilisant les critères énumérés ci-dessus permettra une dissociation adéquate sans modifier le protocole décrit ci-dessous. La combinaison d’un plus grand nombre de tissus que celui décrit à l’étape 1.2 nécessitera une optimisation supplémentaire des concentrations de réactifs de dissociation. - Pipeter 3 mL de fibronectine diluée dans des flacons T25 à température ambiante et laisser reposer pendant 2 min.
- Aspirer la fibronectine et laisser sécher les flacons pendant la nuit avec le couvercle de la fiole desserré.
2. Curage du cortex, du cervelet, du tronc cérébral et de la moelle épinière
REMARQUE : Cette procédure peut être effectuée sur la paillasse et nécessite une portée de dissection. Utilisez une technique d’asepsie stricte pour toutes les étapes de la procédure et minimisez l’exposition des tissus à l’air ambiant. Gardez tous les milieux réfrigérés sur la glace pendant la dissection pour assurer une préservation maximale des tissus. Alternativement, cette procédure pourrait être effectuée dans un capot qui permet l’utilisation d’une lunette de dissection interne.
- Essuyez toutes les zones avec de l’éthanol à 70%.
- Pipeter 10 ml de PBS/solution antibiotique (PAS) dans une boîte de Pétri de 10 cm. Préparez une boîte de Petri pour chaque chiot à disséquer. Mettez sur la glace pour garder la solution au frais.
- Dans une hotte de culture tissulaire désinfectée, pipeter 9 mL de DMEM (sans additifs) dans 4 tubes coniques distincts de 15 mL, un pour chaque région du SNC, remplacer les bouchons de tube et mettre sur de la glace. Placez le seau à glace avec des tubes à portée de main de la lunette de dissection.
- Placer la boîte de Petri de 10 cm préparée à l’étape 2.2 au stade de la lunette de dissection désinfectée.
- Anesthésier et euthanasier le chiot de souris selon le protocole institutionnel et enlever la tête par décapitation rapide avec des ciseaux tranchants.
NOTE: Jour postnatal (P) 3-5 petits sont utilisés. Les chiots plus âgés ont un SNC plus développé et peuvent ne pas être une source adéquate de cellules gliales en expansion. Les chiots plus jeunes (P) 0-2 peuvent produire un plus grand nombre de glies et peuvent être utilisés; Cependant, le tissu de la moelle épinière est très difficile à disséquer à ce jeune âge en raison de sa taille. - Nettoyez la peau du chiot avec de l’éthanol à 70%.
- À l’aide de fins ciseaux, couper la couche cutanée le long de la ligne médiane de la tête de l’animal, en commençant caudale et en se déplaçant rostral, jusqu’à atteindre le museau. Évitez de couper profondément dans le crâne pour éviter toute lésion tissulaire.
- En inclinant la tête vers le bas, tirez la couche cutanée de chaque côté du crâne et, à l’aide de ciseaux à ressort, faites une incision le long de la ligne médiane du crâne, en commençant par le foramen magnum, en coupant à nouveau la caudale au rostral.
- À l’aide d’une pince à pointe fine, tirez les moitiés du crâne vers les côtés droit et gauche, exposant le cortex, le cervelet et le tronc cérébral.
- Une fois exposé, soulevez doucement le cerveau hors du crâne et dans la boîte de Petri de 10 cm préparée à l’étape 2.2. Assurez-vous que le cerveau reste intact pour préserver la structure anatomique, avec le cerveau postérieur attaché.
- À l’aide de pinces fines à pointe incurvée avec la pointe de la pince tournée vers le haut, pincez le cervelet. Retirer les méninges et les placer dans un tube conique désigné de 15 ml dans un seau à glace.
- Assurez-vous que le tronc cérébral est directement ventral au cervelet et qu’il est visible après l’ablation du cervelet. Retirez-le à l’aide d’une pince à pointe fine, retirez les méninges et placez-le dans un tube conique désigné de 15 ml dans un seau à glace.
- Séparez le mésencéphale du cortex, retirez les méninges corticales et placez-les dans un tube conique désigné de 15 ml dans un seau à glace.
- Pour retirer la moelle épinière, placez le chiot souris décapité en décubitus dorsal (couché face vers le haut) avec la colonne vertébrale sectionnée élevée vers l’investigateur.
- Pulvériser à nouveau avec de l’éthanol à 70%.
- Couper le long des côtés latéraux de la colonne vertébrale, dans une direction rostrale à caudale, à travers la cage thoracique jusqu’à atteindre les membres postérieurs. Pendant la coupe, repoussez les organes internes jusqu’à ce que la colonne vertébrale soit visible.
- Couper le long de chaque côté latéral de la colonne vertébrale jusqu’à ce qu’elle soit isolée et placer dans la boîte de Petri de 10 cm préparée à l’étape 2.2.
- Avec le côté ventral vers le haut, à l’aide de fins ciseaux à ressort, couper alternativement les côtés droit et gauche de chaque vertèbre jusqu’à atteindre la région lombaire pour exposer le tissu de la moelle épinière.
- Retirez délicatement la moelle épinière et les méninges à l’aide d’une pince à pointe fine au microscope à dissection. Placer dans un tube conique désigné de 15 ml dans un seau à glace.
- Répéter les étapes 2.5.-2.19 pour chaque chiot, en combinant les tissus de la même région pour répondre aux critères énoncés à l’étape 1.2 pour chaque fiole T25 préparée.
REMARQUE: Retirez les méninges aussi complètement que possible. S’il reste une quantité importante de méninges, le phénotype de fibroblaste des cellules méningées dépassera et submergera la culture cellulaire. Plusieurs moelles épinières, de phénotype égal, peuvent être combinées afin de générer une culture cellulaire spécifique. Prenez soin de vous assurer que l’encombrement des cellules ne se produit pas, ce qui peut entraîner une apoptose gliale et des phénotypes différentiels.
3. Dissociation tissulaire
NOTE: Toutes les procédures suivantes sont effectuées dans une culture de tissus stérile désignée enceinte de biosécurité en utilisant une technique aseptique et des matériaux stériles.
- Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % contenant 0,53 mM d’EDTA à chaque tube conique de 15 mL de DMEM à 9 mL et au tissu pour commencer la lyse tissulaire.
REMARQUE: DMEM contient une grande quantité de chlorure de calcium, qui peut agir comme un inhibiteur de la trypsine. Si la dissociation n’est pas complète en suivant les étapes décrites, la solution saline équilibrée de Hanks sans calcium ni magnésium peut être utilisée. Après trypsinisation, l’enzyme peut être neutralisée en ajoutant un inhibiteur de trypsine, bien que le calcium doive être ajouté à la solution car il s’agit d’un cofacteur de la DNase I, qui est utilisée dans les étapes suivantes. - Triturate avec une pipette de 10 ml environ 20x.
- Transférer les suspensions cellulaires dans des tubes coniques vides de 50 mL.
- Incuber la solution à 37 °C, 5% de CO2 pendant 15 min, en agitant doucement les lysats après 8 min.
- Ajouter 5 mL de MGM et 200 μL (5 mg/mL) de DNase I à chaque tube pour obtenir une concentration finale de 50 μg/mL.
- Triturer chaque lysat avec une pipette 10x de 10 mL.
- Laisser reposer les suspensions cellulaires pendant 3 min à température ambiante pour permettre aux tissus non dissociés de se déposer au fond des tubes.
- Transférer les suspensions cellulaires dans de nouveaux tubes coniques de 50 mL, en laissant derrière eux le tissu non dissocié.
REMARQUE : Les étapes de lyse et de trituration décrites ci-dessus limitent considérablement la quantité de tissu non dissocié. - Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 3 min à 4 °C sans frein.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires restantes dans 5 mL de MGM.
- Triturer la pastille avec une pipette de 5 mL 20x.
- Plaquer les suspensions cellulaires de 5 mL sur des fioles T25 revêtues.
- Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO2 et changer de milieu initialement après 24 h pour éliminer les débris cellulaires.
REMARQUE: Certains protocoles recommandent un changement de support initial après 72 heures. L’optimisation de cette étape peut être nécessaire. - Effectuez un changement de milieu à 100 % avec MGM toutes les 48 à 72 heures jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80 % (environ 5 à 7 jours).
REMARQUE : Tous les supports doivent être chauffés à 37 °C avant de changer de support.
4. Isolement de la microglie
- Une fois que les cultures gliales mixtes ont atteint 80% de confluence, préparez les flacons pour les agiter en serrant les couvercles et en les scellant avec un film de paraffine.
- Pour éliminer les microglies des cultures gliales mixtes, fixer les flacons horizontalement sur un agitateur orbital à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C. Agiter les flacons à 15 x g pendant 1 h.
- Retirer le média et la pipette dans un tube conique de 15 mL. Rincer les flacons deux fois avec 3 ml de MGM tiède, en ajoutant du lavage aux tubes coniques de 15 ml. Ce sont les microglies.
- Ajouter 5 ml de MGM chaud et frais dans les flacons de culture.
- Refermer les fioles avec un film de paraffine, fixer les fioles horizontalement sur agitateur et agiter à 15 x g à 37 °C pendant 15 h pour séparer les OPC des astrocytes.
REMARQUE: Cette étape peut être effectuée pendant la nuit, mais le temps de secouage de 15 heures est critique car un temps supplémentaire peut entraîner la mort cellulaire. - Centrifuger le surnageant de l’étape 4.3. à 300 x g pendant 3 min et culture microgliale selon les protocoles standard16 ou utilisation pour un essai biologique.
5. Isolement cellulaire précurseur des oligodendrocytes
REMARQUE : Lors du placage des OPC après l’isolement initial, ils doivent être plaqués sur une surface revêtue de poly-D-lysine (plaque stérile ou couvercle). Préparez ces documents avant de remplir cette section.
- Après 15 heures de agitation, retirer le surnageant des flacons et de la plaque sur une boîte de Petri stérile de 100 mm.
- Incuber le surnageant à 37 °C, 5% de CO2 pendant 30 min, en remuant après 15 min pour éliminer les microglies restantes, car celles-ci adhéreront très rapidement à la boîte. Des boîtes de Petri non traitées par culture tissulaire peuvent être utilisées pour cette étape.
- Retirez le surnageant cellulaire non adhérent, le nombre et la plaque sur une surface recouverte de poly-D-lysine. En règle générale, 7 500 à 10 000 OPC sont plaqués/cm2.
- Incuber à 37 °C, 5% de CO2 pendant au moins 1 h (jusqu’à 6 h), puis aspirer doucement 95% des milieux et ajouter lentement des milieux OPC chauds, en pipetant le média contre la paroi du puits pour minimiser la perturbation des OPC. Changez de support toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à l’emploi.
REMARQUE : Il est essentiel qu’un seul puits soit changé à la fois. Les OPC sont sensibles et sont particulièrement intolérants aux conditions sèches. L’ajout de PDGF-AA dans les milieux OPC retarde la maturation de l’OPC en oligodendrocytes. Ce facteur peut être exclu des milieux de culture si l’objectif expérimental est mis sur les oligodendrocytes matures.
6. Isolement des astrocytes
- Après 15 h de agitation, retirer le surnageant et rincer les flacons 2x avec 1x PBS chaud.
- Ajouter 4 mL de trypsine à 0,05 % contenant 0,53 mM d’EDTA et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se soient soulevées. Pour vous assurer que les astrocytes se sont soulevés, visualisez-les à l’aide d’un microscope à grand champ standard. Les astrocytes apparaîtront sphériques après trypsinisation.
- Une fois que les astrocytes se sont détachés, placer la fiole verticalement et ajouter 4 mL de MGM. Triturate à mélanger.
- Pipeter les astrocytes dans un tube conique de 15 mL, centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
- Resuspendre les astrocytes dans les milieux astrocytaires et les plaquer sur une surface recouverte de fibronectine, comme décrit à l’étape 1.2. ou utiliser pour des essais biologiques.
REMARQUE: Un facteur de croissance de fibroblastes murins de 20 ng / mL peut être ajouté lors du premier changement de milieu pour aider à établir la culture des astrocytes. De plus, l’enrobage de gélatine standard peut être une alternative peu coûteuse à la fibronectine.
7. Identification et isolement de la microglie, des OPC, des astrocytes et des oligodendrocytes matures par immunocytochimie
- Une fois que les cellules plaquées ont atteint la confluence appropriée, retirer doucement le milieu et fixer les cellules adhérentes en utilisant 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes. Faites cette étape dans une armoire de biosécurité.
REMARQUE: Lors de l’aspiration ou de l’ajout de solutions, pipette avec une légère pression pour éviter le décollement de la cellule. - Aspirer lentement le PFA puis laver les cellules 3x avec 1x PBS pendant 5 min.
- Préparer une solution bloquante appropriée en utilisant 10% de sérum et 0,1% de Triton X-100 dans 1x PBS.
REMARQUE : La source sérique reflète l’animal hôte chez lequel l’anticorps secondaire a été élevé. Par exemple, si l’anticorps secondaire est anti-lapin de chèvre, le sérum bloquant approprié est le sérum de chèvre normal. De même, si l’anticorps secondaire est anti-lapin d’âne, le sérum bloquant doit être du sérum d’âne normal. - Ajouter la solution de blocage jusqu’à ce que les cellules soient complètement recouvertes. Bloquer pendant 1 h à température ambiante.
- Préparer une solution de diluant d’anticorps (9 mL de 1x PBS, 0,01 g d’albumine sérique bovine, 30 μL de Triton X-100). Alternativement, les anticorps peuvent être dilués dans la solution de blocage décrite à l’étape 6.3.
- Diluer les anticorps primaires spécifiques des éléments suivants dans un diluant d’anticorps ou une solution bloquante:
- Microglie : molécule ionisée d’adaptateur de liaison au calcium 1 (Iba1) à une dilution de 1:250 (2,4 μg/mL).
- OPC : antigène neural/glial 2 (NG2) à une dilution de 1:200 (5 μg/mL).
- Oligodendrocytes matures : protéine basique de myéline (MBP) à une dilution de 1:400 (la concentration dépend du lot et une optimisation peut être nécessaire).
- Astrocytes : protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) à une dilution de 1:400 (0,25 μg/mL)17.
REMARQUE : Ne mélangez pas les anticorps primaires élevés chez la même espèce.
REMARQUE: GFAP marquera de manière fiable les astrocytes de substance blanche. Pour les astrocytes de matière grise, un autre marqueur peut devoir être utilisé.
- Incuber l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C (avec une agitation douce est préférable).
- Lavez 3x avec 1x PBS pendant 5 min pour éliminer l’anticorps primaire.
- Incuber les cellules avec des anticorps secondaires appropriés à une dilution de 1:400 dans un diluant d’anticorps ou une solution de blocage protégée de la lumière.
REMARQUE : Les anticorps secondaires sont conjugués à un fluorophore qui peut être interchangé en fonction des paramètres disponibles au microscope. Une fois que les anticorps secondaires fluorescents ont été appliqués, protéger de la lumière autant que possible. - Incuber l’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante, en limitant l’exposition à la lumière.
- Lavez 3 fois avec 1x PBS pendant 5 minutes pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires.
- Pour marquer les noyaux, utilisez une solution DAPI/PBS 1:1 000 et incuber les cellules pendant 5 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
- Lavez 3x avec 1x PBS pendant 5 min dans l’obscurité.
- Pour monter, appliquez le support de montage et laissez sécher dans l’obscurité avant l’imagerie.
REMARQUE: Les lames montées peuvent être stockées à température ambiante pendant 2-3 jours. Pour un stockage à long terme, déplacez les lames à 4 °C. Image dans un délai d’une semaine pour un signal maximal. Toutes les images représentatives ont été imagées au microscope confocal; Cependant, les microscopes fluorescents inversés sont également recommandés.
Representative Results
Les données représentatives présentées ci-dessous montrent que la signalisation IFNγ influence la différenciation et la maturation de l’OPC. Sans la présence du récepteur IFNγ (IFNγR), les OPC corticaux ne se différencient pas aussi facilement en oligodendrocytes myélinisants matures, ce qui est démontré par l’absence de coloration MBP (Figure 1). Étant donné que les oligodendrocytes et les astrocytes sont dérivés d’un progéniteur commun, nous avons analysé l’expression GFAP, qui marque les astrocytes. Nous avons constaté que les cellules déficientes en IFNγR expriment fortement le GFAP, ce qui suggère qu’elles pourraient adopter un phénotype astrocytaire, corroborant les rapports antérieurs19.
Des preuves supplémentaires de l’hétérogénéité régionale dans les cellules du SNC sont mises en évidence par la morphologie variable des astrocytes observée dans les astrocytes du cortex, du cervelet, du tronc cérébral et de la moelle épinière (Figure 2). Il convient de noter que les astrocytes d’une même région peuvent également présenter une hétérogénéité morphologique, soutenant l’idée que ce sous-type glial est très dynamique. Les différences dans l’architecture cellulaire suggèrent une diversité fonctionnelle et, par conséquent, la capacité d’isoler les populations gliales est nécessaire pour étudier les réponses phénotypiques en l’absence et la présence de stimuli microenvironnementaux.
Les oligodendrocytes sont essentiels à la myélinisation des axones neuronaux et sont nécessaires à la réparation et au bon fonctionnement du SNC. Les OPC donnent naissance à leurs homologues matures, ce qui rend essentiel de comprendre la biologie derrière leur capacité à se différencier. La signalisation des cytokines influence de manière significative le comportement des cellules souches et immunitaires. Ainsi, il est important de comprendre comment les réponses régionales des OPC peuvent varier à la stimulation différentielle des cytokines (Figure 3), ce qui peut avoir un impact sur leur capacité à se différencier en oligodendrocytes myélinisants matures.
Figure 1 : Données représentatives montrant la différenciation des OPC chez les souris WT et IFNγR-/- en présence d’IFNγ exogène. Les OPC corticaux ont été isolés chez ( A ) WT et (B) IFNγR-/- P4 souris en suivant la procédure décrite ci-dessus . Les cellules ont été traitées avec 1 ng/mL d’IFNγ pendant 48 h, puis fixées et colorées pour délimiter la différenciation cellulaire. Les OPC ont été étiquetés pour NG2 et GFAP afin d’identifier ceux qui adoptaient un phénotype astrocytaire. De même, les OPC ont également été étiquetés pour NG2 et MBP afin d’identifier ceux qui se différenciaient en oligodendrocytes matures. Barre d’échelle = 20 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Données représentatives démontrant l’hétérogénéité régionale de la morphologie des astrocytes. Les astrocytes du cortex, du cervelet, du tronc cérébral et de la moelle épinière ont été isolés chez des bébés souris P4 en utilisant le protocole décrit ci-dessus et marqués pour GFAP (vert) par immunocytochimie après 48 heures en culture. Barre d’échelle = 20 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Données représentatives démontrant les réponses différentielles des OPC régionaux aux cytokines. Les OPC ont été isolés du tronc cérébral et de la moelle épinière de bébés souris P4 à l’aide du protocole décrit ci-dessus. Les cellules ont été traitées avec des concentrations croissantes (1-10 ng / mL) de (A) IFNγ ou (B) interleukine ( IL ) -17 afin d’étudier l’influence différentielle de la cytokine sur la capacité des OPC régionaux à se différencier en oligodendrocytes myélinisants. Après une incubation de 48 heures avec des cytokines spécifiées, les OPC ont été fixés et marqués pour NG2 (vert) et MBP (rouge). Barre d’échelle = 20 μM. Les données représentent les moyennes ± SEM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 par ANOVA 2 voies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| PBS/Solution antibiotique (PAS) : | ||
| 1,0 mL | Antibiotique/antimycotique 100X contenant 10 000 unités/mL de pénicilline et 10 000 mg/mL de streptomycine | |
| 25 mg/mL | Amphotéricine B | |
| 99 mL | 1X PBS | |
| Milieu mixte glia (MGM) | ||
| 88 mL | 1X DMEM (glucose élevé, avec L-glutamine, avec N/Na pyruvate) | |
| 10 mL | FBS inactivé par la chaleur | |
| 1,0 mL | L-Glutamine (100X) | |
| 1,0 mL | Antibiotique/Antimycotique | |
| OPC Media (50 mL) | ||
| 49 mL | Milieux neurobasaux | |
| 1,0 mL | Supplément B27 (50X) | |
| 10 ng/ml | PDGF-AA | |
| REMARQUE : PDGF-AA est ajouté avant chaque changement de support. | ||
| Milieux astrocytaires (1 L) | ||
| 764 mL | MEM avec sels d’Earle contenant de la glutamine | |
| 36 mL | Glucose (utiliser 100 mg/mL de stock pour une concentration finale de 20 mM) | |
| 100 mL | FBS inactivé par la chaleur | |
| 100 mL | Sérum de cheval inactivé par la chaleur | |
| 10 mL | Glutamine (utiliser 200 mM de bouillon s’il n’est pas inclus dans le milieu stocké) | |
| FACULTATIF : facteur de croissance épidermique de souris recombinant de 10 ng/mL | ||
| REMARQUE : Filtrer stérile tous les milieux et les conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. | ||
Tableau 1 : Recettes de tampon et de média.
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement des trois principales sous-populations de cellules gliales du SNC de la souris: microglie, OPC et astrocytes. Un revers majeur pour l’investigation des maladies neurodégénératives et neuroinflammatoires du SNC est le manque de cellules et de tissus humains primaires, en particulier ceux qui sont régionaux et provenant du même patient. Dans la plupart des cas, les lignées cellulaires du SNC humain sont dérivées de cellules cancéreuses transformées et immortalisées qui peuvent ne pas être des représentations précises de leur comportement physiologique normal20,21,22. Ainsi, des méthodes alternatives sont nécessaires pour étudier les phénotypes des cellules du SNC de manière contrôlée. De plus, la diversité des populations de cellules gliales neurologiques rend nécessaire l’étude de chaque sous-type à la fois indépendamment les uns des autres, ainsi que dans des conditions de co-culture afin de récapituler à la fois leurs fonctions cellulaires autonomes et non autonomes. Les cellules gliales ont une grande variété de fonctions critiques dans le SNC allant du soutien neuronal23, de l’apprentissage / cognition 24,25 et des réponses immunologiques du SNC26. En tant que tel, il est nécessaire de comprendre les fonctions moléculaires et cellulaires de chaque sous-population gliale dans un contexte physiologique et pathologique. Pour ce faire, nous fournissons ici une méthode fiable pour l’extraction et l’isolement de sous-types gliaux viables. En raison des contraintes pratiques et éthiques dans la recherche sur les sujets humains, les modèles animaux sont actuellement les substituts les plus pertinents pour la biologie cellulaire gliale humaine. En particulier, les souris sont des animaux modèles idéaux car leur génome peut être manipulé et analysé pour disséquer davantage les mécanismes moléculaires particuliers sous-jacents à la santé et à la maladie. Par conséquent, l’élimination et la séparation réussies de la microglie murine, des OPC et des astrocytes est un outil clé pour étudier les fonctions de la glie dans des conditions physiologiques, neurodégénératives ou neuroinflammatoires.
Ce protocole peut être optimisé pour explorer l’hétérogénéité régionale des cellules du SNC. Il devient de plus en plus clair que les glies présentent une hétérogénéité régionale dans la forme et la fonction. Les astrocytes sont diversifiés sur le plan régional et présentent une morphologie distincte en fonction de leur emplacement dans le SNC27. De plus, la densité des astrocytes et leur indice mitotique peuvent définir des régions anatomiques, soutenant l’hypothèse selon laquelle l’hétérogénéité régionale des astrocytes peut refléter des différences moléculaires et fonctionnelles en fonction de leur emplacement dans le SNC28. L’hétérogénéité régionale microgliale est également activement étudiée, bien que les mécanismes sous-jacents et les conséquences fonctionnelles de la diversité de la microglie dans le développement ou le comportement du SNC ne soient actuellement pas clairs. Cependant, on sait que les microglies adultes présentent une diversité dans le nombre de cellules, les structures cellulaires et subcellulaires et les signatures moléculaires29. De plus, les progrès récents de la cytométrie de masse multiplexée ont permis de définir davantage l’hétérogénéité régionale de la microglie, analysant le phénotype cellulaire de cinq régions différentes du SNC de neuf donneurs humains, permettant l’immunophénotypage à grande échelle de la microglie humaine30. Actuellement, de telles approches en sont à leurs balbutiements, ce qui fait des études animales une solution viable pour l’étude de la glie régionale dans le développement de la maladie du SNC. Enfin, une hétérogénéité régionale a également été récemment décrite dans les oligodendrocytes. Le séquençage de l’ARN unicellulaire sur 5072 cellules individuelles de 10 régions du SNC juvénile et adulte a permis d’identifier 13 sous-populations distinctes à différents stades de différenciation31. Fait important, il a également été constaté qu’à mesure que les oligodendrocytes mûrissaient à partir des OPC, leurs profils transcriptionnels divergeaient et leurs phénotypes fonctionnels changeaient, mettant en évidence l’hétérogénéité des oligodendrocytes au sein du SNC31.
Ainsi, la compréhension de l’hétérogénéité régionale des diverses cellules résidentes du SNC dans le contexte de leurs divers neurones voisins et autres cellules gliales peut fournir une justification importante pour le développement futur de nouvelles thérapies pour traiter les troubles neuroinflammatoires et neurodégénératifs. Bien que ce protocole se concentre sur l’extraction, l’isolement et l’identification des sous-populations gliales, il fournit un point de départ pratique pour l’examen de leur fonction. De plus, il peut être adapté et combiné avec des modèles murins transgéniques afin d’étudier les mécanismes génétiques associés à la biologie cellulaire gliale. Il peut également être utilisé pour examiner les réponses des cellules gliales les unes aux autres dans des tests de co-culture. Les étapes décrites représentent une méthode rentable et à haut débit d’extraction et d’isolement de différentes populations gliales du SNC qui peuvent ensuite être adaptées à une grande variété de paramètres expérimentaux. Il convient de noter; Cependant, la méthode décrite ici utilise des nouveau-nés en raison des niveaux plus faibles de myélinisation et de la forte densité de la prolifération des glies. Pour ces raisons, il est techniquement plus possible d’isoler les glies viables des nouveau-nés par rapport aux animaux adultes. Les différences phénotypiques entre la glie néonatale et la glie adulte doivent donc être prises en compte lors de la conception expérimentale et de l’interprétation des données.
Disclosures
Les auteurs ont des conflits d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Morgan Psenicka pour l’édition et la discussion des manuscrits et le Dr Grahame Kidd pour son aide dans la mise en forme des figures. Ce travail a été soutenu par NIAID K22 AI125466 (JLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
| 12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
| 50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
| B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
| DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
| Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
| Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
| Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
| Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
| Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
| L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
| Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
| Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
| Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
| Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
| Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
| Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
| Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
| Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
| Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
| Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
| Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
| Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |
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