Summary
אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי microRNA בכליות של עכברים עם חסימה חד צדדית שופכה (UUO) על ידי תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי. פרוטוקול זה מתאים לחקר פרופילי ביטוי microRNA של כליה בעכברים עם UUO ובהקשר של תנאים פתולוגיים אחרים.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) הם מולקולות RNA נטושות בודדות, שאינן מקודדות, שבדרך כלל מווסתות את ביטוי הגנים ברמה שלאחר שעתוק על-ידי כריכה לאתרי יעד משלימים חלקית באזור 3' לא מתורגם (UTR) של מסנג'ר RNA (mRNA), מה שמפחית את התרגום והיציבות של ה-mRNA. פרופילי ביטוי miRNA באיברים שונים ורקמות של עכברים נחקרו, אבל שיטות סטנדרטיות לטיהור וכמת של miRNA בכליות העכבר לא היו זמינים. הקמנו שיטה יעילה ואמינה לחילוץ והערכה של ביטוי miRNA בכליות העכבר עם פיברוזיס בין-זמני של הכליה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (qRT-PCR). הפרוטוקול דרש חמישה שלבים: (1) יצירת עכברים מזויפים וחד-צדדיים של חסימה שופך (UUO). (2) חילוץ דגימות כליות מעכברי UUO; (3) חילוץ של RNA הכולל, הכולל miRNA, מדגימות הכליה; (4) סינתזה משלימה DNA (cDNA) עם שעתוק הפוך מmiRNA; ותונומתה (5) qRT-PCR באמצעות ה- cDNA. באמצעות פרוטוקול זה, אישרנו בהצלחה כי בהשוואה לפקדים, הביטוי של miRNA-3070-3p גדל באופן משמעותי ואלה של miRNA-7218-5p ו miRNA-7219-5p ירדו באופן משמעותי בכליות של מודל העכבר של פיברוזיס בין-גזעי הכליה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את ביטוי miRNA בכליות של עכברים עם UUO.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) — RNAs קצר, noncoding שגורמים להשפלה ועיכוב שעתוק של RNA שליח (mRNA)1 — הוצגו לווסת את הביטוי של mRNAs שונים שיש להם תפקידים מכריעים הן פיזיולוגיה ומחלה (למשל, דלקת, פיברוזיס, הפרעות מטבוליות, וסרטן). חלק miRNAs ולכן עשוי להיות מועמד רומן סמנים ביולוגיים ומטרות טיפוליותעבור מגוון רחב של מחלות 2,,3,,4,,5. למרות פרופילי ביטוי miRNA באיברי עכבר ורקמות כולל המוח, הלב, הריאה, הכבד, וכליהתוארו 6,7,88,9,10, לא היו שיטות סטנדרטיות לחילוץ והערכה של miRNAs בכליות עכבר עם פיברוזיס בין-כליתי.
עיצבנו פרוטוקול כדי לטהר ולזהות באופן אמין את הביטויים של miRNAs בכליות של עכברים עם פיברוזיס interstitial כליות. הפרוטוקול כולל חמישה שלבים עיקריים, כדלקמן. (1) עכברים זכרים בני 8 שבועות מחולקים לקבוצות של עכברים העוברים ניתוח מזויף (פקדים) ועכברים הנתונים לניתוח המספק חסימה חד-צדדית של שופכות (UUO), המקושר לפיברוזיס בין-גזעי של כליות. (2) דגימות כליות מופקות מעכברי זיוף וUO, homogenized בנפרד הומוגנייזר סיליקון, ולאחר מכן מועברים למערכת גריסה biopolymer על עמודה ספין microcentrifuge11,12. (3) RNA הכולל המכיל miRNA מופק מדגימות הכליה על ידי עמודת ספין מבוססת קרוםסיליקה 12,13. (4) באמצעות RNA הכולל שחולץ זה, DNA משלים (cDNA) מסונתז מן RNA הכולל עם השימוש תעתיק הפוך, פולימראז פולימראז, פריימר oligo-dT14,,15. (5) הביטויים של miRNAs מוערכים על ידי תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי (qRT-PCR) באמצעות צבע intercalating14,15.
פרוטוקול זה מבוסס על חקירות שהשיגו עקירות משמעותיות והערכות של miRNAsבמגוון רקמות 11,12,13,14,15, ואת מערכת גריסה biopolymer בשימוש בפרוטוקול הוצג לטהר באיכות גבוהה, סך RNA מרקמות ב 200612., בנוסף, מחקרים קודמים אישרו את הדיוק והרגישות של היבטים של הפרוטוקול (כלומר, סינתזה cDNA עם תעתיק הפוך, פולימראז פולימראז, פריימרים oligo-dT מ RNA הכולל שחולצו) לקביעת ביטוי miRNA על ידי qRT-PCR עםצבע intercalating 14,15. מאז הפרוטוקול החדש יש את היתרונות של פשטות, חיסכון בזמן, והפחתת שגיאות טכניות, הפרוטוקול יכול לשמש במחקר הדורש זיהוי מדויק ורגיש של פרופיל miRNA בכליות העכבר. יתר על כן, הפרוטוקול יכול להיות מיושם על חקירות של תנאים פתולוגיים רבים.
אנו מתארים בשלב הבא את הקביעה של פרופילי ביטוי miRNA בעכברים עם UUO, אשר מקושר פיברוזיס interstitial כליות. אצל בני אדם, פיברוזיס interstitial כליות היא תכונה נפוצה וחשובה של מחלת כליות כרונית ומחלת כליות סוף שלב, ללא קשר אטיולוגיהשלהם 16,17. פיברוזיס זה של כליות קשור להתקדמות אי ספיקת כליות, והוא מאופיין בביטויים מוגברים של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים בחללים הבין-מערכתיים (לדוגמה, קולגן, פיברונטין ו-α-smooth muscle actin)17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים הניסיוניים של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ובוצעו בהתאם להנחיות השימוש והטיפול בבעלי חיים ניסיוניים ממדריך האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י לבעלי חיים במעבדה.
1. הניתוח המזויפ
- הכינו את הפריטים הבאים: isoflurane, סדין שעם, קרם depilatory, מגבונים מעבדה, צלחת פטרי עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS), 4-0 ניילון, פינצטה, מספריים כירורגיים, ספוגיות כותנה, ו 8 שבועות C57BL/6 עכברים זכר.
- מבריש עכבר עם 1.5% איזולורן ולשמור על 1.5%. לאחר מכן, למרוח קרם depilatory על הבטן של העכבר. לאחר מספר דקות, נגבו את השמנת המפענחת עם מגבון מעבדה ספוג PBS.
- להזריק 70% אתנול לתוך הבטן של העכבר ולאחר מכן למקם את העכבר על גיליון הפקק במיקום supine.
- באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה, לעשות חתך בעור בבטן ולחתוך את השריר ואת קרום הצבי מפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות.
- להניח שתי ספוגיות כותנה עם PBS ולאחר מכן למשוך את המעיים בזהירות הצידה. מניחים את ספוגיות לחות כדי לזהות את הכליה השמאלית ואת השופך.
- סגור את קרום צנון ולאחר מכן סגור את החתך עם ניילון 4-0.
2. ניתוח UUO
- הכינו את הפריטים הבאים: isoflurane, סדין שעם, קרם depilatory, מגבונים מעבדה, צלחת פטרי עם PBS, 4-0 משי, 4-0 ניילון, מזרק 2.5 מ"ל, ספוגיות כותנה, פינצטה, מספריים כירורגיים, ו 8 שבועות C57BL/6 עכברים זכר.
- מבריש עכבר עם 1.5% איזולורן ולשמור על 1.5%. לאחר מכן למרוח קרם depilatory על הבטן של העכבר. לאחר מספר דקות, נגבו את השמנת המפענחת עם מגבון מעבדה ספוג PBS.
- להזריק 70% אתנול לתוך עכבר הבטן של העכבר ולאחר מכן למקם את העכבר במיקום supine על גיליון שעם.
- באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה, לעשות חתך בעור בבטן ולחתוך את השריר ואת קרום הצבי מפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות.
- מקם את מזרק 2.5 מ"ל מתחת לעכבר. קח שתי ספוגיות כותנה ולהטות אותם עם PBS. משכו את המעיים בזהירות הצידה עם הפינצטה, והניחו את ספוגיות ההטות כראוי כדי לזהות את השופך השמאלי. בעזרת הפינצטה, הרם את הכליה השמאלית.
- השתמש במשי 4-0 כדי לתחך את השופך השמאלי בשני מקומות במרחק של כ-1 ס"מ זה מזה. חותכים את השופכה בנקודת המרכז של שתי הליגות, ולאחר מכן להשתמש 4-0 תפרים ניילון כדי לסגור את קרום צנון וחתך.
3. איסוף דגימות כליות
- הכינו את הבאים: 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, isoflurane, גיליון שעם, 70% אתנול, צלחת פטרי עם PBS, פינצטה, ומספריים כירורגיים.
- מבריש עכבר עם 1.5% איזולורן ולשמור על 1.5%. להזריק 70% אתנול לתוך הבטן שלה ולשים את העכבר על גיליון הפקק במיקום supine.
- באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה, לעשות חתך בעור בבטן ולחתוך את השריר ואת קרום הצבי מפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות.
- הרם את קרום הדום עם הפינצטה. עם המספריים הכירורגיות, לעשות חתך הצידה בקצה העליון של קרום הצבי, ולהמשיך את החתך לאורך הקצה הנמוך ביותר של הצלעות.
- לאחר מכן, לזהות את הכליה השמאלית, לרכך אותו עם PBS עד הכליה הופכת צהוב-לבן לשטוף את הדם מכלי, ולהסיר את הכליה על ידי חיתוך עורק הכליה השמאלית וורק עם המספריים כירורגי. מניחים את הכליה בצלחת פטרי ושוטפים אותה בזהירות עם PBS.
- לחתוך את הכליה לתוך 10 דגימות מ"ג עם מספריים כירורגיים פינצטה (10 מ ג הוא גודל מתאים לשלב הבא). לשים כל חתיכה של הכליה בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל משלה ולסגור את כובע הצינור.
- העבר כל צינור מיקרוצנטריפוגה לחנקן נוזלי, ולשמור את הצינורות ב -80 °C לאחסון לטווח ארוך לפני השימוש.
4. חילוץ של RNA הכולל מדגימות הכליה
- להכין את הפריטים הבאים: 1.5 mL microcentrifuge צינורות, 2.0 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, 100% אתנול, כלורופורם, סיליקון homogenizer, קרח, מערבל מערבולת, עמודי ספין ביופולימר בצינורות אוסף 2.0 מ"ל11,12 ,עמודי ספיןמעוגנים בממברנה בצינורות אוסף 2.0 מ"ל12,13, ריאגנט ליזיס מבוסס פנול/גאנידין, מאגר כביסה המכיל גאנידין ואתנול (שטיפה 1), לשטוף מאגר המכיל מאגר (שטיפה 2), ומים ללא רנז.
- שים דגימת כליות 10 מ"ג בהומוגניזר הסיליקון. להוסיף 700 μL של ריגנט ליסיס מבוסס פנול / גאנידין בהומוגניזר.
- להכין את homogenizer ולאחר מכן לאט לחץ / לסובב את העלי של homogenizer נגד דגימת הכליה כדי homogenize הדגימה. חוזרים על הלחץ/פיתול עד שדגימת הכליה מומסת לחלוטין בריאגנט הליסיס מבוסס פנול/גאנידין.
- כדי להפוך את הדגימה להומוגנית עוד יותר, להעביר את הליסט ההומוגני (בצינור אוסף של 2.0 מ"ל) לעמודת הספין של הביופולימר.
- סובבו את ה-lysate המגוגני ב-14,000 x g ל-3 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן מעבירים את ה-lysate המיוחל לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל שלא נודע.
- מערבבים את הליסטו בצינור עם 140 μL של כלורופורם ולאחר מכן לסגור את מכסה הצינור בחוזקה. כדי לערבב את הליסטום וכלורופורם, להפוך את הצינור 15 פעמים.
הערה: ניתן להשתמש בכלורופורם ללא מכסה מנוע. - דגור כל דגימה במשך 2-3 דקות ב RT ולאחר מכן לסובב כל דגימה ב 12,000 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- מבלי להפריע למשקעים, להעביר את supernatant (שהוא בדרך כלל ~ 300 μL) לצינור חדש 1.5 מ"ל microcentrifuge, ולאחר מכן להוסיף 1.5x נפח שלה (בדרך כלל ~ 450 μL) של 100% אתנול. ומערבלת את התערובת ל-5 שניות.
- טען 700 μL של המדגם על עמודת ספין מעוגנת קרום בצינור אוסף 2.0 מ"ל. סגור את מכסה העמודה וסובב את העמודה ב- 15,000 x g עבור 15 שניות. לזרוק את הליזות המזרזות בצינור האוסף.
- לשטוף את הדגימה ביסודיות על ידי הוספת 700 μL של מאגר כביסה 1 לעמודת ספין מעוגנת קרום בצינור אוסף 2.0 מ"ל. סגור את מכסה העמודה וסובב את העמודה ב- 15,000 x g עבור 15 שניות. לזרוק את הליזות המזרזות בצינור האוסף.
- טען 500 μL של מאגר כביסה 2 על עמודת ספין מעוגנת קרום בצינור אוסף 2.0 מ"ל כדי להסיר מלחי עקבות. סגור את מכסה העמודה וסובב את העמודה ב- 15,000 x g עבור 15 שניות. לזרוק את הליזות המזרזות בצינור האוסף.
הערה: עמודת ספין מעוגנת בממברנה יכולה להפריד בין RNA ל-DNA. - בצע שוב את שלב 4.11.
- סובבו את עמודת הספין המעוגן בממברנה בצינור קולקציה של 2.0 מ"ל ב-15,000 x g למשך דקה אחת. לזרוק את הליזות המזרזות בצינור האוסף.
- העבר את עמודת הספין המעוגן בממברנה לצינור קולקציה חדש של 1.5 מ"ל. המס RNA הכולל על ידי הוספת 30 μL של מים ללא RNase לעמודה. סגור את מכסה העמודה והמתן 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סובב את העמודה ב- 15,000 x g למשך דקה אחת.
- העבר את הכמות הכוללת של הדגימה המכילה RNA סה"כ לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. שים כל אחד מהצינורות על קרח, ומדד את הריכוז של RNA הכולל על ידי ספקטרופוטומטריה.
- שמור את הצינורות עם דוגמאות ב -80 °C לאחסון לטווח ארוך לפני השימוש.
5. סינתזה של cDNA עם התמליל ההפוך של RNA הכולל
הערה: ההנחיות MIQE (מידע מינימלי לפרסום של ניסויי PCR כמותיים בזמן אמת) פורסמו כדי לעודד שיטות ניסיוניות טובות יותר ולסייע בהשגת תוצאות אמינות וחדמשמעיות 19. בפרוטוקול זה, cDNA מסונתז מ 1.0 μg של RNA סה"כ מטוהר בהליך דו-שלבי באמצעות תעתיק הפוך, פולימראז פולימראז, פריימר אוליגו-dT.
- להכין את הדברים הבאים: 1.5 mL microcentrifuge צינורות, שמונה באר צינורות רצועה עם כובעים, הכובע של כל צינור שמונה רצועה, מים מזוקקים, קרח, ערכת תעתיקהפוך (ראה טבלת החומרים)14,15 במצב נמס, מחזור תרמי, מערבל מערבולת.
- הפעל את רוכב התרמי.
- להכין פתרון תערובת מאסטר: להוסיף 2.0 μL של תמהיל transcriptase הפוך (כלול בערכה) ו 2.0 μL של 10x תערובת חומצה גרעין לתוך 4.0 μL של 5x היי-מפרט מאגר (כדי להשיג סך של 8.0 μL מאסטר לערבב לכל שפופרת).
- לשים 8.0 μL של פתרון תערובת מאסטר לתוך כל שפופרת של צינור רצועה שמונה בארות.
- התאם את צפיפות ה-RNA הכוללת. כדי לבודד 1.0 μg של RNA הכולל מדגימות הכליה ב 12 μL של מים ללא RNase, להעביר את הכמות המתאימה של RNA הכולל לתוך מים מזוקקים, באמצעות נתוני צפיפות נמדד כמתואר בשלב 4.15.
הערה: אם קיים זיהום DNA באופן זויף, ה-DNA המזוהם יהיה בשותף מוגבר qRT-PCR. - למקם 12 μL aliquot של RNA הכולל לתוך כל צינור ולסגור את הכובע של הצינור. צנטריפוגה בצינור ל-15 איקס.
- לשים את הצינור ב cycler תרמי דגירה את המדגם במשך 60 דקות ב 37 ° C. לאחר מכן, מיד דגירה את המדגם במשך 5 דקות ב 95 °C עבור הסינתזה של cDNA.
- כאשר הדגירה הושלמה, להעביר את ה-cDNA לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל ולדלל את cDNA עשר פעמים (1:10) עם מים מזוקקים. מערבולת וצנטריפוגה הצינור ל5 s.
- אחסן באופן זמני את ה- cDNA המדולל בקרח והעבר את הדגימות ל- 80°C לאחסון לטווח ארוך לפני השימוש.
6. qRT-PCR של miRNA
הערה: השתמשנו בשיטת intercalator כדי לבצע את qRT-PCR של miRNA. פריימרים עבור RNA הם U6 גרעיני קטן 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, ו miRNA-7219-5p שימשו.
- הכן את הבאים: 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, מערבל מערבולת, לוח תגובה 96-גם עבור qRT-PCR, סרט דבק עבור לוח התגובה 96-באר, אפליקטור סרט דבק, רוטור צנטריפוגה 96-באר, פריימרים ספציפיים miRNA, מכשיר PCR בזמן אמת, וערכת PCR מבוסס צבע ירוק (ראה טבלת החומרים)14,15 המכיל 2x PCR מאסטר לערבב פריימר אוניברסלי 10x.
- לאחר ערבובם בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל, מערבולת הפריטים הבאים: 6.25 μL של מים מזוקקים, 1.25 μL של כל פריימר 5 μM miRNA מומס במים ללא גרעין, 12.5 μL של 2× PCR אב תערובת, ו 2.5 μL של פריימר אוניברסלי 10x.
- הכן את ה- cDNA מסונתז כמתואר בשלב 5, ולהמיס אותו. מערבולת וצנטריפוגה CDNA עבור 5 s.
- לשים 22.5 μL aliquot של reagent (נוצר כמתואר בשלב 6.2) בכל באר של צלחת 96-באר.
- שים 2.5 μL aliquot של cDNA בכל באר של הצלחת.
- באמצעות אפליקטור סרט דבק, לאבטח את סרט הדבק בחוזקה על צלחת 96-באר. צנטריפוגה הצלחת עם רוטור צנטריפוגה 96-באר ב 1,000 x g עבור 30 s ליישב את התגובות בתחתית כל באר.
7. רכיבה על אופניים PCR
- הפעל את מערכת ה- PCR בזמן אמת ולמקם את הלוח שנוצר כמתואר בשלב 6.6. במערכת PCR בזמן אמת. הגדר את מאפייני הניסוי הבאים; לזהות את שם הניסוי. בחר את האפשרויות הבאות: "96-well (0.2 מ"ל)" כסוג הניסוי של המערכת, "CT השוואתי (Th Thct)" כשיטת הכמות, "SYBR Green Reagents" כריאגנטים לזיהוי רצף היעד, ו"סטנדרטי" כהפעלה של המערכת.
- הקצה שם לדוגמה ול-miRNA היעד ולאחר מכן הקצה שם לדוגמה ולמטר miRNA בכל באר. יש להקצות דגימות כפולות כדי לקבל נתונים מתאימים לאישור התוצאות. בחר דוגמת הפניה ופקד אנדוגני, ובחר "ללא" כדי שהצבע ישמש כהפניה פסיבית. הקפד להגדיר את transcriptase הפוך שלילי ופקד שאינו תבנית עבור ביטוי miRNA כדי לחסל את הזיהום הצולב של reagents.
- ודא שהגדרת עוצמת התגובה היא "20 μL" ותנאי הרכיבה PCR מוגדרים על 95 °C עבור 15 דקות, ואחריו 40 מחזורים של denaturation ב 94 °C עבור 15 s, annealing ב 55 ° C עבור 30 s, והארכה ב 70 °C עבור 30 s.
- לאחר השלמת תהליך qRT-PCR, השתמש בתוכנה של המערכת כדי לנתח את נתוני qRT-PCR. ודא ששורת הסף שנבחרה באופן אוטומטי על-ידי התוכנה מתאימה לכל באר.
- בדוק את ערך מחזור הסף (CT) של הפקד אנדוגני ומירנה היעד מנותח בכל מדגם. ערך ה- CT נקבע על-ידי ההצטלבות של עקומת ההגדלה וקו הסף. במחקר הנוכחי, השתמשנו RNU6-2 כפקד אנדוגני עבור רמת ביטוי miRNA היעד, והשתמשנו בשיטת Ơ ƠCT כדי לקבוע את רמת הביטוי היחסי של כל miRNAיעד 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל עכבר UUO נוצר על ידי קשירה שופה שמאלית כפי שתואר21 בעכברים זכרים בני 8 שבועות במשקל 20-25 גרם. שופשופים היו חסומים לחלוטין על ידי קשירה כפולה עם 4-0 תפרים משי. משכך כאבים (מלוקסיאם 5 מ"ג/ק"ג, הזרקה תת עורית) ניתנה לפני הניתוח וגם מדי יום ביומיים שלאחר הניתוח. ב 8 ימים לאחר הניתוח, כליות נאספו, שטיפה עם PBS, נותח, ומאוחסנו בחנקן נוזלי לניתוח נוסף. עכברים המופעלים על ידי שאם שימשו כבקרות. הקשירה הכפולה מצליחה אם לכליה השמאלית יש הידרונפרוזיס. בהתבסס על נתוני miRNA qRT-PCR שהתקבלו באמצעות מודל UUO זה, רמת miRNA-3070-3p גדלה באופן משמעותי ואת הרמות של miRNA-7218-5p ו miRNA-7219-5p ירדו באופן משמעותי בכליות של עכברי UUO בהשוואה לפקדים (איור 1).
איור 1: ביטא דיפרנציאלי miRNAs בכליות של עכברי UUO. qRT-PCR ניתוח של miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, וביטוי miRNA-7219-5p בעכברים מזויפים (n = 8) ועכברי UUO (n = 8). ערכים הם ± סטנדרטית (קווי שגיאה). בדיקות T שימשו לחקירת הבדלים משמעותיים בין קבוצות. T-בדיקות עם ערך p <0.05 נחשבו משמעותיות. miRNA: microRNA, n.s.: לא משמעותי, qRT-PCR: תגובה כמותית בזמן אמת שרשרת פולימראז תמלול הפוך, UUO: חסימה חד צדדית שופכה. *p<0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול שתואר לעיל עם qRT-PCR קבע בהצלחה את רמות הביטוי של miRNAs המיועדים. ההערכה של miRNAs שחולצו חשובה כאשר מבקשים להשיג נתוני qRT-PCR משמעותיים, ועל מנת לאשר את איכות miRNAs לפני ביצוע qRT-PCR, היחס של ספיגה ב 260 טנומטר כי ב 280 טנ"מ צריך להיבדק עם ספקטרופוטומטר. אם לא ניתן להשיג התעצמות PCR אחת של האורך הצפוי וטמפרטורת ההתכה או עקומת התכה מונומודלית על ידי qRT-PCR, ייתכן שיש זיהום DNA או dimer פריימר בכל באר של לוח התגובה.
ניתן להעריך את רמות הביטוי של miRNAs על-ידי מספר שיטות מלבד qRT-PCR, כולל מיקרו-מערך, כתמים צפוניים, ושיטות הגנה ribonuclease. עם זאת, qRT-PCR הוא הליך פשוט, מאוד לשחזור כי הוא גם מדויק ורגיש, אמצעי אחסון מדגם קטן יותר ניתן להשתמש עבור qRT-PCR בהשוואה לכתמים הצפוניים וribonuclease הגנה אומר22. בנוסף, מאז מיקרו-מערך לאפשר את המדידה בו זמנית של הביטוי של עשרות אלפי miRNAs, הם יכולים לזהות סמנים miRNA המועמד. נתוני מיקרו-מערך הראו מתאם גבוה כולל עם נתונים שהושגו על ידי qRT-PCR23, אך קונצנזוס על המתודולוגיה האופטימלית להשוואת נתוני המערך הזעירים שהושגו במחקרים שונים לאהושג 24.
הפרוטוקול החדש כולל את המגבלות הבאות. השירות של פרוטוקול זה לא אומת באיברים אחרים, כגון כבד וריאות; והפרוטוקול לא נבדק בחיות מעבדה אחרות (לדוגמה, חולדות, כלבים וחזירים). מספר קבוצות דיווחו כי פרוטוקול זה (לטיהור וזיהוי של miRNAs על ידי qRT-PCR) אפשר טיהור של RNA באיכות גבוההמרקמות 12,14,15. לשיטה יש דיוק ורגישות גבוהים לזיהוי ביטוי miRNA12,14. הדו"ח הנוכחי מדגים כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות בהצלחה ביטוי miRNA בכליות העכבר. לפיכך, ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לקבוע את פרופילי ביטוי miRNA בכליות של עכברים עם מגוון רחב של מצבי מחלה. בשל הפשטות של הפרוטוקול, דגימות רבות ניתן לעבד בו זמנית, באמצעות הפרוטוקול ולכן יכול לתרום לניתוחים של הביטוי של miRNAs רבים בתנאים פתולוגיים שונים של הכליה.
ישנם היבטים מסוימים של הפרוטוקול להיות מודע ולזכור. ראשית, יש לשמור את ה-RNAs המטוהרים על קרח כדי למנוע השפלה בטמפרטורת החדר. דגימות הכליה חייבות להיות הומוגניות עד שהדגימות נמסות לחלוטין בריאגנט הליזיס. מאז כליות העכבר מכילות רקמת חיבור משמעותית שאינו מתמוסס בריאגנט ליסיס, מגרסה עמודה יש צורך הומוגניזציה נוספת. שנית, miRNA שליטה אנדוגנית נכונה (שהביטוי שלה יציב בין דגימות) יש לאמת לאורך כל ההתקנה הניסיונית qRT-PCR כי הפלישה של חומרים שונים תחת פרוטוקול זה יכול לשנות את רמת הביטוי של miRNA שליטה אנדוגנית, אולי לסכן את התוצאות.
לסיכום, אנו הציגו את הפרטים של פרוטוקול qRT-PCR לזיהוי, טיהור, והערכה של ביטויי microRNA בכליות העכבר עם UUO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים למישל גודי, PhD, מ-Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) על עריכת טיוטה של כתב יד זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L.
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
