Summary
We beschrijven een methode voor het evalueren van de microRNA-expressie in de nieren van muizen met eenzijdige ureterale obstructie (UUO) door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie. Dit protocol is geschikt voor het bestuderen van niermicroRNA expressieprofielen bij muizen met UUO en in de context van andere pathologische aandoeningen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn enkelstrengse, niet-coderende RNA-moleculen die doorgaans genexpressie op posttrantieniveau reguleren door zich te binden aan gedeeltelijk complementaire doellocaties in de onvertaalde regio 3 (UTR) van messenger RNA (mRNA), wat de vertaling en stabiliteit van het mRNA vermindert. De miRNA-expressieprofielen in verschillende organen en weefsels van muizen zijn onderzocht, maar standaardmethoden voor de zuivering en kwantificering van miRNA in de muizennier zijn niet beschikbaar. We hebben een effectieve en betrouwbare methode voor het extraheren en evalueren van miRNA expressie in de muis nier met nier interstitiële fibrose door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR). Het protocol vereiste vijf stappen: (1) creatie van schijn en eenzijdige ureterale obstructie (UUO) muizen; (2) extractie van niermonsters van de UUO-muizen; (3) extractie van het totale RNA, waaronder miRNA, uit de niermonsters; (4) aanvullende DNA-synthese (cDNA) met omgekeerde transcriptie van miRNA; en (5) qRT-PCR met behulp van de cDNA. Met behulp van dit protocol hebben we met succes bevestigd dat in vergelijking met de controles, de expressie van miRNA-3070-3p aanzienlijk werd verhoogd en die van miRNA-7218-5p en miRNA-7219-5p aanzienlijk zijn afgenomen in de nieren van een muismodel van nierinterstitial fibrose. Dit protocol kan worden gebruikt om de miRNA-expressie in de nieren van muizen met UUO te bepalen.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) — de korte, niet-coderende RNAs die de afbraak en transcriptieremming van messenger RNA (mRNA)1 veroorzaken - is aangetoond dat ze de expressie reguleren van verschillende mRNAs die een cruciale rol spelen in zowel fysiologie als ziekte (bijvoorbeeld ontsteking, fibrose, metabole stoornissen en kanker). Sommige miRNAs kunnen daarom kandidaat-nieuwe biomarkers en therapeutische doelstellingen zijn voor een verscheidenheid aan ziekten2,3,4,5. Hoewel miRNA-expressieprofielen in muisorganen en weefsels, waaronder hersenen, hart, long, lever en nieren zijn beschreven6,7,8,9,10, zijn er geen standaardmethoden voor de extractie en evaluatie van miRNAs in de muizennier met nierintermale fibrose.
We hebben een protocol ontworpen om de uitdrukkingen van miRNAs in de nieren van muizen met nierinterstitial fibrose betrouwbaar te zuiveren en te detecteren. Het protocol omvat vijf belangrijke stappen, als volgt. (1) 8 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen zijn verdeeld in groepen muizen die een schijnoperatie ondergaan (controles) en muizen die worden onderworpen aan een operatie die eenzijdige ureterale obstructie (UUO) biedt, die verband houdt met nierinterstitial fibrose. (2) Niermonsters worden gewonnen uit de sham- en UUO-muizen, afzonderlijk gehomogeniseerd in een siliciumhomogenisator en vervolgens overgebracht naar een biopolymeerversnippersysteem op een microcentrifugespinkolom11,12. (3) Het totale RNA dat miRNA bevat, wordt uit de niermonsters gehaald door een spinkolom op basis van silicamembraan op basis van12,13. (4) Met behulp van dit totale RNA wordt aanvullend DNA (cDNA) gesynthetiseerd uit het totale RNA met behulp van reverse transcriptase, poly(A) polymerase en oligo-dT primer14,15. (5) De uitdrukkingen van miRNA's worden beoordeeld door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) met behulp van een intercalating kleurstof14,15.
Dit protocol is gebaseerd op onderzoeken die zinvolle extracties en evaluaties van miRNAs in verschillende weefsels11,12,,13,14,15, en de biopolymeer-shredder systeem gebruikt in het protocol werd aangetoond dat hoge kwaliteit, totale RNA zuiveren uit weefsels in 200612. Bovendien hebben eerdere studies de nauwkeurigheid en gevoeligheid van aspecten van het protocol bevestigd (d.w.z. de cDNA-synthese met reverse transcriptase, poly(A) polymerase en oligo-dT-primers uit geëxtraheerd totaal RNA) voor de bepaling van miRNA-expressie door qRT-PCR met een intercalating dye14,15. Aangezien het nieuwe protocol de voordelen heeft van eenvoud, tijdbesparing en het verminderen van technische fouten, kan het protocol worden gebruikt in onderzoek dat de nauwkeurige en gevoelige identificatie van het miRNA-profiel in de muisnier vereist. Bovendien zou het protocol kunnen worden toegepast op onderzoeken naar vele pathologische omstandigheden.
Vervolgens beschrijven we de bepaling van de miRNA expressieprofielen in muizen met UUO, die gekoppeld is aan nierinterstitial fibrose. Bij mensen is nierinterstitial fibrose een gemeenschappelijk en belangrijk kenmerk van zowel chronische nierziekte als eindstadium nierziekte, ongeacht hun etiologie16,17. Deze nierstitial fibrose wordt geassocieerd met de progressie van nierfalen, en het wordt gekenmerkt door verhoogde expressies van extracellulaire matrixcomponenten in de interstitiële ruimten (bijvoorbeeld collageen, fibronectine en α gladde spieractine)17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Jichi Medical University en werden uitgevoerd in overeenstemming met de Use and Care of Experimental Animals richtlijnen van de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. De schijnoperatie
- Bereid de volgende items: isoflurane, kurkenlak, ontharingscrème, laboratoriumdoekjes, petrischaaltje met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 4-0 nylon, pincet, chirurgische schaar, wattenstaafjes en 8 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen.
- Verdoven een muis met 1,5% isoflurane en handhaven op 1,5%. Breng vervolgens ontharingscrème aan op de buik van de muis. Na een paar minuten veeg je de ontharingscrème af met een pbs-doorweekt laboratoriumdoekje.
- Injecteer 70% ethanol in de buik van de muis en plaats de muis vervolgens op het kurkenvel in de supinepositie.
- Met behulp van chirurgische schaar en pincet, maak een incisie in de huid op de buik en snijd de spier en peritoneale membraan van de blaas naar de linker onderrand van de ribben.
- Bevochtig twee wattenstaafjes met PBS en trek de darmen voorzichtig naar de zijkant. Plaats de bevochtigde wattenstaafjes om de linkernier en ureter te identificeren.
- Sluit het buikvlies en sluit de incisie met 4-0 nylon.
2. De UUO-operatie
- Bereid de volgende items: isoflurane, kurkenlak, ontharingscrème, laboratoriumdoekjes, petrischaaltje met PBS, 4-0 zijde, 4-0 nylon, een 2,5 mL spuit, wattenstaafjes, pincet, chirurgische schaar en 8 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen.
- Verdoven een muis met 1,5% isoflurane en handhaven op 1,5%. Breng vervolgens ontharingscrème aan op de buik van de muis. Na een paar minuten veeg je de ontharingscrème af met een pbs-doorweekt laboratoriumdoekje.
- Injecteer 70% ethanol in de buikmuis van de muis van de muis en plaats de muis vervolgens in de supinepositie op het kurkvel.
- Met behulp van chirurgische schaar en pincet, maak een incisie in de huid op de buik en snijd de spier en peritoneale membraan van de blaas naar de linker onderrand van de ribben.
- Plaats de 2,5 mL spuit onder de muis. Neem twee wattenstaafjes en bevochtig ze met PBS. Trek de darmen voorzichtig naar de zijkant met de pincet, en plaats de bevochtigde wattenstaafjes op de juiste manier om de linker ureter te identificeren. Met behulp van de pincet, til de linker nier.
- Gebruik de 4-0 zijde om de linker ureter op twee plaatsen van ongeveer 1 cm uit elkaar te rijen. Snijd de ureter in het midden punt van de twee ligaties, en gebruik vervolgens 4-0 nylon hechtingen om het buikvlies en incisie te sluiten.
3. Verzameling van niermonsters
- Bereid het volgende: 1,5 mL microcentrifuge buizen, isoflurane, kurk blad, 70% ethanol, petrischaal met PBS, pincet, en chirurgische schaar.
- Verdoven een muis met 1,5% isoflurane en handhaven op 1,5%. Injecteer 70% ethanol in zijn buik en zet de muis op de kurkenvel in de supinepositie.
- Met behulp van chirurgische schaar en pincet, maak een incisie in de huid op de buik en snijd de spier en peritoneale membraan van de blaas naar de linker onderrand van de ribben.
- Til het buikvlies op met de pincet. Met de chirurgische schaar, maak een zijwaartse incisie aan de bovenrand van het buikvliesmembraan, en zet de incisie langs de laagste rand van de ribben.
- Vervolgens identificeer de linkernier, reflux het met PBS totdat de nier geel-wit wordt om bloed uit de bloedvaten te wassen, en verwijder de nier door het snijden van de linker nierslagader en ader met de chirurgische schaar. Plaats de nier in de petrischaal en was het zorgvuldig met PBS.
- Snijd de nier in 10 mg monsters met de chirurgische schaar en pincet (10 mg is een geschikte grootte voor de volgende stap). Doe elk stuk van de nier in zijn eigen 1,5 mL microcentrifuge buis en sluit de buis dop.
- Breng elke microcentrifugebuis over in vloeibare stikstof en houd de buizen op −80 °C voor langdurige opslag voor gebruik.
4. Extractie van het totale RNA uit de niermonsters
- Bereid de volgende items voor: 1,5 mL microcentrifugebuizen, 2,0 mL microcentrifugebuizen, 100% ethanol, chloroform, siliciumhomogenisator, ijs, een vortexmixer, biopolymeer spinkolommen in 2,0 mL-opvangbuizen11,12, membraanve spinkolommen in 2,0 mL-opvangbuizen12,13, fenol/guanidine-gebaseerde lysisreage, wasbuffer met guanidine en ethanol (wasbuffer 1), wasbuffer met ethanol (wasbuffer 2) en RNase-vrij water.
- Doe een niermonster van 10 mg in de siliciumhomogenisator. Voeg 700 μL van het fenol/guanidine-gebaseerde lysisreagens toe aan de homogenisator.
- Bereid de homogenisator voor en druk/draai de stamper van de homogenisator langzaam tegen het niermonster om het monster te homogeniseren. Herhaal het persen/draaien totdat het niermonster volledig is opgelost in het fenol/guanidine-gebaseerde lysisreagens.
- Om het monster verder te homogeniseren, breng je het gehomogeniseerde lysaat (in een 2,0 mL-opvangbuis) over naar de biopolymeerspinkolom.
- Draai het gehomogeniseerde lysaat op 14.000 x g gedurende 3 minuten op kamertemperatuur (RT) en breng het neergeslagen lysaat over op een ongebruikte 1,5 mL microcentrifugebuis.
- Combineer het lysaat in de buis met 140 μL chloroform en sluit de buisdop stevig. Om het lysaat en chloroform te mengen, moet u de buis 15 keer omkeren.
LET OP: De chloroform kan zonder kap worden gebruikt. - Incubeer elk monster gedurende 2-3 min bij RT en draai elk monster vervolgens 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4°C.
- Zonder het neerslag te verstoren, breng je de supernatant (wat meestal ~300 μL is) over naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis en voeg vervolgens 1,5x het volume (meestal ~ 450 μL) van 100% toe. Vortex het mengsel voor 5 s.
- Laad 700 μL van het monster op een membraanverank in een opvangbuis van 2,0 mL. Sluit de kolomdop en draai de kolom op 15.000 x g voor 15 s. Gooi het neergeslagen lysaat weg in de opvangbuis.
- Was het monster grondig door 700 μL wasbuffer 1 toe te voegen aan de membraanve verankerde spinkolom in een opvangbuis van 2,0 mL. Sluit de kolomdop en draai de kolom op 15.000 x g voor 15 s. Gooi het neergeslagen lysaat weg in de opvangbuis.
- Laad 500 μL wasbuffer 2 op de membraanvepil in een opvangbuis van 2,0 mL om sporenzouten te verwijderen. Sluit de kolomdop en draai de kolom op 15.000 x g voor 15 s. Gooi het neergeslagen lysaat weg in de opvangbuis.
OPMERKING: Een membraan-verankerde spinkolom kan RNA en DNA scheiden. - Voer stap 4.11 opnieuw uit.
- Draai de membraanverank opnieuw in een 2,0 mL-opvangbuis met 15.000 x g gedurende 1 min. Gooi het neergeslagen lysaat weg in de opvangbuis.
- Breng de membraanverank naar een nieuwe 1,5 mL-opvangbuis. Los het totale RNA op door 30 μL RNase-vrij water aan de kolom toe te voegen. Sluit de kolomdop en wacht 5 minuten op kamertemperatuur. Draai vervolgens de kolom op 15.000 x g gedurende 1 min.
- Breng de totale hoeveelheid monster met totaal RNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Zet elk van de buizen op ijs, en meet de concentratie van de totale RNA door spectrofotometrie.
- Houd de buizen met monsters op −80 °C voor langdurige opslag voor gebruik.
5. Synthese van cDNA met de omgekeerde transcriptie van het totale RNA
OPMERKING: De MIQE -richtlijnen (minimuminformatie voor de publicatie van kwantitatieve real-time pcr-experimenten) werden opgesteld om betere experimentele praktijken aan te moedigen en betrouwbare en ondubbelzinnige resultaten te verkrijgen19. In dit protocol wordt cDNA gesynthetiseerd van 1,0 μg gezuiverd totaal RNA in een procedure in twee stappen met behulp van reverse transcriptase, poly(A) polymerase en oligo-dT primer.
- Bereid het volgende: 1,5 mL microcentrifuge buizen, acht-well strip buizen met caps, de dop van elke acht-strip buis, gedestilleerd water, ijs, een omgekeerde transcriptase kit (zie de tabel van materialen)14,15 in de gesmolten toestand, een thermische cycler, en een vortex mixer.
- Start de thermische cycler.
- Bereid een master mix oplossing: Voeg 2,0 μL omgekeerde transcriptase mix (inbegrepen in de kit) en 2,0 μL van 10x nucleïnezuur mix in 4,0 μL van 5x hi-spec buffer (om een totaal van 8,0 μL master mix per buis te verkrijgen).
- Doe 8,0 μL van de master mix oplossing in elke buis van een acht-goed strip buis.
- Pas de totale RNA-dichtheid aan. Om 1,0 μg totaal RNA uit de niermonsters in 12 μL RNase-vrij water te isoleren, breng je de juiste hoeveelheid totaal RNA over in gedestilleerd water, met behulp van de dichtheidsgegevens gemeten zoals beschreven in stap 4.15.
OPMERKING: Als er DNA-besmetting aanwezig is, wordt het besmette DNA mede versterkt in de qRT-PCR. - Plaats een 12 μL aliquot van het totale RNA in elke buis en sluit de dop van de buis. Centrifuge de buis voor 15 x.
- Zet de buis in de thermische cycler en broed het monster 60 min bij 37 °C uit. Vervolgens onmiddellijk het monster 5 min bij 95 °C uitbroeden voor de synthese van cDNA.
- Wanneer de incubatie is voltooid, breng de cDNA in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis en verdun de cDNA tien keer (1:10) met gedestilleerd water. Vortex en centrifugeren de buis voor 5 s.
- Bewaar de verdunde cDNA tijdelijk op ijs en verplaats de monsters naar −80 °C voor langdurige opslag voor gebruik.
6. qRT-PCR van miRNA
OPMERKING: We gebruikten de intercalatormethode om de qRT-PCR van miRNA uit te voeren. Primers voor RNA zijn U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, en miRNA-7219-5p werden gebruikt.
- Bereid het volgende voor: 1,5 mL microcentrifugebuizen, een vortex mixer, een 96-well reactieplaat voor de qRT-PCR, lijmfolie voor de 96-well reactieplaat, een kleeffolie-applicator, een 96-broncentrifuge rotor, miRNA-specifieke primers, een real-time PCR-instrument, en een groene kleurstof-gebaseerde PCR kit (zie de Tabel van materialen)14,15 met 2x PCR master mix en 10x prime universalr.
- Na het mengen in 1,5 mL microcentrifugebuizen, vortex de volgende items: 6.25 μL gedestilleerd water, 1,25 μL van elke 5 μM miRNA primer opgelost in nuclease-vrij water, 12,5 μL van 2× PCR master mix, en 2,5 μL van 10x universele primer.
- Bereid de cDNA gesynthetiseerd zoals beschreven in stap 5, en smelt het. Vortex en centrifugeren de cDNA voor 5 s.
- Doe een 22,5 μL aliquot van het reagens (gemaakt zoals beschreven in stap 6.2) in elke put van de 96-put plaat.
- Doe een 2,5 μL aliquot cDNA in elke put van de plaat.
- Met behulp van de lijmfolie-applicator beveiligt u de kleeffolie stevig op de 96-putplaat. Centrifuge de plaat met de 96-well centrifuge rotor op 1.000 x g voor 30 s om de reacties te regelen aan de onderkant van elke put.
7. PCR-fietsen
- Start het real-time PCR-systeem en plaats de plaat die is gemaakt zoals beschreven in stap 6.6. in het real-time PCR-systeem. Stel de volgende experimenteigenschappen in. de naam van het experiment te identificeren. Selecteer het volgende: "96-well (0.2 mL)" als het experimenttype van het systeem, "Comparative CT (ΔΔCT)" als de kwantificeringsmethode, "SYBR Green Reagents" als de reagentia om de doelvolgorde te detecteren, en "standaard" als de werking van het systeem.
- Wijs een naam toe aan het monster en de doelmiRNA en wijs vervolgens een naam toe aan het monster en doelmiRNA in elke put. Monsters moeten in tweevoud worden toegewezen om passende gegevens te verkrijgen voor de bevestiging van de resultaten. Selecteer een referentiemonster en een endogene besturingselement en selecteer 'geen' voor de kleurstof die als passieve referentie moet worden gebruikt. Zorg ervoor dat u de negatieve reverse transcriptase en niet-sjablooncontrole voor de miRNA-expressie instelt om de kruisbesmetting van reagentia te elimineren.
- Zorg ervoor dat de instelling van het reactievolume "20 μL" is en dat de PCR-fietsomstandigheden gedurende 15 minuten op 95 °C zijn ingesteld, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 94 °C voor 15 s, geannealing op 55 °C voor 30 s en uitbreiding bij 70 °C voor 30 s.
- Nadat het qRT-PCR-proces is voltooid, gebruikt u het softwareprogramma van het systeem om de qRT-PCR-gegevens te analyseren. Zorg ervoor dat de drempelregel die automatisch door het softwareprogramma wordt geselecteerd, geschikt is voor elke put.
- Controleer de drempelcyclus (CT) waarde van de endogene controle en doel miRNA geanalyseerd in elk monster. De CT-waarde wordt bepaald door het snijpunt van de versterkingscurve en de drempellijn. In deze studie gebruikten we RNU6-2 als een endogene controle voor het doel miRNA-expressieniveau, en we gebruikten de ΔΔCT-methode om het relatieve expressieniveau van elk doelmiRNA20te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een UUO muis model werd gemaakt door linker ureterale ligatie zoals beschreven21 in 8 weken oude mannelijke muizen met een gewicht van 20-25 g. Ureters werden volledig belemmerd door dubbele ligatie met 4-0 zijde hechtingen. Een pijnstiller (meloxicam 5 mg/kg, onderhuidse injectie) werd toegediend vóór de operatie en ook dagelijks op de 2 dagen na de operatie. Na 8 dagen na de operatie werden nieren verzameld, gespoeld met PBS, ontleed en opgeslagen in vloeibare stikstof voor verdere analyse. Sham-operated muizen diende als controles. De dubbele ligatie is succesvol als de linkernier hydronephrosis heeft. Op basis van de miRNA qRT-PCR gegevens verkregen met behulp van dit UUO-model, het niveau van miRNA-3070-3p werd aanzienlijk verhoogd en de niveaus van miRNA-7218-5p en miRNA-7219-5p waren aanzienlijk gedaald in de nieren van de UUO muizen in vergelijking met de controles (Figuur 1).
Figuur 1: Differentieel uitgedrukte miRNAs in de nieren van UUO muizen. qRT-PCR analyse van miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, en miRNA-7219-5p expressie in schijnmuizen (n=8) en UUO muizen (n=8). Waarden zijn gemiddelde ± standaardfout (foutbalken). T-tests werden gebruikt om significante verschillen tussen groepen te onderzoeken. T-tests met een p-waarde <0,05 werden als significant beschouwd. miRNA: microRNA, n.s.: niet significant, qRT-PCR: kwantitatieve real-time reverse-transcriptie polymerase kettingreactie, UUO: unilaterale ureterale obstructie. *p<0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hierboven beschreven protocol met qRT-PCR heeft met succes de expressieniveaus van de beoogde miRNAs bepaald. De beoordeling van geëxtraheerde miRNAs is belangrijk bij het verkrijgen van zinvolle qRT-PCR-gegevens, en om de kwaliteit van de miRNAs te bevestigen voordat de qRT-PCR wordt uitgevoerd, moet de absorptieverhouding van 260 nm tot die bij 280 nm worden gecontroleerd met een spectrofotometer. Als een enkele PCR-versterking van de verwachte lengte en smelttemperatuur of een monomodale smeltcurve niet kan worden verkregen door qRT-PCR, kan er DNA-verontreiniging of een primer dimer in elke put van de reactieplaat.
De expressieniveaus van miRNAs kunnen worden geëvalueerd met verschillende methoden dan qRT-PCR, waaronder microarray, noordelijke blotting en ribonuclease-beschermingstestmethoden. QRT-PCR is echter een eenvoudige, zeer reproduceerbare procedure die zowel nauwkeurig als gevoelig is, en kleinere monstervolumes kunnen worden gebruikt voor qRT-PCR in vergelijking met noordelijke blotting en ribonuclease-beschermingstesten22. Bovendien, aangezien microarrays de gelijktijdige meting van de expressie van tienduizenden miRNAs mogelijk maken, kunnen ze kandidaat miRNA markers identificeren. Microarray-gegevens hebben een algemene hoge correlatie aangetoond met gegevens verkregen door qRT-PCR23, maar een consensus over de optimale methodologie voor het vergelijken van de microarray-gegevens verkregen in verschillende studies is niet bereikt24.
Het nieuwe protocol heeft de volgende beperkingen. Het nut van dit protocol is niet gevalideerd in andere organen, zoals lever en long; en het protocol is niet getest bij andere proefdieren (bijvoorbeeld ratten, honden en varkens). Verschillende groepen meldden dat dit protocol (voor de zuivering en detectie van miRNAs door qRT-PCR) de zuivering van hoogwaardig RNA uit weefsels12,14,15mogelijk maakte . De methode heeft een hoge nauwkeurigheid en gevoeligheid voor het detecteren van miRNA-expressie12,14. Het onderhavige rapport toont aan dat dit protocol kan worden gebruikt om met succes miRNA-expressie in de muisnier te detecteren. Het protocol kan dus worden gebruikt om de miRNA-expressieprofielen in de nieren van muizen met een breed scala aan ziektetoestanden te bepalen. Door de eenvoud van het protocol kunnen veel monsters gelijktijdig worden verwerkt en het gebruik van het protocol kan daarom bijdragen aan de analyses van de expressie van vele miRNAs in verschillende pathologische omstandigheden van de nier.
Er zijn bepaalde aspecten van het protocol om rekening mee te houden en in gedachten te houden. Ten eerste moeten de gezuiverde RNA's op ijs worden gehouden om afbraak bij kamertemperatuur te voorkomen. De niermonsters moeten worden gehomogeniseerd totdat de monsters volledig zijn gesmolten in het lysisreagens. Aangezien muizennieren substantieel bindweefsel bevatten dat niet oplost in lysisreagens, is een kolomversnipperaar noodzakelijk voor verdere homogenisatie. Ten tweede moet de juiste endogene controle miRNA (waarvan de expressie stabiel is onder de monsters) worden geverifieerd in de qRT-PCR experimentele setup, omdat de invasie van verschillende stoffen onder dit protocol het expressieniveau van het endogene controle miRNA zou kunnen veranderen, waardoor de resultaten mogelijk in gevaar komen.
Tot slot hebben we de details gepresenteerd van een qRT-PCR protocol voor de detectie, zuivering en evaluatie van microRNA-expressies in de muisnier met UUO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Wij danken Michelle Goody, PhD, van Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L.
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
