Summary
نحن وصف طريقة لتقييم التعبير ميكرورنا في الكلى من الفئران مع انسداد الحالب الأحادي (UUO) عن طريق تفاعل البوليميراز سلسلة النسخ العكسي الكمية. هذا البروتوكول هو مناسبة لدراسة ملامح التعبير ميكرورنا الكلي في الفئران مع UUO وفي سياق الحالات المرضية الأخرى.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) هي واحدة الذين تقطعت بهم السبل، غير ترميز RNA الجزيئات التي تنظم عادة التعبير الجيني على مستوى ما بعد النسخ من خلال ربط لمواقع مستهدفة مكملة جزئيا في المنطقة غير المترجمة 3 '(UTR) من RNA رسول (مرنا)، مما يقلل من ترجمة الرنا والاستقرار. وقد تم التحقيق في ملامح التعبير ميرنا في مختلف الأجهزة والأنسجة من الفئران، ولكن لم تكن متاحة الأساليب القياسية لتنقية وكمية من ميرنا في الكلى الماوس. لقد أنشأنا طريقة فعالة وموثوق بها لاستخراج وتقييم التعبير ميرنا في الكلى الماوس مع التليف الخلالي الكلوي بواسطة تفاعل البوليمرات العكسية الكمية (qRT-PCR). وتطلب البروتوكول خمس خطوات: (1) إنشاء فئران العرقلة الحالبية الصورية والأحادية؛ (2) و(ج) إنشاء فئران للإعاقة الحالبانية من جانب واحد؛ (2) إنشاء فئران من نوعها؛ (2) إنشاء فئران للإعاقة الشرجية واللحالية من جانب واحد؛ (2 (2) استخراج عينات من الكلى من الفئران UUO؛ (3) استخراج RNA الكلي، الذي يشمل ميرنا، من عينات الكلى؛ (4) مكملة الحمض النووي (cDNA) التوليف مع النسخ العكسي من ميرنا؛ و (5) qRT-PCR باستخدام cDNA. باستخدام هذا البروتوكول، أكدنا بنجاح أنه بالمقارنة مع الضوابط، تم زيادة التعبير عن ميرنا-3070-3p بشكل كبير وتلك من ميرنا-7218-5p وميرنا-7219-5p انخفضت بشكل كبير في الكلى نموذج الماوس من التليف الخلالي الكلوي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد التعبير ميرنا في كليتي الفئران مع UUO.
Introduction
MicroRNAs (ميرناس) - RNAs قصيرة وغير متكول التي تسبب التدهور والتثبيط النسخي من رسول RNA (مرنا)1 - وقد ثبت لتنظيم التعبير عن مختلف mRNAs التي لها أدوار حاسمة في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض (مثل، التهاب، التليف، الاضطرابات الأيضية، والسرطان). قد يكون بعض من miRNAs المرشحة المؤشرات الحيوية رواية والأهداف العلاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض2,3,4,5. على الرغم من أن ميرنا لمحات التعبير في أجهزة الماوس والأنسجة بما في ذلك الدماغ والقلب والرئة والكبد والكلى وقد وصفت6,7,8,9,10, لم تكن هناك طرق قياسية لاستخراج وتقييم ميرناس في الماوس الكلى مع التليف الخلالي الكلوي.
لقد صممنا بروتوكولا لتنقية موثوق بها والكشف عن تعبيرات miRNAs في كلى الفئران مع التليف الخلالي الكلوي. ويتضمن البروتوكول خمس خطوات رئيسية، على النحو التالي. (1) 8 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران الذكور تنقسم إلى مجموعات من الفئران التي تخضع لعملية صورية (الضوابط) والفئران التي تتعرض لعملية جراحية توفير انسداد الحالب الأحادي (UUO)، والتي ترتبط التليف الخلالي الكلوي. (2) يتم استخراج عينات الكلى من الفئران صورية وUUO ، متجانسة بشكل منفصل في التجانس السيليكون ، ومن ثم نقلها إلى نظام تمزيق biopolymer على العمود تدور microcentrifuge11،12. (3) يتم استخراج مجموع الحمض النووي الريبي التي تحتوي على ميرنا من عينات الكلى بواسطة عمود تدور السيليكا القائم علىغشاء 12،13. (4) باستخدام هذا RNA مجموع المستخرج، يتم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) من RNA مجموع مع استخدام النسخ العكسي، بولي (A) البوليميراز، وأوليجو دي تي التمهيدي14،15. (5) يتم تقييم تعبيرات miRNAs بواسطة الكمى عكس النسخ البوليمرات سلسلة تفاعل (qRT-PCR) باستخدام صبغة intercalating14،15.
ويستند هذا البروتوكول على التحقيقات التي حصلت على عمليات استخراج ذات مغزى وتقييمات من miRNAs في مجموعة متنوعة من الأنسجة11,12,13,14,15, ونظام biopolymer التقطيع المستخدمة في البروتوكول وقد تبين لتنقية عالية الجودة, مجموع RNA من الأنسجة في 200612. وبالإضافة إلى ذلك، أكدت الدراسات السابقة دقة وحساسية جوانب من البروتوكول (أي، التوليف cDNA مع النسخ العكسي، بولي (A) البوليميراز، وأوليجو دي تي التمهيدي من RNA مجموع المستخرجة) لتحديد التعبير ميرنا بواسطة qRT-PCR مع صبغة14،15intercalating . وبما أن البروتوكول الجديد يتمتع بمزايا البساطة وتوفير الوقت والحد من الأخطاء التقنية ، يمكن استخدام البروتوكول في الأبحاث التي تتطلب تحديد دقيق وحساس لملف ميرنا في الكلى الماوس. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق البروتوكول على التحقيقات في العديد من الحالات المرضية.
نحن بعد ذلك وصف تحديد ملامح التعبير ميرنا في الفئران مع UUO، والذي يرتبط التليف الخلالي الكلوي. في البشر، والتليف الخلالي الكلوي هو سمة مشتركة وهامة لكل من أمراض الكلى المزمنة ونهاية المرحلة مرض الكلى، بغض النظر عن المسببات16،17. ويرتبط هذا التليف الخلالي الكلوي مع تطور الفشل الكلوي، ويتميز بزيادة التعبيرات من مكونات مصفوفة خارج الخلية في المساحات الخلالية (على سبيل المثال، الكولاجين، فيبرومينكتين، والعضلات α على نحو سلس actin)17،18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية للحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة جيتشي الطبية وتم تنفيذها وفقًا للمبادئ التوجيهية لاستخدام ورعاية الحيوانات التجريبية من دليل جامعة جيتشي الطبية للحيوانات المختبرية.
1. الجراحة الصورية
- إعداد العناصر التالية: isoflurane، ورقة الفلين، كريم إزالة الشعر، مناديل المختبر، طبق بيتري مع المالحة الفوسفاتية المخزنة (PBS)، 4-0 النايلون، ملاقط، مقص الجراحية، مسحات القطن، و8 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران الذكور.
- تخدير الماوس مع 1.5٪ isoflurane والحفاظ على 1.5٪. ثم، تطبيق كريم إزالة الشعر على بطن الماوس. بعد بضع دقائق، امسح كريم إزالة الشعر بمسح مختبر مبلل بـ PBS.
- حقن 70٪ الإيثانول في بطن الماوس ومن ثم وضع الماوس على ورقة الفلين في موقف supine.
- باستخدام مقص جراحي وملاقط، إجراء شق في الجلد في البطن وقطع العضلات والغشاء الصفاقي من المثانة إلى الحافة السفلى اليسرى من الأضلاع.
- ترطيب اثنين من مسحات القطن مع برنامج تلفزيوني ومن ثم سحب الأمعاء بعناية إلى الجانب. ضع مسحات مبللة لتحديد الكلى الأيسر والصابب.
- أغلق الغشاء البريتوني ثم أغلق الشق بالنايلون 4-0.
2. جراحة UUO
- إعداد العناصر التالية: isoflurane، ورقة الفلين، كريم إزالة الشعر، مناديل المختبر، طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني، 4-0 الحرير، 4-0 النايلون، حقنة 2.5 مل، مسحات القطن، ملاقط، مقص الجراحية، و8 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران الذكور.
- تخدير الماوس مع 1.5٪ isoflurane والحفاظ على 1.5٪. ثم تطبيق كريم إزالة الشعر على بطن الماوس. بعد بضع دقائق، امسح كريم إزالة الشعر بمسح مختبر مبلل بـ PBS.
- حقن 70٪ الإيثانول في الفأرة البطن الماوس ومن ثم وضع الماوس في موقف supine على ورقة الفلين.
- باستخدام مقص جراحي وملاقط، إجراء شق في الجلد في البطن وقطع العضلات والغشاء الصفاقي من المثانة إلى الحافة السفلى اليسرى من الأضلاع.
- ضع حقنة 2.5 مل تحت الماوس. خذ مسحتين من القطن وترطيبها مع برنامج تلفزيوني. سحب الأمعاء بعناية إلى جانب مع ملاقط، ووضع مسحات مبللة بشكل مناسب لتحديد الحالب الأيسر. باستخدام ملاقط، ورفع الكلية اليسرى.
- استخدام الحرير 4-0 لligate الحالب الأيسر في مكانين حوالي 1 سم. قطع الحالب عند نقطة مركز الربطين ، ثم استخدم 4-0 خياطة النايلون لإغلاق الغشاء البريتوني والشق.
3. جمع عينات الكلى
- إعداد ما يلي: 1.5 مل microcentuge أنابيب، isoflurane، ورقة الفلين، 70٪ الإيثانول، طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني، ملاقط، ومقص الجراحية.
- تخدير الماوس مع 1.5٪ isoflurane والحفاظ على 1.5٪. حقن 70٪ الإيثانول في بطنه ووضع الماوس على ورقة الفلين في موقف supine.
- باستخدام مقص جراحي وملاقط، إجراء شق في الجلد في البطن وقطع العضلات والغشاء الصفاقي من المثانة إلى الحافة السفلى اليسرى من الأضلاع.
- ارفع الغشاء البريتوني مع الملاقط. مع مقص الجراحية، وجعل شق جانبية في الحافة العليا من الغشاء البريتوني، ومواصلة شق على طول الحافة أدنى من الأضلاع.
- بعد ذلك ، حدد الكلية اليسرى ، وتجزّرها مع برنامج تلفزيوني حتى تتحول الكلى إلى اللون الأصفر والأبيض لغسل الدم من الأوعية ، وإزالة الكلى عن طريق قطع الشريان الكلوي الأيسر والوريد بالمقص الجراحي. ضع الكلى في طبق بيتري واغسله بعناية مع برنامج تلفزيوني.
- قطع الكلى إلى 10 عينات ملغ مع مقص الجراحية والملاقط (10 ملغ هو الحجم المناسب للخطوة التالية). وضع كل قطعة من الكلى في أنبوبها microcentuge 1.5 مل وإغلاق غطاء الأنبوب.
- نقل كل أنبوب microcentrifuge إلى النيتروجين السائل، والحفاظ على أنابيب في -80 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل قبل الاستخدام.
4. استخراج RNA الكلي من عينات الكلى
- إعداد العناصر التالية: 1.5 مل أنابيب microcentuge، 2.0 مل أنابيب microcentuge، 100٪ الإيثانول، الكلوروفورم، السيليكون المجانس، الجليد، خلاط دوامة، biopolymer تدور الأعمدة في 2.0 مل جمع أنابيب11,12, الأعمدة تدور الراسية غشاء في 2.0 مل جمع أنابيب12,13, phenol/guanidine القائم على كاشف التحلل, غسل العازلة التي تحتوي على guanidine والإيثانول (غسل العازلة 1), غسل العازلة التي تحتوي على الإيثانول (العازلة غسل 2), و RNase- خالية من المياه.
- وضع عينة الكلى 10 ملغ في التجانس السيليكون. إضافة 700 ميكرولتر من الفينول / guanidine القائم على كاشف في التجانس.
- إعداد التجانس ثم اضغط ببطء / تحريف المهيجين في الآفات ضد العينة الكلى لتجانس العينة. كرر الضغط / التواء حتى يتم حل عينة الكلى تماما في كاشف التحلل القائم على الفينول / guanidine.
- لمزيد من تجانس العينة، نقل lysate متجانسة (في أنبوب جمع 2.0 مل) إلى محور محور biopolymer عمود.
- تدور lysate المتجانسة في 14،000 س ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT)، ومن ثم نقل lysate عجلت إلى أنبوب microcentuge غير المستخدمة 1.5 مل microcentuge.
- الجمع بين lysate في أنبوب مع 140 ميكرولتر من الكلوروفورم ثم إغلاق غطاء أنبوب بإحكام. لخلط اللولب والكلوروفورم، عكس الأنبوب 15 مرة.
ملاحظة: يمكن استخدام الكلوروفورم بدون غطاء محرك السيارة. - احتضان كل عينة لمدة 2-3 دقيقة في RT ثم تدور كل عينة في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- دون إزعاج الترسب، نقل فائقة (الذي هو عادة ~ 300 ميكرول) إلى أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge، ثم إضافة 1.5x حجمها (عادة ~ 450 ميكرولتر) من 100٪ الإيثانول. دوامة الخليط لمدة 5 s.
- قم بتحميل 700 ميكرولتر من العينة على عمود دوران مرسو بالغشاء في أنبوب جمع 2.0 مل. أغلق غطاء العمود وتدوير العمود عند 15,000 x g لمدة 15 s. رمي بعيدا lysate عجلت في أنبوب جمع.
- اغسل العينة جيدًا عن طريق إضافة 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل 1 إلى عمود الدوران الراسي بالغشاء في أنبوب جمع 2.0 مل. أغلق غطاء العمود، ثم قم بعمّر العمود عند 15,000 x g لمدة 15 s. رمي بعيدا lysate عجلت في أنبوب جمع.
- قم بتحميل 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل 2 على عمود الدوران الراسي بالغشاء في أنبوب جمع 2.0 مل لإزالة الأملاح التتبعية. أغلق غطاء العمود، ثم قم بعمّر العمود عند 15,000 x g لمدة 15 s. رمي بعيدا lysate عجلت في أنبوب جمع.
ملاحظة: يمكن لعمود الدوران القائم على الغشاء أن يفصل بين الحمض النووي الريبي والحمض النووي. - تنفيذ الخطوة 4.11 مرة أخرى.
- تدور في العمود تدور الغشاء الراسية في أنبوب جمع 2.0 مل مرة أخرى في 15،000 × ز لمدة 1 دقيقة. رمي بعيدا lysate عجلت في أنبوب جمع.
- نقل العمود تدور الغشاء الراسية إلى أنبوب جمع جديد 1.5 مل. قم بإذابة إجمالي الحمض النووي الريبي بإضافة 30 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase إلى العمود. أغلق غطاء العمود، وانتظر 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، تدور العمود في 15،000 س ز لمدة 1 دقيقة.
- نقل المبلغ الإجمالي للعينة التي تحتوي على إجمالي الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد microcentrifuge. وضع كل من الأنابيب على الجليد، وقياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي بواسطة القياس الطيفي.
- احتفظ بالأنابيب مع العينات عند −80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل قبل الاستخدام.
5. توليف من cDNA مع النسخ العكسي من مجموع RNA
ملاحظة: تم إصدار المبادئ التوجيهية لـ MIQE (الحد الأدنى من المعلومات لنشر تجارب PCR الكمية في الوقت الحقيقي) لتشجيع الممارسات التجريبية الأفضل والمساعدة في الحصول على نتائج موثوقة لا لبس فيها19. في هذا البروتوكول، يتم تصنيع cDNA من 1.0 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي المنقى في إجراء من خطوتين باستخدام النسخ العكسي، بولي بوليميراز، وأوليجو دي تي التمهيدي.
- إعداد ما يلي: 1.5 مل microcentruge أنابيب، ثمانية-أنابيب الشريط جيدا مع قبعات، وغطاء من كل ثمانية قطاع أنبوب، والمياه المقطرة، والجليد، ومجموعة النسخ العكسي (انظر جدول المواد)14،15 في حالة ذاب، ودورة حرارية، وخلاط دوامة.
- بدء دورة الحرارية.
- إعداد حل مزيج رئيسي: إضافة 2.0 ميكرولتر من مزيج النسخ العكسي (المدرجة في عدة) و 2.0 ميكرولتر من 10x مزيج حمض نووي في 4.0 ميكرولتر من 5x مرحبا المواصفات العازلة (للحصول على ما مجموعه 8.0 ميكرولتر مزيج رئيسي لكل أنبوب).
- وضع 8.0 μL من حل مزيج ماجستير في كل أنبوب من أنبوب قطاع ثمانية بئر.
- ضبط كثافة RNA الإجمالية. لعزل 1.0 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي من عينات الكلى في 12 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase، قم بنقل الكمية المناسبة من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى الماء المقطر، باستخدام بيانات الكثافة التي تم قياسها كما هو موضح في الخطوة 4.15.
ملاحظة: إذا كان هناك أي تلوث للحمض النووي، فإن الحمض النووي الملوث سوف يتم تضخيمه في qRT-PCR. - ضع 12 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي في كل أنبوب واغلق غطاء الأنبوب. جهاز طرد مركزي أنبوب ل15 x.
- وضع أنبوب في دورة الحرارية واحتضان العينة لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية. المقبل، على الفور احتضان العينة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية لتركيب cDNA.
- عندما اكتمال الحضانة، نقل cDNA إلى أنبوب جديد 1.5 مل microcentuge وتمييع cDNA عشر مرات (1:10) مع الماء المقطر. دوامة وطاردة مركزية الأنبوب لمدة 5 s.
- تخزين مؤقتاً cDNA المخفف على الجليد ونقل العينات إلى -80 درجة مئوية لتخزين على المدى الطويل قبل الاستخدام.
6. qRT-PCR من ميرنا
ملاحظة: استخدمنا طريقة المعايرة لإجراء qRT-PCR من ميرنا. التمهيديات للرنا هي U6 النووية الصغيرة 2 (RNU6-2)، ميرنا-3070-3p، ميرنا-6401، ميرنا-7218-5p، واستخدمت ميرنا-7219-5p.
- إعداد ما يلي: 1.5 مل أنابيب microcentuge، خلاط دوامة، لوحة رد فعل 96-جيدا لqRT-PCR، فيلم لاصق لطبقة رد فعل 96-جيدا، قضيب فيلم لاصق، دوار الطرد المركزي 96-جيدا، التمهيديات ميرنا محددة، صك PCR في الوقت الحقيقي، ومجموعة PCR صبغ الخضراء القائمة (انظر جدول المواد)14،,15 تحتوي على 2X PCR مزيج رئيسي و 10x العالمي PRIMER.
- بعد خلط لهم في 1.5 مل microcentrifuge الأنابيب، دوامة العناصر التالية: 6.25 ميكرولتر من الماء المقطر، 1.25 ميكرولتر من كل 5 ميكرومتر ميرنا التمهيدي الذائب في المياه خالية من النوى، 12.5 μL من 2× PCR الماجستير مزيج، و 2.5 μL من 10x التمهيدي العالمي.
- إعداد cDNA توليفها كما هو موضح في الخطوة 5، واصهره. دوامة و جهاز طرد مركزي وcDNA لمدة 5 s.
- وضع 22.5 ميكرولتر aliquot من الكاشف (التي تم إنشاؤها كما هو موضح في الخطوة 6.2) في كل بئر من 96-جيدا لوحة.
- وضع 2.5 ميكرولتر aliquot من cDNA في كل بئر من لوحة.
- باستخدام قضيب فيلم لاصق، وتأمين فيلم لاصق بإحكام على لوحة 96-جيدا. أجهزة الطرد المركزي لوحة مع 96 جيدا الدوار الطرد المركزي في 1000 س ز لمدة 30 s لتسوية ردود الفعل في الجزء السفلي من كل بئر.
7. PCR ركوب الدراجات
- بدء تشغيل نظام PCR في الوقت الحقيقي، ووضع لوحة تم إنشاؤها كما هو موضح في الخطوة 6.6. في الوقت الحقيقي نظام PCR. تعيين خصائص التجربة التالية؛ تعريف اسم التجربة. حدد ما يلي: "96-well (0.2 مل)" كنوع تجربة النظام، "CT المقارنة (ΔCT)" كأسلوب الكمية، "SYBR الكواشف الخضراء" ككاشيف للكشف عن تسلسل الهدف، و "القياسية" كما تشغيل النظام.
- تعيين اسم للعينة والهدف من ميرنا، ومن ثم تعيين اسم للعينة والهدف ميرنا في كل بئر. وينبغي أن تُخصص العينات في نسختين من أجل الحصول على البيانات المناسبة لتأكيد النتائج. حدد عينة مرجعية وتحكم داخلي، وحدد "بلا" للصبغة لاستخدامها كمرجع سلبي. تأكد من تعيين النسخ العكسية السلبية والتحكم غير القالب للتعبير ميرنا من أجل القضاء على التلوث المتبادل من الكواشف.
- تأكد من أن ضبط حجم التفاعل هو "20 ميكرولتر" ويتم تعيين شروط ركوب الدراجات PCR عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها 40 دورة من الdenaturation عند 94 درجة مئوية لمدة 15 s، والحنيع عند 55 درجة مئوية لمدة 30 s، والامتداد عند 70 درجة مئوية لمدة 30 s.
- بعد اكتمال عملية qRT-PCR، استخدم برنامج النظام لتحليل بيانات qRT-PCR. تأكد من أن خط العتبة الذي يتم تحديده تلقائيًا من قبل برنامج البرنامج مناسب لكل بئر.
- تحقق من قيمة دورة العتبة (CT) من التحكم الداخلي والهدف ميرنا تحليلها في كل عينة. يتم تحديد قيمة CT بواسطة تقاطع منحنى التضخيم وخط العتبة. في هذه الدراسة، استخدمنا RNU6-2 كتحكم داخلي لمستوى التعبير ميرنا المستهدف، واستخدمنا طريقة ΔCT لتحديد مستوى التعبير النسبي لكل هدف ميرنا20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إنشاء نموذج فأر UUO عن طريق الربط الحالب اليسار كما هو موضح21 في 8 أسابيع الفئران الذكور وزنها 20-25 ز. تم عرقلة الحالب تماما من قبل الربط المزدوج مع 4-0 خياطة الحرير. تم إعطاء مسكن (ميلوكسيكام 5 ملغ / كجم ، حقن تحت الجلد) قبل الجراحة وكذلك يوميًا في اليومين اللاحقين للجراحة. في 8 أيام بعد الجراحة، تم جمع الكلى، وشطف مع برنامج تلفزيوني، تشريح، وتخزينها في النيتروجين السائل لمزيد من التحليل. كانت الفئران التي تديرها شام بمثابة ضوابط. نجاح الربط المزدوج إذا كانت الكلية اليسرى لديها هدروفيرات. استنادا إلى بيانات ميرنا qRT-PCR التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النموذج UUO، تم زيادة مستوى ميرنا-3070-3p بشكل كبير ومستويات ميرنا-7218-5p وميرنا-7219-5p انخفضت بشكل كبير في كليتي الفئران UUO بالمقارنة مع الضوابط(الشكل 1).
الشكل 1: miRNAs التعبير عن التفاضلية في الكلى من الفئران UUO. تحليل qRT-PCR من ميرنا-3070-3p، ميرنا-6401، ميرنا-7218-5p، وتعبير ميرنا-7219-5p في الفئران الشام (ن = 8) و الفأر UUO (ن = 8). القيم تعني ± خطأ قياسي (أشرطة خطأ). واستخدمت اختبارات T للتحقيق في الاختلافات الكبيرة بين المجموعات. T-اختبارات مع قيمة p <0.05 اعتبرت كبيرة. ميرنا: ميكرورنا، ن.س: ليست كبيرة، qRT-PCR: كمية في الوقت الحقيقي النسخ العكسي البوليميراز سلسلة تفاعل، UUO: انسداد الحالب أحادي الجانب. *p<0.05. انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول الموصوف أعلاه مع qRT-PCR بنجاح تحديد مستويات التعبير من miRNAs المستهدفة. تقييم miRNAs المستخرجة مهم عند السعي للحصول على بيانات ذات مغزى qRT-PCR، ومن أجل تأكيد جودة miRNAs قبل تنفيذ qRT-PCR، ينبغي فحص نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى أن في 280 نانومتر مع مقياس الطيفي. إذا لم يكن بالإمكان الحصول على تضخيم واحد للطول ودرجة حرارة الذوبان المتوقعة أو منحنى ذوبان أحادية المدى بواسطة qRT-PCR، فقد يكون هناك تلوث بالحمض النووي أو خافض أولي في كل بئر من ألواح التفاعل.
يمكن تقييم مستويات التعبير من miRNAs من قبل عدة طرق أخرى غير qRT-PCR، بما في ذلك microarray، النشاف الشمالية، وأساليب الفحص الحماية ribonuclease. ومع ذلك، qRT-PCR هو إجراء بسيط، استنساخ عالية على حد سواء دقيقة وحساسة، ويمكن استخدام أحجام العينات أصغر لqRT-PCR مقارنة مع الشمالية النشاف وحماية ribonuclease المقايسات22. وبالإضافة إلى ذلك، بما أن المنشآت الصغيرة تمكن من القياس المتزامن للتعبير عن عشرات الآلاف من الـ miRNAs، فإنها تستطيع تحديد علامات ميرنا المرشحة. وقد أظهرت بيانات Microarray وجود ارتباط عال عموما مع البيانات التي تم الحصول عليها من قبل qRT-PCR23، ولكن لم يتم التوصل إلى توافق في الآراء حول المنهجية المثلى لمقارنة البيانات الدقيقة التي تم الحصول عليها في دراسات متباينة24.
يحتوي البروتوكول الجديد على القيود التالية. لم يتم التحقق من فائدة هذا البروتوكول في أجهزة أخرى، مثل الكبد والرئة; ولم يتم اختبار البروتوكول في المختبرات الأخرى (مثل الجرذان والكلاب والخنازير). وأفادت عدة مجموعات أن هذا البروتوكول (لتنقية وكشف miRNAs بواسطة qRT-PCR) مكن من تنقية عالية الجودة RNA من الأنسجة12،14،15. الأسلوب لديه دقة عالية وحساسية للكشف عن التعبير ميرنا12،14. ويبين هذا التقرير أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه للكشف بنجاح عن تعبير ميرنا في كلية الماوس. ويمكن بالتالي استخدام البروتوكول لتحديد ملامح التعبير ميرنا في كليتي الفئران مع مجموعة واسعة من حالات المرض. نظرًا لبساطة البروتوكول ، يمكن معالجة العديد من العينات في وقت واحد ، وبالتالي يمكن استخدام البروتوكول المساهمة في تحليل التعبير عن العديد من الـ miRNAs في مختلف الحالات المرضية للكلى.
هناك جوانب معينة من البروتوكول يجب أن تكون على علم بها وتبقيها في الاعتبار. أولاً، يجب أن تبقى الـ RNAs المنقية على الجليد لمنع التدهور في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تكون عينات الكلى متجانسة حتى تذوب العينات تمامًا في كاشف التحلل. منذ أن تحتوي الكلى الماوس على أنسجة الضامة الكبيرة التي لا تذوب في كاشف التحلل ، فإن مزقت العمود ضروري لمزيد من التجانس. ثانياً، يجب التحقق من الـ(ميرنا) التحكم الذاتي السليم (الذي يكون تعبيره مستقراً بين العينات) في جميع مراحل الإعداد التجريبي لـ qRT-PCR لأن غزو مواد مختلفة بموجب هذا البروتوكول يمكن أن يغير مستوى التعبير عن ميرنا للتحكم الداخلي، مما قد يعرض النتائج للخطر.
في الختام، قمنا بعرض تفاصيل بروتوكول qRT-PCR للكشف، وتنقية، وتقييم التعبيرات ميكرورنا في الكلى الماوس مع UUO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس هناك تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر ميشيل جودي، دكتوراه، من مجموعة إدانز (https://en-author-services.edanzgroup.com/) لتحرير مسودة لهذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L.
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
