Summary
我们描述了一种通过定量逆转录聚合酶链反应评估具有单性尿道阻塞（UUO）小鼠肾脏微RNA表达的方法。该协议适用于研究小鼠的肾微RNA表达配置文件与UOU和其他病理条件的背景下。
Abstract
MicroRNA （miRNA） 是单链、非编码的RNA分子，通常通过结合信使RNA（MRNA）的3'未翻译区域（UTR）中部分互补的目标位点来调节转录后水平的基因表达，从而降低mRNA的翻译和稳定性。对小鼠各种器官和组织中的miRNA表达特征进行了调查，但小鼠肾脏中miRNA的纯化和定量标准方法尚未提供。通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），为小鼠肾内质纤维化提取和评价miRNA表达建立了有效可靠的方法。议定书需要五个步骤：（1） 制造假和单边尿道阻塞（UUO）小鼠;（2） 制造假和单边尿道阻塞（UUO）小鼠;（3） 制造假和单边尿道阻塞（UUO）小鼠;（3） 制造假和单边尿道阻塞（UUO）小鼠;（3） 制造假尿（2） 从UOO小鼠中提取肾脏样本;（3） 从肾脏样本中提取总RNA，包括miRNA;（4） 与miRNA逆转录的互补DNA（cDNA）合成;和 （5） qrt - PCR 使用 cDNA。利用本协议，我们成功确认，与对联相比，miRNA-3070-3p的表达显著增加，米RNA-7218-5p和miRNA-7219-5p的肾间性纤维化小鼠模型的肾脏的表达显著减少。该协议可用于确定具有 UUO 的小鼠肾脏中的 miRNA 表达。
Introduction
MicroRNA （miRNA） - 导致信使RNA （mRNA）1降解和转录抑制的短，非编码RNA - 已被证明调节各种在生理学和疾病中具有关键作用的mRNA的表达（如炎症、纤维化、代谢紊乱和癌症）。因此，一些miRNA可能是各种疾病2，3，4，5,3的候选新型生物标志物和,治疗靶点。虽然小鼠器官和组织（包括脑、心、肺、肝、肾）的,miRNA表达特征,被描述为6、7、8、9、10，,7但还没有标准的方法对小鼠肾脏中患有肾间裂纤维化的miRNA进行提取和评价。9,108
我们设计了一个协议，以可靠地净化和检测肾间体纤维化小鼠肾脏中miRNA的表达。该协议涉及以下五个主要步骤。（1） 8周大的C57BL/6雄性小鼠分为接受假手术（对子）的小鼠和接受单体尿道阻塞（UUO）手术的小鼠，这些小鼠与肾间质纤维化有关。（2） 肾脏样本从假鼠和UOU小鼠中提取，在硅均质器中分别均质，然后转移到微离心柱11、12,上的生物聚合物粉碎系统。（3） 含有miRNA的总RNA通过硅膜基自旋柱12，13从肾脏样本中提取。（4） 利用这种提取的总RNA，使用逆转录酶、聚（A）聚合酶和寡聚-dT素，14，15，从总RNA中合成补充DNA（cDNA）。15（5） miRNA的表达通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）使用交算染料14，15,进行评估。
该协议是基于调查，取得了有意义的提取和评估在各种组织11，12，13，14，15，和协议中使用的生物聚合物粉碎系统被证明从组织在200611,12,13,14,15年12的高质量，总RNA。此外，先前的研究已经确认了协议各个方面（即具有逆转录酶、聚（A）聚合酶和从提取总RNA中提取的寡戈-dT质而合成的cDNA合成的准确性和敏感性），用于通过qRT-PCR测定具有中间染料14，15的miRNA表达。由于新协议具有简单、省时、减少技术误差等优点，因此该协议可用于需要准确、灵敏识别小鼠肾脏中miRNA配置文件的研究。此外，该议定书可适用于对许多病理状况的调查。
接下来，我们描述与UUO小鼠的miRNA表达特征的测定，它与肾脏间型纤维化有关。在人类中，肾间性纤维化是慢性肾病和末期肾病的常见和重要特征，无论其病因如何16，17。,17这种肾间质纤维化与肾衰竭的进展有关，它的特点是间质空间（如胶原蛋白、纤维素和α平滑肌蛋白）中细胞外基质成分的表达增加，17，,18。
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Protocol
所有动物实验方案都经过吉池医科大学动物伦理委员会的批准，并按照《济池医科大学实验动物指南》中的实验动物使用和护理指南执行。
1. 假手术
- 准备以下物品：异氟兰、软木塞、脱毛霜、实验室湿巾、带磷酸盐缓冲盐水（PBS）、4-0尼龙、钳子、手术剪刀、棉签和8周大的C57BL/6雄性小鼠的培养皿。
- 用1.5%等值的小鼠麻醉，并保持在1.5%。然后，在小鼠腹部涂抹脱毛霜。几分钟后，用 PBS 浸泡的实验室擦拭擦掉脱毛霜。
- 将70%乙醇注入小鼠腹部，然后将鼠标放在软木片上。
- 使用手术剪刀和钳子，在腹部的皮肤做切口，将肌肉和腹膜从膀胱切到肋骨的左下边缘。
- 用 PBS 润湿两个棉签，然后小心地将肠子拉到侧面。放置湿润的拭子，以确定左肾和尿尿器。
- 关闭膜膜，然后用4-0尼龙关闭切口。
2. UUO 手术
- 准备以下物品：异氟兰、软木纸、脱毛霜、实验室湿巾、带PBS的培养皿、4-0丝、4-0尼龙、2.5毫升注射器、棉签、钳子、手术剪刀和8周大的C57BL/6雄性小鼠。
- 用1.5%等值的小鼠麻醉，并保持在1.5%。然后将脱毛霜涂在小鼠的腹部。几分钟后，用 PBS 浸泡的实验室擦拭擦掉脱毛霜。
- 将 70% 乙醇注入小鼠的腹部小鼠，然后将鼠标放在软木片上的上部位置。
- 使用手术剪刀和钳子，在腹部的皮肤做切口，将肌肉和腹膜从膀胱切到肋骨的左下边缘。
- 将 2.5 mL 注射器放在鼠标下方。拿两个棉签，用PBS润湿。用钳子小心地将肠子拉到一侧，并适当放置湿润的拭子，以识别左侧的尿道。用钳子，抬起左肾。
- 使用 4-0 丝绸将左尿尿器在两个相距约 1 厘米的地方进行开裂。切开两个粘结中心点的尿道，然后用4-0尼龙缝合线关闭膜和切口。
3. 肾脏样本收集
- 准备以下：1.5 mL微离心管，异氟兰，软木纸，70%乙醇，带PBS的培养皿，钳子和手术剪刀。
- 用1.5%等值的小鼠麻醉，并保持在1.5%。将70%乙醇注入腹部，将鼠标放在软木片上。
- 使用手术剪刀和钳子，在腹部的皮肤做切口，将肌肉和腹膜从膀胱切到肋骨的左下边缘。
- 用钳子提起膜膜。使用手术剪刀，在膜上边缘进行侧切，然后沿着肋骨的最低边缘继续切口。
- 接下来，识别左肾，用PBS回流，直到肾脏变成黄白洗去血管中的血液，用手术剪刀切开左肾动脉和静脉，取出肾脏。将肾脏放在培养皿中，用 PBS 仔细清洗。
- 用手术剪刀和钳子将肾脏切成10毫克的样本（10毫克是下一步的适当尺寸）。将肾脏的每一块放在自己的1.5 mL微离心管中，并关闭管盖。
- 将每个微离心管转移到液氮中，并在使用前将管保持 +80°C，以长期储存。
4. 从肾脏样本中提取总RNA
- 准备以下项目：1.5 mL微离心管，2.0mL微离心管，100%乙醇，氯仿，硅均质器， 冰，涡流器，生物聚合物自旋柱在2.0 mL收集管11，12，膜锚旋转柱在2.0 mL收集管11,12，13，苯12,13酚/瓜尼丁为基础的裂解试剂，含有瓜尼丁和乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液1），洗涤缓冲液含有乙醇（洗涤缓冲液2），和无RNase水。
- 在硅均质器中放入10毫克肾脏样本。在均质器中加入700μL的苯酚/瓜尼丁基解解试剂。
- 准备均质器，然后缓慢按/扭曲均质器对肾脏样品的纠缠，使样品均质化。重复压/扭，直到肾脏样品完全溶解在苯酚/瓜尼丁基解结试剂中。
- 要进一步使样品均质化，请将均质裂酸（在 2.0 mL 收集管中）转移到生物聚合物旋转柱中。
- 在室温 （RT） 下以 14，000 x g 旋转均质裂酸 3 分钟，然后将沉淀的裂酸转移到未使用的 1.5 mL 微离心管中。
- 将管中的利酸盐与 140 μL 的氯仿混合，然后紧闭管盖。要混合酸盐和氯仿，反转管15次。
注：氯仿无需罩即可使用。 - 在RT下孵育每个样品2~3分钟，然后在12，000 x g 下旋转每个样品，在4°C下旋转15分钟。
- 在不干扰沉淀物的情况下，将上流水液（通常为 ±300 μL）转移到新的 1.5 mL 微离心管中，然后加入其体积 （通常为 ±450 μL）100% 乙醇的 1.5 倍。漩涡混合物5 s。
- 将样品的 700 μL 加载到 2.0 mL 收集管中的膜锚定旋转柱上。关闭柱盖，以 15，000 x g 旋转柱，旋转 15 s。扔掉收集管中沉淀的利酸盐。
- 通过将 700 μL 的洗涤缓冲液 1 添加到 2.0 mL 收集管中的膜锚旋转柱中，彻底清洗样品。关闭柱盖，以 15，000 x g 旋转柱，旋转 15 s。扔掉收集管中沉淀的利酸盐。
- 将 500 μL 的洗涤缓冲液 2 加载到 2.0 mL 收集管中的膜锚定旋转柱上，以去除微量盐。关闭柱盖，以 15，000 x g 旋转柱，旋转 15 s。扔掉收集管中沉淀的利酸盐。
注：膜锚定旋转柱可以分离RNA和DNA。 - 再次执行步骤 4.11。
- 在 2.0 mL 收集管中再次旋转膜锚旋转柱，以 15，000 x g 旋转 1 分钟。扔掉收集管中沉淀的利酸盐。
- 将膜锚定旋转柱转移到新的 1.5 mL 收集管中。通过将 30 μL 无 RNase 水添加到柱中，溶解总RNA。关闭柱盖，在室温下等待 5 分钟。然后，以 15，000 x g 旋转列 1 分钟。
- 将含有总RNA的样品总量转移到新的微离心管中。将每个管子放在冰上，通过分光光度测量测量总RNA的浓度。
- 将样品的管子在 +80 °C 下存放，在使用前进行长期储存。
5. 与总RNA的逆转录合成cDNA
注：MIQE（定量实时PCR实验发布最低信息）指南发布，以鼓励更好的实验实践，并帮助获得可靠和明确的结果19。在该协议中，cDNA在使用逆转录酶、聚（A）聚合酶和寡聚-dT素面的两步程序中从1.0μg纯化总RNA中合成。
- 准备以下：1.5 mL微离心管，带盖的八井带管，每个八条管的盖，蒸馏水，冰，逆转录酶套件（见材料表）14，15,15在熔化状态，热循环器和涡流混合器。
- 启动热循环器。
- 准备主混合溶液：将2.0μL的逆转录酶混合物（包含在试剂盒中）和2.0μL的10倍核酸混合物加入4.0μL的5倍高规格缓冲液（每管总共获得8.0μL主混合物）。
- 将 8.0 μL 的主混合溶液放入八井条管的每个管中。
- 调整总RNA密度。要将12微升无RNase水的肾脏样本中1.0μg的总RNA分离，使用步骤4.15中所述的密度数据将适当量的总RNA转移到蒸馏水中。
注：如果存在任何DNA污染，受污染的DNA将在qRT-PCR中共同放大。 - 将总RNA的12μL等分放入每个管中，并关闭管盖。将管子离心15 x。
- 将管子放入热循环器中，在 37 °C 下孵育样品 60 分钟。 接下来，立即在95°C下孵育样品5分钟，以合成cDNA。
- 孵育完成后，将cDNA转移到新的1.5 mL微离心管中，用蒸馏水稀释cDNA十次（1：10）。涡流和离心管5 s。
- 将稀释的 cDNA 暂时存放在冰上，在使用前将样品移至 +80°C 进行长期储存。
6. miRNA 的 qrt - PCR
注：我们使用中间器方法执行miRNA的qRT-PCR。RNA 的底剂为 U6 小核 2 （RNU6-2）、miRNA-3070-3p、miRNA-6401、miRNA-7218-5p 和 miRNA-7219-5p。
- 准备以下：1.5 mL 微离心管， 涡流混合器、qRT-PCR的96井反应板、96井反应板的胶粘膜、胶粘膜施用器、96井离心转子、miRNA专用源、实时PCR仪器和绿色染料基普纸盒（见材料表）14、15,包含2x Table of MaterialsPCR主混合和10x通用底转。15
- 在1.5 mL微离心管中混合后，涡流以下项目：6.25μL的蒸馏水，1.25μL的每5μM米RNA底膜溶解在无核酸酶，12.5μL的2× PCR主混合，2.5μL的10倍万维质。
- 准备步骤5中描述的cDNA，然后熔化。涡流和离心cDNA5 s。
- 将试剂的22.5μL等分（如步骤6.2所述）放入96井板的每个井中。
- 在板的每个井中放入2.5μL的cDNA。
- 使用胶膜施用器，将粘合膜紧贴在 96 井板上。将板与96井离心转子在1000xg的30sg下离心，以解决每井底部的反应。
7. PCR 自行车
- 启动实时 PCR 系统，并放置步骤 6.6 中所述创建的板。在实时 PCR 系统中。接下来设置实验属性;标识实验名称。选择以下："96井（0.2 mL）"作为系统的实验类型，"比较CT（+CT）"作为定量方法，"SYBR绿色试剂"作为检测目标序列的试剂，作为系统的运行"标准"。
- 为样品和目标 miRNA 指定名称，然后为每个井中的样本和目标 miRNA 指定名称。样品应按重复方式分配，以便获得适当的数据以确认结果。选择参考样本和内源控制，然后选择"无"，用于染料作为被动参考。确保为miRNA表达设置负逆转录酶和非模板控制，以消除试剂的交叉污染。
- 确保反应体积设置为"20 μL"，PCR循环条件设置为95°C15分钟，随后在94°C下设定40个变性周期，15秒，55°C退火，30秒，30°C延长。
- qRT-PCR 过程完成后，使用系统的软件程序分析 qRT-PCR 数据。确保软件程序自动选择的阈值线适用于每一个井。
- 检查内源控制值和每个样本中分析的目标miRNA的阈值周期（CT）。CT 值由放大曲线和阈值线的交集确定。本研究中，我们使用RNU6-2作为目标miRNA表达水平的内源性控制，并采用μCT方法确定每个目标miRNA20的相对表达水平。
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Representative Results
UUO小鼠模型是由左尿道结扎创建，如描述21 在8周大的雄性小鼠体重20-25克。用4-0丝线线进行双连结完全阻碍。镇痛（旋律5毫克/千克，皮下注射）在手术前和手术后2天每天施用。手术后8天，肾脏被收集，用PBS冲洗，解剖，并储存在液氮中作进一步分析。沙姆操作的老鼠充当对等对等对等对等对等。如果左肾有肝肾病，双结扎是成功的。基于使用此 UUO 模型获得的 miRNA qRT-PCR 数据，miRNA-3070-3p 水平显著提高，与对联对组相比，UUO 小鼠肾脏的 miRNA-7218-5p 水平和 miRNA-7219-5p 水平显著降低（图 1）。
图1：UUO小鼠肾脏中不同表达miRNA。qRT-PCR分析miRNA-3070-3p、miRNA-6401、miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p在假小鼠（n=8）和UO小鼠（n=8）的miRNA-7219-5p表达。值是标准±（误差条）的平均值。T-测试用于调查组之间的显著差异。p 值 <0.05 的 T 测试被认为很重要。miRNA： microRNA， n.s.： 不显著， qRT-PCR： 定量实时逆转录聚合酶链反应， UUO： 单体尿道阻塞.*p<0.05。单击此处查看此图的较大版本。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
上述 qRT-PCR 协议成功确定了目标 miRNA 的表达级别。在寻求获得有意义的 qRT-PCR 数据时，对提取的 miRNA 进行评估非常重要，为了在执行 qRT-PCR 之前确认 miRNA 的质量，应使用分光光度计检查 260 nm 的吸光率与 280 nm 的吸光率。如果 qRT-PCR 无法获得预期长度和熔化温度的单PCR放大或单模熔化曲线，则反应板的每个井中可能有DNA污染或底片二丁二苯。
miRNA的表达水平可以通过qRT-PCR以外的几种方法进行评估，包括微阵列、北印迹和核糖核酸酶保护测定方法。然而，qRT-PCR是一种简单、高度可重复的程序，既准确又敏感，与北方印迹和核糖核酸酶保护测定22相比，QRT-PCR的样本量更小。此外，由于微阵列能够同时测量数万个miRNA的表达，因此它们可以识别候选miRNA标记。微阵列数据表明，与qRT-PCR23获得的数据总体相关性很高，但对比较不同研究中获得的微阵列数据的最佳方法的共识尚未达到24。
新协议有以下限制。此协议的效用尚未在其他器官（如肝脏和肺）得到验证;该协议尚未在其他实验动物（如大鼠、狗和猪）中进行测试。几个小组报告说，该协议（通过qRT-PCR纯化和检测miRNA）使高质量RNA从组织12，14，15,14纯化。该方法具有高精度和灵敏度检测miRNA表达12，14。12,本报告证明，此协议可用于成功检测小鼠肾脏中的miRNA表达。因此，该协议可用于确定具有广泛疾病状态的小鼠肾脏中的miRNA表达特征。由于协议的简单性，许多样本可以同时处理，因此使用该协议有助于分析肾脏各种病理条件下许多miRNA的表达。
协议的某些方面需要注意并记住。首先，纯化的RNA必须放在冰上，以防止在室温下降解。肾脏样本必须均质化，直到样品完全熔化在解解试剂中。由于小鼠肾脏含有大量结缔组织，不溶于解解试剂，因此需要一个柱碎纸机来进一步均质化。其次，在整个 qRT-PCR 实验设置中必须验证适当的内源性控制 miRNA（其表达在样本中稳定），因为本协议下各种物质的入侵可能会改变内源性对米RNA的表达水平，从而可能损害结果。
最后，我们提出了qRT-PCR协议的细节，用于检测、纯化和评估小鼠肾脏中的微RNA表达与UO。
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Disclosures
提交人声明，他们没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢来自埃丹兹集团（https://en-author-services.edanzgroup.com/）的博士米歇尔·古德编辑了这份手稿草稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
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