Summary
Nous décrivons une méthode pour évaluer l’expression de microARN dans les reins des souris avec l’obstruction ureterale unilatérale (UUO) par la réaction quantitative de la chaîne de transcription inverse-polymérase. Ce protocole convient pour étudier les profils d’expression de microARN de rein chez les souris avec UUO et dans le contexte d’autres conditions pathologiques.
Abstract
Les microARN (miARN) sont des molécules d’ARN uniques et non codantes qui régulent généralement l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel en se liant à des sites cibles partiellement complémentaires dans la région non traduite (UTR) de l’ARN messager (ARNm) 3', ce qui réduit la traduction et la stabilité de l’ARNm. Les profils d’expression miRNA dans divers organes et tissus de souris ont été étudiés, mais les méthodes standard pour la purification et la quantification du miRNA dans le rein de souris n’ont pas été disponibles. Nous avons établi une méthode efficace et fiable pour extraire et évaluer l’expression de miRNA dans le rein de souris avec la fibrose interstitielle rénale par la réaction quantitative de la polymérase de transcription inverse (qRT-PCR). Le protocole exigeait cinq étapes : (1) la création de souris d’obstruction uterérale et unilatérales ( UUO); (2) l’extraction d’échantillons de rein sur les souris UUO; (3) l’extraction de l’ARN total, qui comprend le miARN, à partir des échantillons de rein; (4) synthèse complémentaire de l’ADN (ADC) avec transcription inversée du miARN; et (5) qRT-PCR à l’aide de l’ADD. En utilisant ce protocole, nous avons confirmé avec succès que par rapport aux contrôles, l’expression de miRNA-3070-3p a été significativement augmentée et ceux de miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p ont été significativement diminués dans les reins d’un modèle de souris de la fibrose interstitielle rénale. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer l’expression miRNA dans les reins des souris avec UUO.
Introduction
Il a été démontré que les microARN (miARN) — les ARN courts et non coodants qui causent la dégradation et l’inhibition transcriptionnelle de l’ARN messager (ARNm)1 — régulent l’expression de divers ARNm qui jouent un rôle crucial dans la physiologie et la maladie (p. ex., inflammation, fibrose, troubles métaboliques et cancer). Certains des miARN peuvent donc être candidats de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques pour une variété de maladies2,3,4,5. Bien que les profils d’expression miRNA dans les organes et les tissus de souris, y compris le cerveau, le cœur, le poumon, le foie, et les reins ont été décrits6,7,8,9,10, il n’y a eu aucune méthode standard pour l’extraction et l’évaluation des miARN dans le rein de souris avec la fibrose interstitielle rénale.
Nous avons conçu un protocole pour purifier et détecter de manière fiable les expressions des miARN dans les reins des souris atteintes de fibrose interstitielle rénale. Le protocole comporte cinq étapes principales, comme suit. (1) Les souris mâles C57BL/6 de 8 semaines sont divisées en groupes de souris qui subissent une opération simulée (contrôles) et de souris qui sont soumises à une chirurgie fournissant l’obstruction uréterale unilatérale (UUO), qui est liée à la fibrose interstitielle rénale. (2) Les échantillons de rein sont extraits de la fausse et des souris UUO, homogénéisés séparément dans un homogénéisant de silicium, puis transférés à un système de biopolymère-déchiquetage sur une colonne de spin microcentrifuge11,12. (3) L’ARN total contenant du miARN est extrait des échantillons de rein par une colonne de spin à base de membrane de silice12,13. (4) À l’aide de cet ARN total extrait, l’ADN complémentaire (ADNC) est synthétisé à partir de l’ARN total avec l’utilisation de la transcriptase inverse, de la polymérase(A) et de l’amorce oligo-dT14,15. (5) Les expressions des miARN sont évaluées par réaction quantitative en chaîne de polymérase à transcription inverse (qRT-PCR) à l’aide d’un colorant intercalé14,15.
Ce protocole est basé sur des enquêtes qui ont obtenu des extractions significatives et des évaluations de miARN dans une variété de tissus11,12,13,14,15, et le système de biopolymère-déchiquetage utilisé dans le protocole a été montré pour purifier de haute qualité, ARN total des tissus en 200612. En outre, des études antérieures ont confirmé l’exactitude et la sensibilité des aspects du protocole (c.-à-d. la synthèse de l’ADC avec la transcriptase inverse, la polymérase polymérase, et les amorces oligo-dT de l’ARN total extrait) pour la détermination de l’expression miRNA par qRT-PCR avec un colorant intercalant14,15. Puisque le nouveau protocole a les avantages de la simplicité, de l’économie de temps, et la réduction des erreurs techniques, le protocole peut être utilisé dans la recherche qui nécessite l’identification précise et sensible du profil miRNA dans le rein de souris. En outre, le protocole pourrait être appliqué aux investigations de beaucoup de conditions pathologiques.
Nous décrivons ensuite la détermination des profils d’expression de miRNA chez les souris avec UUO, qui est lié à la fibrose interstitielle rénale. Chez l’homme, la fibrose interstitielle rénale est une caractéristique commune et importante de la maladie rénale chronique et de la maladie rénale terminale, indépendamment de leur étiologie16,17. Cette fibrose interstitielle rénale est associée à la progression de l’insuffisance rénale, et elle se caractérise par une augmentation des expressions des composants de matrice extracellulaire dans les espaces interstitiels (p. ex., collagène, fibronectine et actine musculaire lisse α)17,18.
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Protocol
Tous les protocoles expérimentaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale de Jichi et ont été exécutés conformément aux lignes directrices sur l’utilisation et le soin des animaux expérimentaux du Guide de l’Université médicale Jichi pour les animaux de laboratoire.
1. La chirurgie simulée
- Préparer les articles suivants : isoflurane, feuille de liège, crème dépilatoire, lingettes de laboratoire, plat Petri avec saline tamponnée de phosphate (PBS), nylon 4-0, pince à épiler, ciseaux chirurgicaux, cotons-tiges, et souris mâles C57BL/6 de 8 semaines.
- Anesthésier une souris avec 1,5% d’isoflurane et maintenir à 1,5%. Ensuite, appliquez de la crème dépilatoire sur l’abdomen de la souris. Après quelques minutes, essuyez la crème dépilatoire à l’aide d’un linge de laboratoire imbibé de PBS.
- Injecter 70% d’éthanol dans l’abdomen de la souris, puis placer la souris sur la feuille de liège en position de supination.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces à épiler, faites une incision dans la peau à l’abdomen et coupez le muscle et la membrane péritonéale de la vessie au bord inférieur gauche des côtes.
- Humidifier deux cotons-tiges avec PBS, puis tirer les intestins soigneusement sur le côté. Placez les écouvillons humidifiés pour identifier le rein gauche et l’uretère.
- Fermez la membrane péritonéale, puis fermez l’incision avec du nylon 4-0.
2. La chirurgie UUO
- Préparer les articles suivants : isoflurane, feuille de liège, crème dépilatoire, lingettes de laboratoire, plat Petri avec PBS, soie 4-0, nylon 4-0, seringue de 2,5 mL, coton-tige, pinces à épiler, ciseaux chirurgicaux et souris mâles C57BL/6 de 8 semaines.
- Anesthésier une souris avec 1,5% d’isoflurane et maintenir à 1,5%. Appliquez ensuite de la crème dépilatoire sur l’abdomen de la souris. Après quelques minutes, essuyez la crème dépilatoire à l’aide d’un linge de laboratoire imbibé de PBS.
- Injecter 70% d’éthanol dans la souris de l’abdomen de la souris, puis placer la souris en position supination sur la feuille de liège.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces à épiler, faites une incision dans la peau à l’abdomen et coupez le muscle et la membrane péritonéale de la vessie au bord inférieur gauche des côtes.
- Placez la seringue de 2,5 mL sous la souris. Prenez deux cotons-tiges et humidifiez-les avec pbs. Tirez soigneusement les intestins sur le côté avec la pince à épiler, et placez les écouvillons humidifiés de manière appropriée pour identifier l’uretère gauche. À l’aide de la pince à épiler, soulevez le rein gauche.
- Utilisez la soie 4-0 pour lier l’uretère gauche à deux endroits à environ 1 cm l’un de l’autre. Couper l’uretère au centre des deux ligatures, puis utiliser des sutures en nylon 4-0 pour fermer la membrane péritonéale et l’incision.
3. Collecte d’échantillons de rein
- Préparer ce qui suit : tubes microcentrifuge de 1,5 mL, isoflurane, feuille de liège, 70% éthanol, plat Petri avec PBS, pinces à épiler et ciseaux chirurgicaux.
- Anesthésier une souris avec 1,5% d’isoflurane et maintenir à 1,5%. Injecter 70% d’éthanol dans son abdomen et mettre la souris sur la feuille de liège en position de supination.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces à épiler, faites une incision dans la peau à l’abdomen et coupez le muscle et la membrane péritonéale de la vessie au bord inférieur gauche des côtes.
- Soulevez la membrane péritonéale à l’une de la pince à épiler. Avec les ciseaux chirurgicaux, faire une incision latérale au bord supérieur de la membrane péritonéale, et continuer l’incision le long du bord le plus bas des côtes.
- Ensuite, identifiez le rein gauche, reflux avec PBS jusqu’à ce que le rein devient jaune-blanc pour laver le sang des vaisseaux, et enlever le rein en coupant l’artère rénale gauche et la veine avec les ciseaux chirurgicaux. Placez le rein dans la boîte de Pétri et lavez-le soigneusement avec PBS.
- Couper le rein en échantillons de 10 mg avec les ciseaux chirurgicaux et les pinces à épiler (10 mg est une taille appropriée pour l’étape suivante). Mettez chaque morceau du rein dans son propre tube de microcentrifuge de 1,5 m L et fermez le bouchon du tube.
- Transférez chaque tube de microcentrifuge dans l’azote liquide et maintenez les tubes à −80 °C pour un stockage à long terme avant utilisation.
4. Extraction de l’ARN total à partir des échantillons de rein
- Préparer les éléments suivants : tubes microcentrifuges de 1,5 m L, tubes microcentrifuge de 2,0 m L, éthanol 100%, chloroforme, homogénéisant de silicium, glace, mélangeur de vortex, colonnes de rotation de biopolymère dans des tubes de collecte de 2,0 mL11,12, colonnes de spin à membrane dans des tubes de collecte de 2,0 mL12,13, réactif de lyslyse à base de phénol/guanidine, lavage contenant de la guanidine tampon et de l’éthanol (tampon de lavage 1), tampon de lavage contenant de l’éthanol (tampon de lavage 2), et de l’eau sans RNase.
- Mettez un échantillon de rein de 10 mg dans l’homogénéisant de silicium. Ajouter 700 μL du réactif de lyse à base de phénol/guanidine dans l’homogénéisateur.
- Préparer l’homogénéisant, puis presser lentement /tordre le pilon de l’homogénéisant contre l’échantillon de rein pour homogénéiser l’échantillon. Répétez le pressage/torsion jusqu’à ce que l’échantillon de rein soit complètement dissous dans le réactif de phénol/guanidine.
- Pour homogénéiser davantage l’échantillon, transférer le lysate homogénéisé (dans un tube de collecte de 2,0 mL) à la colonne de rotation biopolymère.
- Faire tourner le lysate homogénéisé à 14 000 x g pendant 3 min à température ambiante (RT), puis transférer le lysate précipité dans un tube de microcentrifuge inutilisé de 1,5 mL.
- Mélanger le lysate dans le tube avec 140 μL de chloroforme, puis fermer le bouchon du tube hermétiquement. Pour mélanger le lysate et le chloroforme, inverser le tube 15 fois.
REMARQUE : Le chloroforme peut être utilisé sans capot. - Incuber chaque échantillon pendant 2 à 3 min à RT, puis faire tourner chaque échantillon à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Sans perturber le précipité, transférer le supernatant (qui est généralement ~300 μL) à un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 mL, puis ajouter 1,5 x son volume (généralement ~450 μL) de 100% d’éthanol. Vortex le mélange pendant 5 s.
- Chargez 700 μL de l’échantillon sur une colonne de spin ancrée à la membrane dans un tube de collecte de 2,0 mL. Fermez le bouchon de colonne et faites tourner la colonne à 15 000 x g pour 15 s. Jetez le lysate précipité dans le tube de collecte.
- Laver l’échantillon à fond en ajoutant 700 μL de tampon de lavage 1 à la colonne de spin ancrée à la membrane dans un tube de collecte de 2,0 mL. Fermez le bouchon de colonne et faites tourner la colonne à 15 000 x g pendant 15 s. Jetez le lysate précipité dans le tube de collecte.
- Chargez 500 μL de tampon de lavage 2 sur la colonne de rotation ancrée à la membrane dans un tube de collecte de 2,0 mL pour enlever les sels de trace. Fermez le bouchon de colonne et faites tourner la colonne à 15 000 x g pendant 15 s. Jetez le lysate précipité dans le tube de collecte.
REMARQUE : Une colonne de spin ancrée à la membrane peut séparer l’ARN et l’ADN. - Effectuez à nouveau l’étape 4.11.
- Faites tourner la colonne de spin ancrée à la membrane dans un tube de collecte de 2,0 mL à 15 000 x g pendant 1 min. Jetez le lysate précipité dans le tube de collecte.
- Transférez la colonne de rotation ancrée à la membrane dans un nouveau tube de collecte de 1,5 mL. Dissoudre l’ARN total en ajoutant 30 μL d’eau sans RNase à la colonne. Fermez le bouchon de colonne et attendez 5 min à température ambiante. Ensuite, faites tourner la colonne à 15 000 x g pendant 1 min.
- Transférer la quantité totale d’échantillon contenant l’ARN total dans un nouveau tube de microcentrifuge. Mettez chacun des tubes sur la glace et mesurez la concentration de l’ARN total par spectrophotométrie.
- Gardez les tubes avec des échantillons à −80 °C pour un stockage à long terme avant utilisation.
5. Synthèse de l’ADNC avec la transcription inversée de l’ARN total
REMARQUE : Les lignes directrices du MIQE (Information minimale pour la publication d’expériences quantitatives en temps réel sur les PCR) ont été publiées afin d’encourager de meilleures pratiques expérimentales et d’obtenir des résultats fiables et sans équivoque19. Dans ce protocole, l’ADNC est synthétisé à partir de 1,0 μg d’ARN total purifié dans une procédure en deux étapes à l’aide de la transcriptase inverse, de la polymérase poly(A) et de l’amorce oligo-dT.
- Préparer ce qui suit : tubes de microcentrifuge de 1,5 m L, tubes à bande de huit puits avec bouchons, bouchon de chaque tube à huit bandes, eau distillée, glace, kit de transcriptase inversée (voir le tableau des matériaux)14,15 à l’état fondu, un cycleur thermique et un mélangeur vortex.
- Démarrez le cycleur thermique.
- Préparer une solution de mixage principal : Ajouter 2,0 μL de mélange de transcriptase inverse (inclus dans le kit) et 2,0 μL de mélange d’acide nucléique 10x dans 4,0 μL de tampon hi-specase 5x (pour obtenir un mélange principal total de 8,0 μL par tube).
- Mettre 8,0 μL de la solution de mélange principal dans chaque tube d’un tube à bande de huit puits.
- Ajuster la densité totale de l’ARN. Pour isoler 1,0 μg d’ARN total des échantillons de rein dans 12 μL d’eau exempte de RNase, transférer la quantité appropriée d’ARN total dans l’eau distillée, à l’aide des données de densité mesurées telles que décrites à l’étape 4.15.
REMARQUE : En cas de contamination par l’ADN, l’ADN contaminé sera co-amplifié dans le qRT-PCR. - Placez un aliquot de 12 μL d’ARN total dans chaque tube et fermez le bouchon du tube. Centrifuge le tube pour 15 x.
- Mettez le tube dans le cycleur thermique et incuber l’échantillon pendant 60 min à 37 °C. Ensuite, incuber immédiatement l’échantillon pendant 5 min à 95 °C pour la synthèse de l’ADC.
- Lorsque l’incubation est terminée, transférer l’ADD dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 m L et diluer l’ADC dix fois (1:10) avec de l’eau distillée. Vortex et centrifugeuse du tube pour 5 s.
- Stockez temporairement l’ADN cDN dilué sur la glace et déplacez les échantillons à −80 °C pour un stockage à long terme avant utilisation.
6. qRT-PCR de miRNA
REMARQUE : Nous avons utilisé la méthode intercalateur pour effectuer le qRT-PCR de miRNA. Les amorces pour l’ARN sont U6 petit nucléaire 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, et miRNA-7219-5p ont été utilisés.
- Préparer ce qui suit : tubes microcentrifuge de 1,5 mL, un mélangeur vortex, une plaque de réaction de 96 puits pour le qRT-PCR, un film adhésif pour la plaque de réaction de 96 puits, un applicateur de film adhésif, un rotor de centrifugeuse de 96 puits, des amorces spécifiques à miRNA, un instrument PCR en temps réel et un kit PCR vert à base de colorant (voir le tableau des matériaux)14,15 contenant un mélange maître PCR 2x et un ensemble universel de 10x.
- Après les avoir mélangées dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 m L, vortex les éléments suivants : 6,25 μL d’eau distillée, 1,25 μL de chaque amorce miRNA de 5 μM dissoute dans de l’eau sans nucléase, 12,5 μL de 2 × mélange principal pcr et 2,5 μL d’amorçage universel de 10 x.
- Préparer l’ADC synthétisé tel que décrit à l’étape 5, et le faire fondre. Vortex et centrifugeuse de l’ADNC pour 5 s.
- Mettez un aliquot de 22,5 μL du réactif (créé tel que décrit à l’étape 6.2) dans chaque puits de la plaque de 96 puits.
- Mettez un aliquot de 2,5 μL d’ADNC dans chaque puits de la plaque.
- À l’aide de l’applicateur de film adhésif, fixer le film adhésif étroitement sur la plaque de 96 puits. Centrifugez la plaque avec le rotor de centrifugeuse de 96 puits à 1 000 x g pour 30 s afin de régler les réactions au fond de chaque puits.
7. Cyclisme PCR
- Démarrez le système PCR en temps réel et placez la plaque créée comme décrit à l’étape 6.6. dans le système PCR en temps réel. Définissez ensuite les propriétés de l’expérience ; identifier le nom de l’expérience. Sélectionnez ce qui suit : « 96 puits (0,2 mL) » comme type d’expérience du système, « CT comparatif (ΔΔCT) » comme méthode de quantitation, « Réactifs verts SYBR » comme réactifs pour détecter la séquence cible et « standard » en tant qu’exécution du système.
- Attribuez un nom à l’exemple et au miRNA cible, puis attribuez un nom à l’échantillon et ciblez le miRNA dans chaque puits. Les échantillons doivent être attribués en double afin d’obtenir les données appropriées pour la confirmation des résultats. Sélectionnez un exemple de référence et un contrôle endogène, puis sélectionnez « aucun » pour que le colorant soit utilisé comme référence passive. Assurez-vous de définir la transcription inverse négative et le contrôle non-modèle pour l’expression miRNA afin d’éliminer la contamination croisée des réactifs.
- Assurez-vous que le réglage du volume de réaction est de « 0 μ » et que les conditions de cycle pcr sont fixées à 95 °C pendant 15 min, suivies de 40 cycles de dénaturation à 94 °C pour 15 s, d’une annéalisation à 55 °C pour 30 s et d’une extension à 70 °C pour 30 s.
- Une fois le processus qRT-PCR terminé, utilisez le logiciel du système pour analyser les données qRT-PCR. Assurez-vous que la ligne de seuil qui est automatiquement sélectionnée par le logiciel est appropriée pour chaque puits.
- Vérifiez la valeur du cycle de seuil (CT) du contrôle endogène et de la cible miRNA analysée dans chaque échantillon. La valeur CT est déterminée par l’intersection de la courbe d’amplification et de la ligne de seuil. Dans la présente étude, nous avons utilisé RNU6-2 comme contrôle endogène pour le niveau d’expression miRNA cible, et nous avons utilisé la méthode ΔΔCT pour déterminer le niveau d’expression relative de chaque cible miRNA20.
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Representative Results
Un modèle de souris UUO a été créé par la ligature uretérale gauche comme décrit21 chez les souris mâles de 8 semaines pesant 20–25 g. Les Uréters ont été complètement obstrués par la double ligature avec des sutures de soie 4-0. Un analgésique (meloxicam 5 mg/kg, injection sous-cutanée) a été administré avant la chirurgie et aussi tous les jours sur les 2 jours après la chirurgie. À 8 jours après la chirurgie, les reins ont été recueillis, rincés avec PBS, disséqués, et stockés dans l’azote liquide pour une analyse plus approfondie. Les souris opérées par sham ont servi de commandes. La double ligature est réussie si le rein gauche a l’hydronéphrose. D’après les données miRNA qRT-PCR obtenues à l’aide de ce modèle UUO, le niveau de miRNA-3070-3p a été considérablement augmenté et les niveaux de miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p ont été considérablement diminués dans les reins des souris UUO par rapport aux témoins (Figure 1).
Figure 1 : MiARN exprimés différemment dans les reins des souris UUO. analyse qRT-PCR de miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, et miRNA-7219-5p expression chez les souris factices (n=8) et les souris UUO (n=8). Les valeurs sont des ±'erreur standard (barres d’erreur). Des tests T ont été utilisés pour étudier des différences significatives entre les groupes. Les tests T avec une valeur p <0,05 ont été considérés comme significatifs. miRNA: microARN, n.s.: pas significatif, qRT-PCR: quantitative en temps réel inverse-transcription polymérase réaction en chaîne, UUO: obstruction ureterale unilatérale. *p<0.05. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus avec qRT-PCR a réussi à déterminer les niveaux d’expression des miARN ciblés. L’évaluation des miARN extraits est importante lorsqu’on cherche à obtenir des données qRT-PCR significatives, et afin de confirmer la qualité des miARN avant d’effectuer le qRT-PCR, le rapport d’absorption à 260 nm à celui de 280 nm doit être vérifié avec un spectrophotomètre. Si une seule amplification pcr de la longueur prévue et de la température de fusion ou une courbe de fusion monomodale ne peut pas être obtenue par qRT-PCR, il peut y avoir une contamination à l’ADN ou un dimère d’amorce dans chaque puits de la plaque de réaction.
Les niveaux d’expression des miARN peuvent être évalués par plusieurs méthodes autres que qRT-PCR, y compris les méthodes de microarray, de blotting nord et d’analyse de protection de la ribonucléase. Toutefois, qRT-PCR est une procédure simple et hautement reproductible qui est à la fois précise et sensible, et de plus petits volumes d’échantillons peuvent être utilisés pour qRT-PCR par rapport aux tests de protection de ballonnement et de ribonucléase du Nord22. En outre, puisque les microarrays permettent la mesure simultanée de l’expression de dizaines de milliers de miARN, ils peuvent identifier les marqueurs miRNA candidats. Les données de Microarray ont montré une corrélation globale élevée avec les données obtenues par qRT-PCR23, mais un consensus sur la méthodologie optimale pour comparer les données de microarray obtenues dans des études disparates n’a pas été atteint24.
Le nouveau protocole a les limites suivantes. L’utilité de ce protocole n’a pas été validée dans d’autres organes, tels que le foie et le poumon; et le protocole n’a pas été testé chez d’autres animaux de laboratoire (p. ex., rats, chiens et porcs). Plusieurs groupes ont signalé que ce protocole (pour la purification et la détection des miARN par qRT-PCR) a permis la purification de l’ARN de haute qualité à partir des tissus12,14,15. La méthode a une grande précision et sensibilité pour détecter l’expression miRNA12,14. Le présent rapport démontre que ce protocole peut être utilisé pour détecter avec succès l’expression miRNA dans le rein de la souris. Le protocole peut donc être utilisé pour déterminer les profils d’expression miRNA dans les reins de souris ayant un large éventail d’états de la maladie. En raison de la simplicité du protocole, de nombreux échantillons peuvent être traités simultanément, et l’utilisation du protocole peut donc contribuer à l’analyse de l’expression de nombreux miARN dans diverses conditions pathologiques du rein.
Il y a certains aspects du protocole à connaître et à garder à l’esprit. Tout d’abord, les ARN purifiés doivent être maintenus sur la glace afin d’éviter la dégradation à température ambiante. Les échantillons de rein doivent être homogénéisés jusqu’à ce que les échantillons soient complètement fondus dans le réactif de lyse. Puisque les reins de souris contiennent le tissu conjonctif substantiel qui ne se dissout pas dans le réactif de lyse, un broyeur de colonne est nécessaire pour davantage d’homogénéisation. Deuxièmement, le miRNA de contrôle endogène approprié (dont l’expression est stable parmi les échantillons) doit être vérifié tout au long de la configuration expérimentale qRT-PCR parce que l’invasion de diverses substances en vertu de ce protocole pourrait changer le niveau d’expression du miRNA de contrôle endogène, compromettant peut-être les résultats.
En conclusion, nous avons présenté les détails d’un protocole qRT-PCR pour la détection, la purification et l’évaluation des expressions microARN dans le rein de souris avec UUO.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Michelle Goody, Ph.D., du Groupe Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) d’avoir édité une ébauche de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
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