Summary
우리는 양적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 일방적인 요원 방해(UUO)를 가진 마우스의 신장에서 마이크로RNA 발현을 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스에 있는 신장 microRNA 발현 단면도및 그밖 병리학 조건의 맥락에서 공부하기 에 적합합니다.
Abstract
MicroRNAs(miRNAs)는 mRNA의 번역 및 안정성을 감소시키는 메신저 RNA(mRNA)의 3'번역되지 않은 영역(UTR)에서 부분적으로 상호 보완적인 표적 부위에 결합하여 전사 후 수준에서 유전자 발현을 전형적으로 조절하는 단일 좌초, 비코딩 RNA 분자이다. 마우스의 다양한 장기 및 조직에서 miRNA 발현 프로파일을 조사하였지만 마우스 신장에서 miRNA의 정제 및 정량화를 위한 표준 방법은 제공되지 않았다. 우리는 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 신장 간질 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNA 발현을 추출하고 평가하기위한 효과적이고 신뢰할 수있는 방법을 설립했습니다. 프로토콜은 다섯 단계를 필요로: (1) 가짜와 일방적 인 요관 방해 (UUO) 마우스의 생성; (2) UUO 마우스로부터 신장 시료의 추출; (3) 신장 샘플에서 miRNA를 포함하는 총 RNA의 추출; (4) miRNA에서 역 전사를 가진 보완 DNA (cDNA) 합성; 및 (5) cDNA를 사용하여 qRT-PCR. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 대조군과 비교하여, miRNA-3070-3p의 발현이 현저하게 증가되었고 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 발현이 신장 간질 섬유증의 마우스 모델의 신장에서 현저히 감소되었다는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스의 신장에 있는 miRNA 발현을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
MicroRNAs (miRNA) - 메신저 RNA (mRNA)1의 분해 및 전사 억제를 일으키는 짧은 비코딩 RNA -는 생리학 과 질병 (예를 들어, 염증, 섬유증, 대사 장애 및 암)에서 중요한 역할을하는 다양한 mRNA의 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 일부 miRNAs는 따라서 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커 및2치료 대상이 될 수 있다2,3,,4,,5. 마우스 장기 및 뇌, 심장, 폐, 간 및 신장을 포함하는 조직에서 miRNA 발현 프로파일이6,7,,8,,9,,10을기재했지만 신장 간 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNAs의 추출 및 평가를 위한 표준 방법이 없었습니다.6
우리는 신장 간질 섬유증을 가진 마우스의 신장에 있는 miRNAs의 표정을 안정적으로 정화하고 검출하기 위하여 프로토콜을 디자인했습니다. 프로토콜에는 다음과 같이 다섯 가지 주요 단계가 포함됩니다. (1) 8주 된 C57BL/6 수컷 마우스는 신장 간질 섬유증에 연결되는 일방적인 요관 방해(UUO)를 제공하는 수술을 받는 가짜 작동(대조군) 및 마우스의 그룹으로 나뉩니다. (2) 신장 샘플은 샴 과 UUO 마우스로부터 추출되고, 실리콘 균질화로 별도로 균질화한 다음, 마이크로센심분리기 스핀컬럼(11,,12)에바이오 폴리머 분쇄 시스템으로 이송된다. (3) miRNA를 함유하는 총 RNA는 실리카 막 계 스핀컬럼(12,,13)에의해 신장 샘플로부터 추출된다. (4) 이 추출된 총 RNA를 이용하여, 상호 보완적인 DNA(cDNA)는 역전사, 폴리(A) 폴리머라제, 및 올리고-dT 프라이머14,,15를사용하여 총 RNA로부터 합성된다. (5) miRNAs의 발현은 상호염료(14,,15)를이용하여 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)에 의해 평가된다.
본 프로토콜은 다양한조직(11,12,,13,,14,,15)에서miRNAs의 의미 있는 추출 및 평가를 획득한 조사에 기초하여, 프로토콜에 사용된 생체 중합체 분쇄 시스템은 2006년조직으로부터고품질, 총 RNA를 정제하는 것으로 나타났다., 또한, 선행 연구는 계열염,14,15를갖는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현의 판정을 위해 프로토콜(즉, 역실래, 폴리(A) 폴리머라제 및 올리고-dT 프라이머를 갖는 cDNA 합성의 양태의 정확성 및 민감도를 확인하였다. 새로운 프로토콜은 단순성, 시간 절약 및 기술적 오류의 감소의 장점을 가지고 있기 때문에, 프로토콜은 마우스 신장에서 miRNA 프로필의 정확하고 민감한 식별을 필요로하는 연구에서 사용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 많은 병리학 적 조건의 조사에 적용 될 수있다.
우리는 신장 간질 섬유증에 연결되는 UUO를 가진 마우스에 있는 miRNA 발현 단면도의 결정을 기술합니다. 인간에서, 신장 간질 섬유증은 그들의 병인학에 관계없이 만성 신장 질환과 말기 신장 질환 모두의 일반적이고 중요한 특징이다16,,17. 이러한 신장 간질 섬유증은 신부전의 진행과 관련이 있으며, 간질 공간에서 세포외 매트릭스 성분의 증가된 발현(예를 들어, 콜라겐, 섬유넥틴 및 α-부드러운 근육 액틴)을 특징으로 한다.17,18
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Protocol
모든 동물 실험 프로토콜은 지치의과대학의 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, 지치의과대학 실험실 동물가이드의 실험동물 사용 및 관리 지침에 따라 시행되었다.
1. 가짜 수술
- 이소플루란, 코르크 시트, 탈취 크림, 실험실 물티슈, 인산염 완충식살린 살린 페트리 접시(PBS), 4-0 나일론, 핀셋, 수술 가위, 면봉, 8주된 C57BL/6 수컷 마우스 를 준비한다.
- 1.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1.5%로 유지합니다. 그런 다음, 마우스의 복부에 디필 크림을 바르습니다. 몇 분 후, PBS에 흠뻑 젖은 실험실 닦아로 탈모 크림을 닦아.
- 마우스의 복부에 70% 에탄올을 주입한 다음 마우스를 마우스 시트에 놓습니다.
- 외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 잘라냅니다.
- PBS로 두 면봉을 적신 다음 내장을 조심스럽게 옆으로 당깁니다. 왼쪽 신장과 요관을 식별하기 위해 촉촉한 면봉을 놓습니다.
- 회막을 닫은 다음 4-0 나일론으로 절개를 닫습니다.
2. UUO 수술
- 이소플루란, 코르크 시트, 탈필 크림, 실험실 물티슈, PBS를 곁들인 페트리 접시, 4-0 실크, 4-0 나일론, 2.5mL 주사기, 면 봉합, 핀셋, 수술 가위, 8주 된 C57BL/남성 마우스 를 준비한다.
- 1.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1.5%로 유지합니다. 그런 다음 마우스의 복부에 디필 크림을 바부합니다. 몇 분 후, PBS에 흠뻑 젖은 실험실 닦아로 탈모 크림을 닦아.
- 마우스의 복부 마우스에 70% 에탄올을 주입한 다음 마우스를 코르크 시트의 척추 위치에 놓습니다.
- 외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 잘라냅니다.
- 마우스 아래에 2.5 mL 주사기를 놓습니다. 두 면 봉면을 가지고 PBS로 적신다. 핀셋으로 창자를 조심스럽게 옆으로 당기고 촉촉한 면봉을 적절히 배치하여 왼쪽 요관자를 식별합니다. 핀셋을 사용하여 왼쪽 신장을 들어 올립니다.
- 4-0 실크를 사용하여 왼쪽 요관을 약 1cm 떨어진 두 곳에서 리게이트합니다. 두 결찰의 중심 지점에서 요소를 잘라 낸 다음 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 회막과 절개를 닫습니다.
3. 신장 샘플 의 수집
- 다음 준비: 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브, 이소플루란, 코르크 시트, 70% 에탄올, PBS를 곁들인 페트리 접시, 핀셋, 외과 가위.
- 1.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1.5%로 유지합니다. 복부에 70% 에탄올을 주입하고 마우스를 스핀 위치에 있는 코르크 시트에 놓습니다.
- 외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 잘라냅니다.
- 핀셋으로 회막을 들어 올립니다. 외과 가위를 사용하면 회막의 상단 가장자리에 옆으로 절개를하고 갈비뼈의 가장 낮은 가장자리를 따라 절개를 계속합니다.
- 다음으로, 왼쪽 신장을 확인하고, 신장이 혈관에서 혈액을 씻어 내기 위해 노란색 흰색으로 변할 때까지 PBS로 역류하고, 수술 가위로 왼쪽 신장 동맥과 정맥을 절단하여 신장을 제거합니다. 페트리 접시에 신장을 놓고 PBS로 조심스럽게 씻으시다.
- 외과 가위와 핀셋으로 신장을 10 mg 샘플로 잘라냅니다 (10 mg은 다음 단계에 적합한 크기입니다). 신장의 각 조각을 자체 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 튜브의 캡을 닫습니다.
- 각 미세 원심 분리기 튜브를 액체 질소로 옮기고 튜브를 -80 °C로 유지하여 사용하기 전에 장기 보관하십시오.
4. 신장 샘플에서 총 RNA 추출
- 다음 품목을 준비하십시오: 1.5 mL 마이크로센트심심분리기 튜브, 2.0mL 마이크로센트심분리기 튜브, 100% 에탄올, 클로로폼, 실리콘 균질화, 얼음, 소용돌이 믹서, 바이오 폴리머 스핀 컬럼 2.0 mL 수집 튜브11,,12,멤브레인 고정 스핀 컬럼 2.0 mL 컬렉션 튜브12,,13,페놀 / 구니딘 기반 리시스 시약, 과니딘 과탄 을 함유 한 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제
- 실리콘 균질화제에 10 mg 신장 샘플을 넣습니다. 페놀/구아니딘 기반 용해 시약의 700 μL을 균질제에 넣습니다.
- 균질화를 준비한 다음, 균질화제의 봉제기를 신장 샘플에 대해 천천히 누르고 비틀어 샘플을 균질화합니다. 신장 샘플이 페놀/구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 용해될 때까지 누르기/비틀기 반복합니다.
- 시료를 균질화하기 위해 균질화된 용액(2.0mL 수집 튜브)을 생체 중합체 스핀 컬럼으로 이송한다.
- 실온(RT)에서 3분 동안 14,000 x g에서 균질화된 용액을 회전한 다음 침전된 용액을 사용하지 않는 1.5mL 미세 원심 분리튜브로 옮긴다.
- 튜브에 140μL의 클로로폼을 결합한 다음 튜브 캡을 단단히 닫습니다. lysate와 클로로폼을 혼합하려면 튜브를 15 번 반전시하십시오.
참고: 클로로폼은 후드 없이 사용할 수 있습니다. - 각 샘플을 RT에서 2-3분 동안 배양한 다음 각 샘플을 12,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 회전시합니다.
- 침전을 방해하지 않고, 새로운 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브로 상체(일반적으로 ~300 μL)를 전송한 다음 100% 에탄올의 부피(일반적으로 ~450 μL)를 1.5배 추가한다. 5 s에 대 한 혼합물을 소용돌이.
- 2.0mL 수집 튜브에서 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 시료의 700 μL을 적재합니다. 열 캡을 닫고 15s에 대해 15,000 x g로 열을 회전합니다. 수집 튜브에 침전 된 lysate를 버리십시오.
- 2.0mL 수집 튜브에서 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 700 μL의 세척 버퍼 1을 추가하여 샘플을 철저히 세척하십시오. 열 캡을 닫고 15s에 대해 15,000 x g로 열을 회전합니다. 수집 튜브에 침전 된 lysate를 버리십시오.
- 2.0mL 수집 튜브의 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 500 μL의 세척 버퍼 2를 적재하여 미량염을 제거합니다. 열 캡을 닫고 15s에 대해 15,000 x g로 열을 회전합니다. 수집 튜브에 침전 된 lysate를 버리십시오.
참고: 멤브레인 고정 스핀 컬럼은 RNA와 DNA를 분리할 수 있습니다. - 4.11 단계를 다시 수행합니다.
- 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 2.0 mL 수집 튜브에서 1분 동안 15,000 x g로 다시 회전합니다. 수집 튜브에 침전 된 lysate를 버리십시오.
- 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 수집 튜브로 전송합니다. 컬럼에 RNase 가 없는 물의 30 μL을 추가하여 총 RNA를 용해하십시오. 열 한도를 닫고 실온에서 5분 기다립니다. 그런 다음 1분 동안 15,000 x g에서 열을 회전합니다.
- 총 RNA를 포함하는 샘플의 총 량을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮는다. 각 튜브를 얼음에 넣고 분광광법에 의한 총 RNA의 농도를 측정합니다.
- 사용하기 전에 장기 저장을 위해 샘플이있는 튜브를 -80 °C에서 보관하십시오.
5. 총 RNA의 역 전사와 cDNA의 합성
참고: MIQE(양적 실시간 PCR 실험 의 출판을 위한 최소 정보) 지침은 더 나은 실험 관행을 장려하고 신뢰할 수 있고 명백한 결과를 얻는 데 도움이 되는가이드라인(19. 본 프로토콜에서, cDNA는 역전사, 폴리(A) 폴리머라제 및 올리고-dT 프라이머를 이용한 2단계 절차에서 정제된 총 RNA의 1.0 μg로부터 합성된다.
- 다음 준비: 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브, 캡이 있는 8웰 스트립 튜브, 각 8스트립 튜브의 캡, 증류수, 얼음, 역실제 키트(재료표참조)14,,15, 용융 상태의 열 사이클러 및 소용돌이 믹서.
- 열 사이클러를 시작합니다.
- 마스터 믹스 솔루션 준비: 역실사 믹스 2.0 μL(키트에 포함) 및 10배 핵산 믹스의 2.0 μL을 5배 의 5배 하이스펙 버퍼4.0 μL에 추가합니다(튜브당 총 8.0 μL 마스터 믹스를 얻습니다).
- 마스터 믹스 용액의 8.0 μL을 8웰 스트립 튜브의 각 튜브에 넣습니다.
- 총 RNA 밀도를 조정합니다. RNase 가 없는 물의 12 μL에서 신장 샘플로부터 총 RNA의 1.0 μg를 분리하기 위해, 4.15 단계에서 설명된 밀도 데이터를 사용하여 총 RNA를 증류수로 이송한다.
참고: DNA 오염이 있는 경우 오염된 DNA는 qRT-PCR에서 공동 증폭됩니다. - 각 튜브에 총 RNA의 12 μL 알리쿼트를 넣고 튜브의 캡을 닫습니다. 15 x튜브원심분리.
- 튜브를 열 사이클러에 넣고 37 °C에서 60 분 동안 샘플을 배양하십시오. 다음으로, 즉시 cDNA의 합성을 위해 95°C에서 5분 동안 샘플을 배양한다.
- 인큐베이션이 완료되면 cDNA를 새로운 1.5mL 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 증류수로 10회(1:10)를 희석시한다. 소용돌이와 원심분리기 튜브를 5초동안 분리합니다.
- 희석된 cDNA를 얼음에 일시적으로 저장하고 시료를 -80°C로 이동하여 사용하기 전에 장기 보관합니다.
6. miRNA의 qRT-PCR
참고 : 우리는 miRNA의 qRT-PCR을 수행하기 위해 인터칼레이터 방법을 사용했다. RNA를 위한 프라이머는 U6 소형 핵 2(RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, 및 miRNA-7219-5p를 사용되었다.
- 다음 준비: 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브, 소용돌이 믹서, qRT-PCR용 96웰 반응 플레이트, 96웰 반응 플레이트용 접착 필름, 접착 필름 어플리케이터, 96웰 원심분리기 로터, miRNA 특이프라이머, 실시간 PCR 기기, 그린 염료 기반 PCR 키트(재료의 표참조)14, 15개,프라이머 1,15개 보편형 PCR 용.
- 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브에 혼합한 후, 증류수 6.25 μL, 5μM miRNA 프라이머 의 1.25 μL, 2× PCR 마스터 믹스, 10x 유니버설 프라이머의 2.5 μL 등 다음과 같은 항목을 소용돌이시다.
- 5단계에서 설명된 대로 합성된 cDNA를 준비하고 녹입니다. 소용돌이와 원심분리기는 5s에 대한 cDNA를 분리합니다.
- 96웰 플레이트의 각 웰에 시약(단계 6.2에 설명된 대로 작성됨)의 22.5 μL 알리쿼트(단계 6.2에 설명됨)를 넣습니다.
- 플레이트의 각 웰에 cDNA의 2.5 μL 알리쿼트를 넣습니다.
- 접착 필름 어플리케이터를 사용하여 96웰 플레이트에 접착제 필름을 단단히 고정하십시오. 30s용 1,000x g의 96웰 원심분리기 로터로 플레이트를 원심분리하여 각 웰의 하단에 있는 반응을 해결합니다.
7. PCR 사이클링
- 실시간 PCR 시스템을 시작하고 6.6단계에서 설명한 대로 생성된 플레이트를 배치합니다. 실시간 PCR 시스템에서. 다음에 실험 속성을 설정합니다. 실험 이름을 식별합니다. 다음을 선택하십시오: 시스템의 실험 유형으로 "96-well(0.2 mL)", "비교 CT(ΔΔCT)"를 수량 방법으로, "SYBR 그린 시약"은 목표 시퀀스를 검출하기 위한 시약으로서, 그리고 시스템의 실행으로 "표준"을 선택한다.
- 샘플 및 표적 miRNA에 이름을 할당한 다음 각각의 양상에서 샘플 및 표적 miRNA에 이름을 할당합니다. 결과를 확인하기 위해 적절한 데이터를 얻으려면 샘플을 중복으로 할당해야 합니다. 참조 샘플과 내인성 제어를 선택하고 수동 참조로 사용할 염료에 대해 "없음"을 선택합니다. 시약의 교차 오염을 제거하기 위해 miRNA 발현에 대한 음의 역전사 및 비템플릿 제어를 설정해야 합니다.
- 반응 부피 설정이 "20 μL"이고 PCR 사이클링 조건이 15분 동안 95°C로 설정되고, 그 다음에는 94°C에서 40사이클의 데우라우가 15초이고, 55°C에서 30초, 연장이 30s에 70°C로 설정되어 있는지 확인한다.
- qRT-PCR 프로세스가 완료되면 시스템의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 qRT-PCR 데이터를 분석합니다. 소프트웨어 프로그램에서 자동으로 선택되는 임계값 선이 각 웰에 적합한지 확인합니다.
- 각 샘플에서 분석된 내인성 제어 및 표적 miRNA의 임계값(CT) 값을 확인합니다. CT 값은 증폭 곡선과 임계값 선의 교차점에 의해 결정됩니다. 본 연구에서는, RNU6-2를 표적 miRNA 발현 수준에 대한 내인성 대조군으로 사용했으며, ΔΔCT 방법을 사용하여 각 표적miRNA(20)의상대적 발현 수준을 결정하였다.
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Representative Results
UUO 마우스 모델은 20-25g의 8주 된 수컷 마우스에서21에 설명된 바와 같이 왼쪽 요관 결찰에 의해 만들어졌습니다. 우레는 4-0 실크 봉합사로 더블 리그에 완전히 막혀 있었다. 진통제 (멜록시캠 5 mg/kg, 피하 주사) 수술 전과 수술 후 2 일 동안 매일 투여되었습니다. 수술 후 8일 동안 신장을 채취하고, PBS로 헹구고, 해부하고, 추가 분석을 위해 액체 질소에 저장하였다. 샴 작동 마우스는 대조군역할을 합니다. 왼쪽 신장에 수성 신증이있는 경우 이중 결찰이 성공합니다. 이러한 UUO 모델을 사용하여 얻은 miRNA qRT-PCR 데이터를 기반으로, miRNA-3070-3p의 수준이 크게 증가하여 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 수준이 대조군(도1)에비해 UUO 마우스의 신장에서 상당히 감소하였다.
도 1: UUO 마우스의 신장에서 차분하게 발현된 miRNAs. miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p 발현의 qRT-PCR 분석은 샴 마우스(n=8) 및 UUO 마우스(n=8)에서 발현된다. 값은 표준 오류(오류 막대)± 의미입니다. T-테스트는 그룹 간의 상당한 차이점을 조사하는 데 사용되었습니다. p-값 & 0.05를 가진 T-테스트는 중요한 것으로 간주되었습니다. miRNA: microRNA, n.s.: 중요하지 않은 qRT-PCR: 정량 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, UUO: 일방적인 요관 방해. *p&0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
qRT-PCR을 사용하는 전술한 프로토콜은 표적 miRNAs의 발현 수준을 성공적으로 결정했습니다. 추출된 miRNAs의 평가는 의미 있는 qRT-PCR 데이터를 얻기 위하여 길들이기 위하여, qRT-PCR를 수행하기 전에 miRNAs의 질을 확인하기 위하여, 280 nm에서 그280 nm에 흡수의 비율을 분광광계로 검사되어야 합니다. 예상 길이및 용융 온도 또는 모노모달 용융 곡선의 단일 PCR 증폭이 qRT-PCR에 의해 얻을 수 없는 경우, 반응 플레이트의 각 웰에 DNA 오염 또는 프라이머 이크머가 있을 수 있다.
miRNAs의 발현 수준은 마이크로어레이, 북부 블로팅 및 ribonuclease 보호 분석 방법을 포함하는 qRT-PCR 이외의 여러 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나 qRT-PCR은 정확하고 민감하며, 북부 블로팅 및 리보누벨리스 보호어마어마(22)에비해 qRT-PCR에 더 작은 샘플 볼륨을 사용할 수 있는 간단하고 재현가능한 절차이다. 또한 마이크로어레이는 수만 개의 miRNA 의 발현을 동시에 측정할 수 있기 때문에 후보 miRNA 마커를 식별할 수 있습니다. 마이크로어레이 데이터는 qRT-PCR23에의해 얻어진 데이터와 전반적으로 높은 상관관계를 보였지만, 이질적인 연구에서 얻은 마이크로어레이 데이터를 비교하기 위한 최적의 방법론에 대한 합의는24에도달하지 못했다.
새 프로토콜에는 다음과 같은 제한 사항이 있습니다. 이 프로토콜의 유용성은 간과 폐와 같은 다른 장기에서 검증되지 않았습니다. 그리고 프로토콜은 다른 실험실 동물 (예 : 쥐, 개 및 돼지)에서 테스트되지 않았습니다. 몇몇 그룹은 이 프로토콜(qRT-PCR에 의한 miRNAs의,정제 및 검출을 위해)조직(12,14,,15)으로부터고품질 RNA의 정제를 가능하게 했다고 보고했다. 이 방법은 miRNA발현(12,,14)을검출하기 위한 높은 정확도와 감도를 갖는다. 본 보고서는 이 프로토콜이 마우스 신장에서 miRNA 발현을 성공적으로 검출하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 프로토콜은 이렇게 질병의 넓은 범위를 가진 마우스의 신장에 있는 miRNA 발현 단면도를 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 프로토콜의 단순성으로 인해 많은 샘플을 동시에 처리 할 수 있으며 프로토콜을 사용하면 신장의 다양한 병리학 적 조건에서 많은 miRNAs의 발현 분석에 기여할 수 있습니다.
프로토콜의 특정 측면을 인식하고 염두에 두어야 합니다. 첫째, 정수된 RNA는 실온에서 분해되는 것을 방지하기 위해 얼음 위에 보관해야 합니다. 신장 견본은 견본이 용해 시약에서 완전히 녹을 때까지 균질화되어야 합니다. 마우스 신장에는 용해 시약에 용해되지 않는 상당한 결합 조직이 포함되어 있기 때문에, 컬럼 분쇄기는 추가 균질화를 위해 필요하다. 둘째, 적절한 내인성 대조군 miRNA(샘플 중발현이 안정됨)는 이 프로토콜하에서 다양한 물질의 침입이 내인성 대조군 miRNA의 발현 수준을 변화시킬 수 있기 때문에 qRT-PCR 실험 설정 전반에 걸쳐 검증되어야 하며, 아마도 결과를 손상시킬 수 있다.
결론적으로, 우리는 UUO를 가진 마우스 신장에 있는 microRNA 발현의 검출, 정제 및 평가를 위한 qRT-PCR 프로토콜의 세부 사항을 제시했습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 원고의 초안을 편집한 에단츠 그룹(https://en-author-services.edanzgroup.com/)의 미셸 구디 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
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