Summary
Мы описываем метод оценки экспрессии микроРНК в почках мышей с односторонней мочеизъемной обструкцией (UUO) по количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции. Этот протокол подходит для изучения профилей экспрессии микроРНК почек у мышей с UUO и в контексте других патологических состояний.
Abstract
МикроРНК (миРНК) являются одиночными мель, некодирующие молекулы РНК, которые обычно регулируют экспрессию генов на посттранскриптном уровне путем связывания с частично взаимодополняющими целевыми объектами в 3' непереведенной области (UTR) РНК-мессенджера (мРНК), что снижает перевод и стабильность мРНК. Профили экспрессии миРНК в различных органах и тканях мышей были исследованы, но стандартные методы для очистки и количественной оценки миРНК в почках мыши не были доступны. Мы создали эффективный и надежный метод извлечения и оценки экспрессии миРНК в почках мыши с почечным интерстициальным фиброзом путем количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT-PCR). Протокол требовал пяти этапов: (1) создание фиктивных и односторонних мочеточников (UUO) мышей; (2) извлечение образцов почек у мышей UUO; (3) извлечение общей РНК, которая включает в себя миРНК, из образцов почек; (4) дополнительный синтез ДНК (кДНК) с обратной транскрипцией из миРНК; и (5) qRT-PCR с использованием cDNA. Используя этот протокол, мы успешно подтвердили, что по сравнению с контролем, экспрессия miRNA-3070-3p была значительно увеличена и у миРНК-7218-5p и miRNA-7219-5p были значительно снижены в почках мыши модели почечного интерстициального фиброза. Этот протокол может быть использован для определения экспрессии миРНК в почках мышей с UUO.
Introduction
МикроРНК (миРНК) - короткие, некодирующие РНК, которые вызывают деградацию и транскрипционные ингибирование РНК-мессенджера (мРНК)1 - регулируют выражение различных РНК, которые играют решающую роль как в физиологии, так и в заболеваниях (например, воспаление, фиброз, нарушения обмена веществ и рак). Некоторые из miRNAs поэтому может быть кандидатом новых биомаркеров и терапевтическихцелей для различных заболеваний 2,,3,,4,,5. Хотя профили экспрессии миРНК в органах и тканях мыши, включая мозг, сердце, легкие,печень и почки, были описаны 6,,7,,8,,9,,10,не было никаких стандартных методов для извлечения и оценки миРНК в почках мыши с почечным интерстициальным фиброзом.
Мы разработали протокол для надежной очистки и обнаружения выражений миРНК в почках мышей с почечным интерстициальным фиброзом. Протокол включает в себя пять основных шагов, следующим образом. (1) 8-недельные мыши C57BL/6 разделены на группы мышей, которые проходят фиктивную операцию (контроль) и мышей, которые подвергаются операции, обеспечивающей одностороннее мочеточник (UUO), которая связана с почечным интерстициальным фиброзом. (2) Образцы почек извлекаются из фиктивных и UUO мышей, гомогенизированы отдельно в кремниевом гомогенизаторе, а затем передаются в биополимерную систему измельчения на микроцентрифуге спинаколонки 11,12. (3) Общая РНК, содержащая миРНК извлекается из образцов почек кремнеземной мембраны на основеспина колонке 12,13. (4) Используя эту извлеченную общую РНК, комплементарная ДНК (cDNA) синтезируется из общей РНК с использованием обратной транскриптазы, поли(A) полимеразы и олиго-ДТгрунтовки 14,15. (5) Выражения миРНК оцениваются по количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) с использованием интеркалирующегокрасителя 14,,15.
Этот протокол основан на исследованиях, которые получили значимые извлечения и оценки miRNAs вразличных тканях 11,12,13,14,15,и биополимер-измельчения системы, используемой в протоколе было показано, чтобы очистить высококачественные, общая РНК из тканей в 2006году 12. Кроме того, предыдущие исследования подтвердили точность и чувствительность аспектов протокола (т.е. синтез кДНК с обратной транскриптазой, поли(А) полимеразой и олиго-ДТ праймерами из извлеченной общей РНК) для определения экспрессии миРНК по qRT-PCR с интеркалирующимкрасителем 14,,15. Поскольку новый протокол имеет преимущества простоты, экономии времени и уменьшения технических ошибок, протокол может быть использован в исследованиях, которые требуют точной и чувствительной идентификации профиля miRNA в почках мыши. Кроме того, протокол может быть применен к исследованиям многих патологических состояний.
Затем мы описываем определение профилей экспрессии miRNA у мышей с UUO, который связан с почечным интерстициальным фиброзом. У людей, почечный интерстициальный фиброз является общей и важной особенностью как хронических заболеваний почек и почечной болезни конечной стадии, независимо от ихэтиологии 16,17. Этот почечный интерстициальный фиброз связан с прогрессированием почечной недостаточности, и характеризуется повышенными проявлениями внеклеточных матричных компонентов в интерстициальных пространствах (например, коллагена, фибронектина и α-гладкого мышечного актина)17,,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы для животных были одобрены Комитетом по этике животных Медицинского университета Джити и были выполнены в соответствии с руководящими принципами использования и ухода за экспериментальными животными из руководства Медицинского университета Джичи для лабораторных животных.
1. Фиктивная операция
- Подготовьте следующие элементы: изофлюран, пробковый лист, крем-депилятор, лабораторные салфетки, чашка Петри с фосфат-буферным солевым раствором (PBS), 4-0 нейлон, пинцет, хирургические ножницы, ватные тампоны и 8-недельные мыши C57BL/6.
- Обезболить мышь с 1,5% изофлюран и поддерживать на 1,5%. Затем нанесите крем-депиляатор на живот мыши. Через несколько минут, протрите крем для депиляатора с PBS пропитанной лабораторной салфетки.
- Введать 70% этанола в живот мыши, а затем поместить мышь на листе пробки в положении на спине.
- Используя хирургические ножницы и пинцет, сделать разрез в коже живота и сократить мышцы и брюшной мембраны от мочевого пузыря до левого нижнего края ребер.
- Смочите два ватных тампона с PBS, а затем осторожно потяните кишечник в сторону. Поместите увлажненые тампоны для идентификации левой почки и мочеточника.
- Закройте перитонеальную мембрану, а затем закройте разрез 4-0 нейлоном.
2. Хирургия UUO
- Приготовьте следующие предметы: изофлюран, пробковый лист, крем-депилятор, лабораторные салфетки, чашка Петри с PBS, шелк 4-0, 4-0 нейлон, шприц 2,5 мл, ватные тампоны, пинцет, хирургические ножницы и 8-недельные мыши C57BL/6.
- Обезболить мышь с 1,5% изофлюран и поддерживать на 1,5%. Затем нанесите крем-депиляатор на брюшную полость мыши. Через несколько минут, протрите крем для депиляатора с PBS пропитанной лабораторной салфетки.
- Введать 70% этанола в живот мыши мыши мыши, а затем поместить мышь в положение на спине на листе пробки.
- Используя хирургические ножницы и пинцет, сделать разрез в коже живота и сократить мышцы и брюшной мембраны от мочевого пузыря до левого нижнего края ребер.
- Поместите шприц 2,5 мл под мышь. Возьмите два ватных тампона и смочите их PBS. Потяните кишечник тщательно в сторону с пинцетом, и место увлажненые тампоны надлежащим образом определить левый мочеточник. Используя пинцет, поднимите левую почку.
- Используйте 4-0 шелка, чтобы ligate левый мочеточник в двух местах около 1 см друг от друга. Вырезать мочеточник в центральной точке двух лиг, а затем использовать 4-0 нейлоновых швов, чтобы закрыть брюшной мембраны и разрез.
3. Сбор образцов почек
- Приготовьте следующие: 1,5 мл микроцентрифуг трубки, изофлюран, пробковый лист, 70% этанола, чашка Петри с PBS, пинцетом и хирургическими ножницами.
- Обезболить мышь с 1,5% изофлюран и поддерживать на 1,5%. Введать 70% этанола в живот и положить мышь на листе пробки в положении на спине.
- Используя хирургические ножницы и пинцет, сделать разрез в коже живота и сократить мышцы и брюшной мембраны от мочевого пузыря до левого нижнего края ребер.
- Поднимите брюзговую мембрану пинцетом. С помощью хирургических ножниц сделайте боковой разрез на верхнем краю брюшной мембраны и продолжайте разрез вдоль самого низкого края ребер.
- Далее, определить левую почку, рефлюкс его с PBS, пока почка становится желто-белый, чтобы вымыть кровь из сосудов, и удалить почку, разрезая левую почечную артерию и вену хирургическими ножницами. Поместите почку в чашку Петри и тщательно вымойте ее с помощью PBS.
- Разрежьте почку на 10 мг с помощью хирургических ножниц и пинцета (10 мг является подходящим размером для следующего шага). Положите каждый кусок почки в свой собственный 1,5 мл микроцентрифуг трубки и закрыть крышку трубки.
- Перенесите каждую трубку микроцентрифуга в жидкий азот и держите трубки на уровне 80 градусов по Цельсию для длительного хранения перед использованием.
4. Извлечение общей РНК из образцов почек
- Подготовка следующих элементов: 1,5 мл микроцентрифуг трубки, 2,0 мл микроцентрифуг трубки, 100% этанола, хлороформ, силиконовый гомогенизатор, лед, вихревой смеситель, биополимер спина колонны в 2,0 мл сборатруб 11,12, мембранно-якорный спин колонки в 2,0 мл сборатруб 12,13, фенол / гуанидин основе лиза реагент, мыть буфер, содержащий гуанидин и этанол (мыть буфер 1), мыть буфер, содержащий этанол (мыть буфер 2), и RNase-бесплатной воды.
- Положите 10 мг образца почек в кремниевый гомогенизатор. Добавьте 700 мкл реагента на основе фенола/гуанидина в гомогенизатор.
- Подготовка гомогенизатора, а затем медленно нажмите / твист пестик гомогенизатора против образца почки, чтобы гомогенизировать образец. Повторите нажатие/скручивание до тех пор, пока образец почки не будет полностью растворен в реагенте лиза на основе фенола/гуанидина.
- Для дальнейшей гомогенизации образца перенесите гомогенизированный лизат (в трубке сбора 2,0 мл) в колонку биополимерного спина.
- Спин гомогенизированный лизат при 14000 х г в течение 3 мин при комнатной температуре (RT), а затем передать осажденный лизат в неиспользованные 1,5 мл микроцентрифуг трубки.
- Комбинат лизоли в трубке с 140 йл хлороформа, а затем закрыть крышку трубки плотно. Чтобы смешать лизат и хлороформ, инвертировать трубку 15 раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: хлороформ можно использовать без капюшона. - Инкубировать каждый образец в течение 2-3 минут на RT, а затем спина каждого образца на 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию.
- Не нарушая осадок, перенесите супернатант (который, как правило, составляет 300 л)в новую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл, а затем добавьте 1,5x ее объем (обычно 450 л) 100% этанола. Vortex смесь для 5 с.
- Загрузите 700 МКЛ образца на мембранную колонку спина в трубке сбора 2,0 мл. Закройте крышку столбца и вращай столбец на 15 000 x g для 15 s. Выбрось осажденный лисат в трубку для сбора.
- Тщательно вымойте образец, добавив 700 йл буфера стирки 1 к мембранно-якорной колонке спина в трубке сбора 2,0 мл. Закройте крышку столбца и вращай столбец на 15 000 x g для 15 s. Выбрось осажденный лисат в трубку для сбора.
- Загрузите 500 мкл буфера стирки 2 на мембранно-якорную колонку спина в трубке сбора 2,0 мл для удаления солей. Закройте крышку столбца и вращай столбец на 15 000 x g для 15 s. Выбрось осажденный лисат в трубку для сбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: мембрана якорь спина колонка может отделить РНК и ДНК. - Выполните шаг 4.11 снова.
- Спин мембраны якорь спина колонки в 2,0 мл сбора трубки снова на 15000 х г в течение 1 мин. Выбрось осажденный лисат в трубку для сбора.
- Перенесите мембранную колонку спина на новую трубку для сбора 1,5 мл. Растворите общую РНК, добавив в колонку 30 МКЛ воды без RNase. Закройте крышку столбца и подождите 5 минут при комнатной температуре. Затем вращай столбец на 15 000 х г в течение 1 мин.
- Перенесите общее количество образца, содержащего общую РНК, в новую трубку микроцентрифуга. Положите каждую из трубок на лед, и измерить концентрацию общей РНК по спектрофотометрии.
- Перед использованием держите трубки с образцами на уровне 80 градусов по Цельсию для длительного хранения.
5. Синтез кДНК с обратной транскрипцией общей РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Руководящие принципы МИЗЭ (минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в режиме реального времени) были изданы для поощрения более передовой экспериментальной практики и оказания помощи в получении надежных инедвусмысленных результатов 19. В этом протоколе, cDNA синтезируется из 1,0 мкг очищенной общей РНК в двухступной процедуре с использованием обратной транскриптазы, поли (A) полимеразы и олиго-ДТ грунтовка.
- Подготовьте следующее: 1,5 мл микроцентрифуг трубки, восемь хорошо полосы трубки с колпачками, крышка каждой Table of Materialsвосьмиполосной трубки, дистиллированной воды, льда, обратного комплекта транскриптазы(см. Таблица материалов ) 14,15 в расплавленном состоянии, тепловой циклер, и вихревой смеситель.
- Запустите тепловой циклер.
- Подготовье мастер-микст-решение: добавьте 2,0 мл смеси обратной транскриптазы (включенной в комплект) и 2,0 МЛ 10-х смеси нуклеиновой кислоты в 4,0 мл 5-х высокотехнологичного буфера (чтобы получить в общей сложности 8,0 мл мастер-микса на трубку).
- Положите 8,0 МКЛ мастер раствор смеси в каждой трубке из восьми-хорошо полоса трубки.
- Отрегулируйте общую плотность РНК. Чтобы изолировать 1,0 мкг общей РНК из образцов почек в 12 МКЛ воды без RNase, перенесите соответствующее количество общей РНК в дистиллированную воду, используя данные плотности, измеренные как описано в шаге 4.15.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если какое-либо загрязнение ДНК присутствует, загрязненная ДНК будет совместно усилена в qRT-PCR. - Поместите алицит общей РНК в 12 МКЛ в каждую трубку и закройте крышку трубки. Центрифуга трубки для 15 x.
- Положите трубку в тепловой циклер и инкубировать образец в течение 60 мин при 37 градусов по Цельсию. Затем немедленно инкубировать образец в течение 5 мин при 95 градусов по Цельсию для синтеза кДНК.
- Когда инкубация завершена, перенесите cDNA в новую микроцентрифугную трубку 1,5 мл и разбавьте кДНА десять раз (1:10) дистиллированной водой. Вихрь и центрифуга трубки на 5 с.
- Временно храните разбавленную кДНК на льду и переместив образцы на 80 градусов по Цельсию для длительного хранения перед использованием.
6. qRT-PCR миРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали метод интеркалятора для выполнения qRT-PCR miRNA. Праймеры для РНК U6 малых ядерных 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, и miRNA-7219-5p были использованы.
- Подготовьте следующие: 1,5 мл микроцентрифуг трубки, вихревой смеситель, 96-хорошо реакционной пластины для qRT-PCR, клейкой пленкой для 96-хорошо реакционной пластины, клейкой пленки аппликатор, 96-ну центрифуга ротор, miRNA-специфические грунтовки, в режиме реального времени ПЦР инструмент, и зеленый краситель на основе ПЦР комплект(см.Таблица материалов) 14 ,15, содержащий 2x PCR мастер смеси и 10x универсальный грунтовка.,
- После смешивания их в 1,5 мл микроцентрифуг труб, вихрь следующие элементы: 6,25 МКЛ дистиллированной воды, 1,25 йл из каждых 5 МКМ миРНК грунтовка растворяется в нуклеазной воды, 12,5 мл 2× PCR мастер смеси, и 2,5 мл 10x универсальный грунт.
- Подготовь кДНА синтезируется, как описано в шаге 5, и растопить его. Вихрь и центрифуга кДНА на 5 с.
- Поместите алицит реагента (созданный, как описано в шаге 6.2) в каждый колодец пластины из 96 колодец.
- Положите 2,5 йл алицита cDNA в каждом колодец пластины.
- Используя клеевую пленку аппликатора, закрейте клейую пленку плотно на пластине 96-колодец. Центрифуга пластины с 96-ну центрифуги ротора на 1000 х г на 30 с, чтобы урегулировать реакции в нижней части каждой хорошо.
7. ПЦР велоспорт
- Запустите систему ПЦР в режиме реального времени и поместите пластину, созданную, как описано в шаге 6.6. в системе ПЦР в режиме реального времени. Установите свойства эксперимента дальше; определить название эксперимента. Выберите следующее: "96-хорошо (0,2 мл)" в качестве типа эксперимента системы, "Сравнительный КТ (КТ)" в качестве метода количественной оценки, "SYBR Зеленые реагенты" в качестве реагентов для обнаружения целевой последовательности, и "стандарт" в качестве запуска системы.
- Назначьте имя образцу и целевой миРНК, а затем назначьте имя образцу и нацелите миРНК в каждой хорошо. Образцы должны быть назначены дубликатом для получения соответствующих данных для подтверждения результатов. Выберите эталонный образец и эндогенный контроль и выберите "нет" для того, чтобы краситель использовался в качестве пассивной ссылки. Убедитесь в том, чтобы установить отрицательный обратный транскриптазы и не-шаблон управления для выражения miRNA для того, чтобы устранить перекрестное загрязнение реагентов.
- Убедитесь, что настройка громкости реакции составляет "20 мкл", а условия езды на велосипеде ПЦР устанавливаются на уровне 95 градусов по Цельсию в течение 15 минут, а затем 40 циклов денатурации при 94 градусах цельсия на 15 с, аннеалирование при 55 градусов по Цельсию для 30 с, и расширение при 70 градусов по Цельсию для 30 с.
- После завершения процесса qRT-PCR используйте программу системы для анализа данных qRT-PCR. Убедитесь, что пороговая линия, которая автоматически выбирается программной программой, подходит для каждой колодец.
- Проверьте значение порогового цикла (КТ) эндогенного контроля и целевой миРНК, анализируемой в каждом образце. Значение КТ определяется пересечением кривой усиления и пороговой линии. В настоящем исследовании мы использовали RNU6-2 в качестве эндогенного контроля для целевого уровня экспрессии миРНК, и мы использовали метод КТ для определения относительного уровня экспрессии каждой цели miRNA20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель мыши UUO была создана левой мочегонной перевязки,как описано 21 в 8-недельный мышей мужского пола весом 20-25 г. Уретры были полностью затруднены двойной перевязкой с 4-0 шелковыми швами. Обезболивающее (мелоксикам 5 мг/кг, подкожная инъекция) вводили перед операцией, а также ежедневно в течение 2 дней после операции. В течение 8 дней после операции почки собирали, промыли ПБС, вскрыли и хранили в жидком азоте для дальнейшего анализа. Шам-управляемые мыши служили в качестве элементов управления. Двойная перевязка успешна, если левая почка имеет гидронефроз. На основе данных miRNA qRT-PCR, полученных с помощью этой модели UUO, уровень miRNA-3070-3p был значительно увеличен и уровни miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p были значительно снижены в почках мышей UUO по сравнению сконтролем (рисунок 1).
Рисунок 1: Дифференциально выраженные миРНК в почках мышей UUO. qRT-PCR анализ miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, и miRNA-7219-5p выражение в фиктивных мышей (n'8) и UUO мышей (n'8). Значения являются средними ± стандартной ошибки (бары ошибок). T-тесты использовались для исследования значительных различий между группами. Т-тесты с p-значением lt;0.05 были признаны значительными. miRNA: микроРНК, n.s.: не значительный, qRT-PCR: количественный в режиме реального времени обратная транскрипция полимеразной цепной реакции, UUO: односторонняя мочеизуханная обструкция. 0,05 евро. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вышеупомянутый протокол с qRT-PCR успешно определил уровни выражения целевых миРНК. Оценка извлеченных миРНК имеет важное значение при поиске значимых данных qRT-PCR, и для того, чтобы подтвердить качество миРНК перед выполнением qRT-PCR, соотношение поглощения на 260 нм к 280 нм должно быть проверено с помощью спектрофотометра. Если одно ПЦР-усиление ожидаемой длины и температуры плавления или мономодальная кривая плавления не могут быть получены с помощью qRT-PCR, в каждой пластине реакции может быть загрязнение ДНК или грунтовка.
Уровни экспрессии миРНК могут быть оценены несколькими методами, помимо qRT-PCR, включая микроаррей, северную блоттинг и методы анализа защиты рибонуклеазы. Тем не менее, qRT-PCR является простой, высоко воспроизводимой процедурой, которая является одновременно точной и чувствительной, и меньшие объемы выборки могут быть использованы для qRT-PCR по сравнению с северной blotting и рибонуклизы защитыанализы 22. Кроме того, поскольку микроаррей позволяют одновременно измерять экспрессию десятков тысяч миРНК, они могут идентифицировать маркеры кандидатов миРНК. Данные Microarray показали общую высокую корреляцию с данными, полученными qRT-PCR23, но консенсус по оптимальной методологии для сравнения данных микроаррей, полученных в разрозненных исследованиях, не былдостигнут 24.
Новый протокол имеет следующие ограничения. Полезность этого протокола не была подтверждена в других органах, таких как печень и легкие; и протокол не был протестирован на других лабораторных животных (например, крыс, собак и свиней). Несколько групп сообщили, что этот протокол (для очистки и обнаружения миРНК с помощью qRT-PCR) позволил очищать высококачественную РНКиз тканей 12,,14,,15. Метод имеет высокую точность и чувствительность для обнаружения экспрессииmiRNA 12,,14. Настоящий отчет показывает, что этот протокол может быть использован для успешного обнаружения экспрессии miRNA в почках мыши. Таким образом, протокол может быть использован для определения профилей экспрессии миРНК в почках мышей с широким спектром состояний заболевания. Из-за простоты протокола, многие образцы могут быть обработаны одновременно, и с помощью протокола может поэтому способствовать анализу экспрессии многих miRNAs в различных патологических условиях почек.
Есть определенные аспекты протокола, чтобы быть в курсе и иметь в виду. Во-первых, очищенные РНК должны храниться на льду, чтобы предотвратить деградацию при комнатной температуре. Образцы почек должны быть гомогенизированы до тех пор, пока образцы полностью не расплавятся в реагенте лиза. Так как почки мыши содержат существенную соединительной ткани, которая не растворяется в реагенте лиза, шредер столбца необходим для дальнейшей гомогенизации. Во-вторых, надлежащее эндогенное управление miRNA (выражение которого стабильно среди образцов) должно быть проверено на протяжении всей экспериментальной установки qRT-PCR, поскольку вторжение различных веществ в соответствии с этим протоколом может изменить уровень экспрессии эндогенной контрольной миРНК, возможно, ставя под угрозу результаты.
В заключение мы представили детали протокола qRT-PCR для обнаружения, очистки и оценки выражений микроРНК в почках мыши с UUO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Мишель Гуди, доктора философии, из Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) за редактирование проекта этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L.
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
