Summary
Vi beskriver en metode for evaluering av microRNA-uttrykket i nyrene til mus med ensidig ureteral obstruksjon (UUO) ved kvantitativ omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjon. Denne protokollen er egnet for å studere nyremikroRNA uttrykkprofiler hos mus med UUO og i sammenheng med andre patologiske forhold.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er enkelt strandet, ikke-koding RNA molekyler som vanligvis regulerer genuttrykk på post-transkripsjonsnivå ved å binde til delvis komplementære målsteder i 3 'uoversettet region (UTR) av messenger RNA (mRNA), noe som reduserer mRNA oversettelse og stabilitet. MiRNA-uttrykksprofilene i ulike organer og vev av mus har blitt undersøkt, men standardmetoder for rensing og kvantifisering av miRNA i musenyre har ikke vært tilgjengelige. Vi har etablert en effektiv og pålitelig metode for å trekke ut og evaluere miRNA-uttrykk i musenyre med nyreinterstitiell fibrose ved kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR). Protokollen krevde fem trinn: (1) opprettelse av sham og ensidige ureterale obstruksjon (UUO) mus; (2) ekstraksjon av nyreprøver fra UUO-musene; (3) ekstraksjon av total RNA, som inkluderer miRNA, fra nyreprøvene; (4) komplementær DNA (cDNA) syntese med omvendt transkripsjon fra miRNA; og (5) qRT-PCR ved hjelp av cDNA. Ved hjelp av denne protokollen, vi vellykket bekreftet at sammenlignet med kontrollene, uttrykket av miRNA-3070-3p ble betydelig økt og de av miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p ble betydelig redusert i nyrene av en musemodell av nyre interstitiell fibrose. Denne protokollen kan brukes til å bestemme miRNA-uttrykket i nyrene til mus med UUO.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) - de korte, ikke-koding RNA som forårsaker nedbrytning og transkripsjonshemming av messenger RNA (mRNA)1 - har vist seg å regulere uttrykket av ulike mRNAs som har avgjørende roller i både fysiologi og sykdom (f.eks betennelse, fibrose, metabolske forstyrrelser og kreft). Noen av miRNAs kan derfor være kandidat nye biomarkører og terapeutiske mål for en rekke sykdommer2,3,4,5. Selv om miRNA uttrykk profiler i museorganer og vev inkludert hjerne, hjerte, lunge, lever, og nyre har blitt beskrevet6,7,8,9,10, det har ikke vært noen standard metoder for utvinning og evaluering av miRNAs i mus nyre med nyre interstitiell fibrose.
Vi har utformet en protokoll for pålitelig å rense og oppdage uttrykkene til miRNAer i nyrene til mus med nyre interstitiell fibrose. Protokollen innebærer fem hovedtrinn, som følger. (1) 8 uker gamle C57BL/6 hannmus er delt inn i grupper av mus som gjennomgår en sham-operasjon (kontroller) og mus som blir utsatt for en operasjon som gir ensidig ureteral obstruksjon (UUO), som er knyttet til nyre interstitiell fibrose. (2) Nyreprøver ekstraheres fra sham og UUO mus, homogenisert separat i en silisium homogenisator, og deretter overført til en biopolymer-shredding system på en microcentrifuge spinnkolonne 11,12. (3) Den totale RNA som inneholder miRNA ekstraheres fra nyreprøvene av en silikamembranbasert spinnkolonne12,,13. (4) Ved hjelp av denne ekstraherte totale RNA, komplementære DNA (cDNA) syntetiseres fra den totale RNA med bruk av omvendt transkripsjon, poly (A) polymerase, og oligo-dT primer14,15. (5) Uttrykkene for miRNA-er evalueres ved kvantitativ reverstranskripsjonpolymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) ved hjelp av et intercalatingfargestoff 14,15.
Denne protokollen er basert på undersøkelser som fikk meningsfulle utvinninger og evalueringer av miRNAs i en rekke vev11,12,13,14,15,og biopolymer-shredding systemet som brukes i protokollen ble vist å rense høy kvalitet, totalt RNA fra vev i 200612. I tillegg har tidligere studier bekreftet nøyaktigheten og følsomheten til aspekter av protokollen (det vil si cDNA-syntesen med omvendt transkripsjonase, poly(A) polymerase og oligo-dT primere fra ekstrahert total RNA) for bestemmelse av miRNA-uttrykk ved qRT-PCR med et intercalatingfargestoff 14,15. Siden den nye protokollen har fordelene med enkelhet, tidsbesparende og reduksjon av tekniske feil, kan protokollen brukes i forskning som krever nøyaktig og sensitiv identifikasjon av miRNA-profilen i musenyre. Videre kan protokollen brukes på undersøkelser av mange patologiske forhold.
Vi beskriver deretter fastsettelsen av miRNA-uttrykksprofilene hos mus med UUO, som er knyttet til nyreinterstitiell fibrose. Hos mennesker er nyre interstitiell fibrose et vanlig og viktig trekk ved både kronisk nyresykdom og terminal nyresykdom, uavhengig av deres etiologi16,17. Denne nyre interstitielle fibrose er forbundet med utviklingen av nyresvikt, og det er preget av økte uttrykk for ekstracellulære matrisekomponenter i interstitielle rom (f.eks kollagen, fibronectin og α-glatt muskel actin)17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyre eksperimentelle protokoller ble godkjent av Animal Ethics Committee of Jichi Medical University og ble utført i samsvar med bruk og omsorg for eksperimentelle dyr retningslinjer fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Sham kirurgi
- Forbered følgende elementer: isofluran, korkark, hårfjerningskrem, laboratorieservietter, petriskål med fosfatbufret saltvann (PBS), 4-0 nylon, pinsett, kirurgisk saks, bomullspinner og 8 uker gamle C57BL/6 hannmus.
- Bedøve en mus med 1,5% isofluran og opprettholde på 1,5%. Deretter påfør hårfjerningskrem på musens mage. Etter noen minutter tørker du av hårfjerningskremen med en PBS-gjennomvåt laboratorieserviett.
- Injiser 70% etanol i musens mage og legg deretter musen på korkarket i liggende stilling.
- Ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett, gjør et snitt i huden på magen og kutt muskel- og bukhinnen fra blæren til venstre nedre kant av ribbeina.
- Fukt to bomullspinner med PBS og trekk deretter tarmene forsiktig til siden. Plasser de fuktede vattpinnene for å identifisere venstre nyre og uriner.
- Lukk bukhinnen og lukk deretter snittet med 4-0 nylon.
2. UUO-operasjonen
- Forbered følgende elementer: isofluran, korkark, hårfjerningskrem, laboratorieservietter, petriskål med PBS, 4-0 silke, 4-0 nylon, en 2,5 ml sprøyte, bomullspinner, pinsett, kirurgisk saks og 8 uker gamle C57BL/6 hannmus.
- Bedøve en mus med 1,5% isofluran og opprettholde på 1,5%. Påfør deretter hårfjerningskrem på musens mage. Etter noen minutter tørker du av hårfjerningskremen med en PBS-gjennomvåt laboratorieserviett.
- Injiser 70% etanol i musens magemus og plasser deretter musen i liggende stilling på korkarket.
- Ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett, gjør et snitt i huden på magen og kutt muskel- og bukhinnen fra blæren til venstre nedre kant av ribbeina.
- Plasser sprøyten på 2,5 ml under musen. Ta to bomullspinner og fukt dem med PBS. Trekk tarmene forsiktig til siden med pinsettene, og plasser de fuktede vattpinnene riktig for å identifisere venstre uriner. Bruk pinsettene til å løfte venstre nyre.
- Bruk 4-0 silke til å ligate venstre ureter på to steder ca. 1 cm fra hverandre. Klipp urineren i midten av de to ligasjonene, og bruk deretter 4-0 nylonsuturer for å lukke bukhinnen og snittet.
3. Innsamling av nyreprøver
- Forbered følgende: 1,5 ml mikrocentrifuge rør, isofluran, kork ark, 70% etanol, Petri skål med PBS, pinsett, og kirurgisk saks.
- Bedøve en mus med 1,5% isofluran og opprettholde på 1,5%. Injiser 70% etanol i magen og legg musen på korkarket i liggende stilling.
- Ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett, gjør et snitt i huden på magen og kutt muskel- og bukhinnen fra blæren til venstre nedre kant av ribbeina.
- Løft opp bukhinnen med pinsettene. Med kirurgisk saks, gjør et sidelengs snitt på den øvre kanten av bukhinnen, og fortsett snittet langs den laveste kanten av ribbeina.
- Deretter identifiserer du venstre nyre, reflukser den med PBS til nyrene blir gulhvite for å vaske ut blod fra fartøy, og fjern nyrene ved å kutte venstre nyrearterie og vene med kirurgisk saks. Legg nyrene i petriskålen og vask den forsiktig med PBS.
- Skjær nyrene i 10 mg prøver med kirurgisk saks og pinsett (10 mg er en passende størrelse for neste trinn). Sett hvert stykke nyre i sitt eget 1,5 ml mikrocentrifugerør og lukk rørets hette.
- Overfør hvert mikrocentrifugerør til flytende nitrogen, og oppbevar rørene ved −80 °C for langtidslagring før bruk.
4. Ekstraksjon av total RNA fra nyreprøvene
- Forbered følgende elementer: 1,5 ml mikrocentrifuge rør, 2,0 ml mikrocentrifuge rør, 100% etanol, kloroform, silisium homogenisator, is, en vortex mikser, biopolymerspinsøyler i 2,0 ml oppsamlingsrør11,,12,membranforankret spin columns i 2,0 ml oppsamlingsrør12,,13,fenol/guanidinbasert lysisreagens, vaskebuffer som inneholder guanidin og etanol (vaskebuffer 1), vaskebuffer som inneholder etanol (vaskebuffer 2) og RNase-fritt vann.
- Sett en 10 mg nyreprøve i silisiumhomogenisatoren. Tilsett 700 μL av fenol/guanidinbasert lysisreagens i homogenisatoren.
- Forbered homogenisatoren og trykk deretter langsomt på / vri homogenisatorens pestle mot nyreprøven for å homogenisere prøven. Gjenta trykkingen/vridningen til nyreprøven er fullstendig oppløst i fenol-/guanidinbasert lysisreagens.
- For ytterligere å homogenisere prøven, overfør homogenisert lysate (i et 2,0 ml oppsamlingsrør) til biopolymerspinsøylen.
- Spinn det homogeniserte lysatet på 14 000 x g i 3 min ved romtemperatur (RT), og overfør deretter det utfelte lysatet til et ubrukt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Kombiner lysatet i røret med 140 μL kloroform og lukk deretter rørhetten tett. For å blande lysate og kloroform, inverter røret 15 ganger.
MERK: Kloroformen kan brukes uten hette. - Inkuber hver prøve i 2–3 min ved RT, og spinn deretter hver prøve ved 12 000 x g i 15 min ved 4 °C.
- Uten å forstyrre bunnspranget, overfør supernatanten (som vanligvis er ~ 300 μL) til et nytt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og legg deretter til 1,5x volumet (vanligvis ~ 450 μL) på 100% etanol. Vortex blandingen i 5 s.
- Legg 700 μL av prøven på en membran-forankret spin kolonne i en 2,0 ml oppsamlingsrør. Lukk kolonnehetten og spinn kolonnen med 15 000 x g i 15 s. Kast det utfelte lysatet i oppsamlingsrøret.
- Vask prøven grundig ved å tilsette 700 μL vaskebuffer 1 i den membranankrede spinkolonnen i et 2,0 ml oppsamlingsrør. Lukk kolonnehetten, og spinn kolonnen med 15 000 x g i 15 s. Kast det utfelte lysatet i oppsamlingsrøret.
- Legg 500 μL vaskebuffer 2 på den membranankrede spinnkolonnen i et 2,0 ml oppsamlingsrør for å fjerne sporingssalter. Lukk kolonnehetten, og spinn kolonnen med 15 000 x g i 15 s. Kast det utfelte lysatet i oppsamlingsrøret.
MERK: En membran-forankret spin-kolonne kan skille RNA og DNA. - Utfør trinn 4.11 på nytt.
- Spinn den membran-forankrede spinkolonnen i et 2,0 ml oppsamlingsrør igjen ved 15 000 x g i 1 min. Kast det utfelte lysatet i oppsamlingsrøret.
- Overfør den membranbaserte spin-kolonnen til et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør. Oppløs totalt RNA ved å tilsette 30 μL RNase-fritt vann til kolonnen. Lukk kolonnehetten, og vent 5 min ved romtemperatur. Deretter spinner du kolonnen på 15 000 x g i 1 min.
- Overfør den totale mengden prøve som inneholder totalt RNA til et nytt mikrocentrifugerør. Sett hvert av rørene på is, og mål konsentrasjonen av total RNA ved spektrofotometri.
- Oppbevar rørene med prøver ved −80 °C for langtidslagring før bruk.
5. Syntese av cDNA med omvendt transkripsjon av total RNA
MERK: MIQE (Minimum informasjon for publisering av kvantitative real-time PCR Eksperimenter) retningslinjer ble utstedt for å oppmuntre til bedre eksperimentell praksis og bidra til å oppnå pålitelige og utvetydige resultater19. I denne protokollen syntetiseres cDNA fra 1,0 μg renset total RNA i en to-trinns prosedyre ved hjelp av omvendt transkripsjon, poly(A) polymerase og oligo-dT primer.
- Forbered følgende: 1,5 ml mikrocentrifuge rør, åtte-brønns stripe rør med caps, hetten på hver åtte-stav rør, destillert vann, is, en omvendt transcriptase kit (se Table of Materials)14,15 i smeltet tilstand, en termisk cycler, og en vortex mikser.
- Start den termiske cycleren.
- Klargjør en master mix løsning: Tilsett 2,0 μL omvendt transkripsjonsblanding (inkludert i settet) og 2,0 μL 10x nukleinsyreblanding i 4,0 μL 5x hi-spec buffer (for å oppnå totalt 8,0 μL master mix per rør).
- Sett 8,0 μL av master mix-løsningen i hvert rør på et åtte-brønns striperør.
- Juster den totale RNA-tettheten. For å isolere 1,0 μg av totalt RNA fra nyreprøvene i 12 μL RNasefritt vann, overfør riktig mengde total RNA til destillert vann ved hjelp av tetthetsdataene målt som beskrevet i trinn 4.15.
MERK: Hvis dna-kontaminering er til stede, vil det forurensede DNA-et forsterkes samtidig i qRT-PCR. - Plasser en 12 μL aliquot av totalt RNA i hvert rør og lukk rørets hette. Sentrifuger røret for 15 x.
- Sett røret i den termiske cycler og inkuber prøven i 60 min ved 37 °C. Deretter inkuberer du umiddelbart prøven i 5 min ved 95 °C for syntesen av cDNA.
- Når inkubasjonen er fullført, overfør cDNA til et nytt 1,5 ml mikrocentrifugerør og fortynne cDNA ti ganger (1:10) med destillert vann. Vortex og sentrifuger røret i 5 s.
- Oppbevar den fortynnede cDNA midlertidig på is og flytt prøvene til −80 °C for langtidslagring før bruk.
6. qRT-PCR av miRNA
MERK: Vi brukte intercalator-metoden til å utføre qRT-PCR av miRNA. Primere for RNA er U6 små kjernefysiske 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, og miRNA-7219-5p ble brukt.
- Forbered følgende: 1,5 ml mikrocentrifugerør, en vortex mikser, en 96-brønns reaksjonsplate for qRT-PCR, selvklebende film for 96-brønns reaksjonsplate, en klebende filmapplikator, en 96-brønns sentrifugerotor, miRNA-spesifikke primere, et PCR-instrument i sanntid og et grønt fargestoffbasert PCR-sett (se Materialsbord )14,15 som inneholder 2x PCR-masterblanding og 10x universal primer.
- Etter å ha blandet dem i 1,5 ml mikrocentrifuge rør, vortex følgende elementer: 6,25 μL destillert vann, 1,25 μL av hver 5 μM miRNA primer oppløst i kjernefritt vann, 12,5 μL av 2× PCR master mix og 2,5 μL av 10x universell primer.
- Forbered cDNA syntetisert som beskrevet i trinn 5, og smelte den. Vortex og sentrifuger cDNA i 5 s.
- Sett en 22,5 μL aliquot av reagensen (opprettet som beskrevet i trinn 6.2) i hver brønn av 96-brønnplaten.
- Sett en 2,5 μL aliquot av cDNA i hver brønn av platen.
- Bruk klebefilmapplikatoren til å feste klebefilmen tett på 96-brønnplaten. Sentrifuger platen med 96-brønns sentrifugerotoren på 1000 x g i 30 s for å avgjøre reaksjonene nederst på hver brønn.
7. PCR sykling
- Start PCR-systemet i sanntid, og plasser platen som er opprettet som beskrevet i trinn 6.6. i sanntid PCR-systemet. Angi eksperimentegenskapene neste gang. identifisere eksperimentnavnet. Velg følgende: "96-brønn (0,2 ml)" som systemets eksperimenttype, "Komparativ CT (ΔΔCT)" som mengdemetode, "SYBR Green Reagents" som reagenser for å oppdage målsekvensen, og "standard" som systemets kjøring.
- Tilordne et navn til prøven og mål-miRNA, og tilordne deretter et navn til prøven og mål miRNA i hver brønn. Eksempler bør tilordnes i duplikat for å få passende data for bekreftelse av resultatene. Velg en referanseprøve og en endogene kontroll, og velg "ingen" for at fargestoffet skal brukes som passiv referanse. Pass på at du angir den negative omvendte transkripsjons- og ikke-malkontrollen for miRNA-uttrykket for å eliminere krysskontaminering av reagenser.
- Kontroller at innstillingen for reaksjonsvolumet er "20 μL" og pcr-sykkelforholdene er satt til 95 °C i 15 min, etterfulgt av 40 sykluser med denning ved 94 °C i 15 s, glødende ved 55 °C i 30 s og forlengelse ved 70 °C for 30 s.
- Når qRT-PCR-prosessen er fullført, kan du bruke systemets program til å analysere qRT-PCR-dataene. Kontroller at terskellinjen som velges automatisk av programmet, passer for hver brønn.
- Kontroller terskelsyklusverdien (CT) for endogene kontroll og mål miRNA analysert i hver prøve. CT-verdien bestemmes av skjæringspunktet mellom forsterkningskurven og terskellinjen. I den nåværende studien brukte vi RNU6-2 som en endogene kontroll for målet miRNA uttrykksnivå, og vi brukte ΔΔCT-metoden for å bestemme det relative uttrykksnivået for hvert mål miRNA20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En UUO-musemodell ble opprettet av venstre ureteral ligation som beskrevet21 i 8 uker gamle hannmus som veier 20–25 g. Ureters ble helt hindret av dobbel ligation med 4-0 silkesuturer. Et smertestillende (meloksikam 5 mg/kg, subkutan injeksjon) ble administrert før operasjonen og også daglig på 2 dager etter operasjonen. Ved 8 dager etter operasjonen ble nyrene samlet inn, skylt med PBS, dissekert og lagret i flytende nitrogen for videre analyse. Sham-opererte mus fungerte som kontroller. Den doble ligation er vellykket hvis venstre nyre har hydronephrosis. Basert på miRNA qRT-PCR-data innhentet ved hjelp av denne UUO-modellen, ble nivået på miRNA-3070-3p betydelig økt og nivåene av miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p ble betydelig redusert i nyrene til UUO-musene sammenlignet med kontrollene (figur 1).
Figur 1: Differensialt uttrykt miRNAs i nyrene til UUO mus. qRT-PCR analyse av miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, og miRNA-7219-5p uttrykk i sham mus (n = 8) og UUO mus (n = 8). Verdier er ± standardfeil (feilfelt). T-tester ble brukt til å undersøke betydelige forskjeller mellom grupper. T-tester med p-verdi <0,05 ble ansett som signifikante. miRNA: microRNA, n.s.: ikke signifikant, qRT-PCR: kvantitativ sanntids reverstranskriptasjon polymerase kjedereaksjon, UUO: ensidig ureteral obstruksjon. *p<0,05. Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovennevnte protokoll med qRT-PCR klarte å bestemme uttrykksnivåene for de målrettede miRNAene. Vurderingen av ekstraherte miRNAs er viktig når man søker å få meningsfulle qRT-PCR-data, og for å bekrefte kvaliteten på miRNAs før du utfører qRT-PCR, bør forholdet mellom absorbans ved 260 nm til det ved 280 nm kontrolleres med et spektrofotometer. Hvis en enkelt PCR-forsterkning av forventet lengde og smeltetemperatur eller en monomodale smeltekurve ikke kan oppnås ved qRT-PCR, kan det være DNA-kontaminering eller en primer dimer i hver brønn av reaksjonsplaten.
Uttrykksnivåene av miRNAer kan evalueres ved flere andre metoder enn qRT-PCR, inkludert mikroarray, nordlig blotting og ribonuclease beskyttelsesanalysemetoder. QRT-PCR er imidlertid en enkel, svært reproduserbar prosedyre som er både nøyaktig og følsom, og mindre prøvevolumer kan brukes til qRT-PCR sammenlignet med nordlige blotting og ribonuclease beskyttelsesanalyser22. I tillegg, siden mikroarrayer muliggjør samtidig måling av uttrykket for titusenvis av miRNAs, kan de identifisere kandidatmiRNA-markører. Mikroarray data har vist en generell høy korrelasjon med data innhentet av qRT-PCR23, men en konsensus om optimal metodikk for å sammenligne mikroarray data innhentet i ulike studier har ikke blitt nådd24.
Den nye protokollen har følgende begrensninger. Nytten av denne protokollen har ikke blitt validert i andre organer, som lever og lunge; og protokollen er ikke testet hos andre laboratoriedyr (f.eks. rotter, hunder og griser). Flere grupper rapporterte at denne protokollen (for rensing og deteksjon av miRNAs av qRT-PCR) aktivert rensing av høy kvalitet RNA fra vev12,,14,,15. Metoden har høy nøyaktighet og følsomhet for å oppdage miRNA uttrykk12,14. Den nåværende rapporten viser at denne protokollen kan brukes til å oppdage miRNA-uttrykk i musenyre. Protokollen kan dermed brukes til å bestemme miRNA-uttrykksprofilene i nyrene til mus med et bredt spekter av sykdomsstater. På grunn av protokollens enkelhet kan mange prøver behandles samtidig, og bruk av protokollen kan derfor bidra til analyser av uttrykket for mange miRNAer under ulike patologiske forhold i nyrene.
Det er visse aspekter av protokollen å være klar over og huske på. For det første må de rensede RNAene holdes på is for å forhindre nedbrytning ved romtemperatur. Nyreprøvene må homogeniseres til prøvene er fullstendig smeltet i lysisreagensen. Siden musenyrer inneholder betydelig bindevev som ikke oppløses i lysisreagens, er en kolonne shredder nødvendig for ytterligere homogenisering. For det andre må riktig endogene kontroll miRNA (hvis uttrykk er stabilt blant prøver) verifiseres gjennom qRT-PCR eksperimentell oppsett fordi invasjonen av ulike stoffer under denne protokollen kan endre uttrykksnivået for endogene kontroll miRNA, muligens kompromittere resultatene.
Til slutt har vi presentert detaljene i en qRT-PCR-protokoll for deteksjon, rensing og evaluering av microRNA-uttrykk i musenyre med UUO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Michelle Goody, PhD, fra Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) for redigering av et utkast til dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L.
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
