Summary
Præsenteret her er en protokol for tilføjelse peptid CD47 (pepCD47) til metal stents ved hjælp af polybisfosfonat kemi. Funktionalisering af metal stents ved hjælp af pepCD47 forhindrer fastgørelse og aktivering af inflammatoriske celler og dermed forbedre deres biokompatibilitet.
Abstract
De vigtigste komplikationer forbundet med nøgne metal stents og narkotika eluting stents er in-stent restenosis og sen stent trombose, henholdsvis. Forbedring af metalstents biokompatibilitet er således fortsat en betydelig udfordring. Målet med denne protokol er at beskrive en robust teknik til modifikation af metaloverflader ved biologisk aktive peptider for at øge biokompatibiliteten af blodkontakt medicinske implantater, herunder endovaskulære stenter. CD47 er en immunologisk artsspecifik markør for sig selv og har antiinflammatoriske egenskaber. Undersøgelser har vist, at en 22 aminosyre peptid svarende til Ig domæne CD47 i den ekstracellulære region (pepCD47), har anti-inflammatoriske egenskaber som fuld længde protein. In vivo undersøgelser hos rotter, og ex vivo undersøgelser i kanin og humane blod eksperimentelle systemer fra vores laboratorium har vist, at pepCD47 immobilisering på metaller forbedrer deres biokompatibilitet ved at forhindre inflammatorisk celle fastgørelse og aktivering. Dette papir beskriver trin-for trin protokol for funktionalisering af metaloverflader og peptid vedhæftet fil. Metaloverfladerne modificeres ved hjælp af polyallaminbifosfat med latente thiolgrupper (PABT) efterfulgt af deprotection af thioler og forstærkning af thiolreaktive steder via reaktion med polyethyleneimin installeret med pyridyldithiogrupper (PEI-PDT). Endelig er pepCD47, der indeholder terminalcysterrester forbundet til kerne peptidsekvensen gennem en dobbelt 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl afstandsstykke, fastgjort til metaloverfladen via disulfidbindinger. Denne metode til peptid fastgørelse til metaloverflade er effektiv og relativt billig og kan derfor anvendes til at forbedre biokompatibiliteten af flere metalliske biomaterialer.
Introduction
Perkutan koronar intervention er den første linje i behandlingen af koronararteriesygdomme (CAD) og primært indebærer stenting de syge arterier. Men in-sten restentose (ISR) og stenttrombose er almindelige komplikationer forbundet med stent indsættelse1. Blodinteraktion på blod-stent interface er karakteriseret ved en næsten øjeblikkelig adsorption af plasma proteiner på metaloverfladen, efterfulgt af blodplader og inflammatorisk celle vedhæftet fil og aktivering2. Frigivelsen af de inflammatoriske cytokiner og chemokines fra aktiverede inflammatoriske celler fører til fænocypisk ændring af de vaskulære glatte muskelceller (VSM) i tunica medierne og udløser deres centripetal migration til intimal rum. Spredning af aktiveret VSMC i intima resulterer i intimal lag fortykkelse, lumen indsnævring og in-stent restenosis3. Drug eluting stents (DES) blev udviklet for at forhindre VSMC spredning; disse lægemidler har dog en cytotoksisk effekt uden for målet på endotelcellerne4,5. Derfor, sen stent trombose er en fælles komplikation forbundet med DES6,7. Stents lavet af biologisk nedbrydelige polymerer, såsom poly-L-lactide har vist meget lovende i dyreforsøg og indledende kliniske forsøg, men blev til sidst erindres, når den "virkelige liv" klinisk brug viste deres mindreværd til 3rd generation DES8. Derfor er der behov for at forbedre biokompatibiliteten af nøgne metal stents for bedre patient resultater.
CD47 er et allestedsnærværende transmembranisk protein, der hæmmer det medfødte immunrespons, når det er bundet til dets cognatereceptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. SIRPα-receptoren har et immuncelletyrolsinhæmmende motiv (ITIM) domæne, og signalhændelserne på SIRPα - CD47-interaktion resulterer i sidste ende i nedregulering af inflammatoriskcelleaktivering 10,11,12,13. Forskning i vores laboratorium har vist, at rekombinant CD47 eller dens peptid derivat, svarende til de 22 aminosyre Ig domæne af den ekstracellulære region CD47 (pepCD47), kan reducere værten immunrespons på en række klinisk relevante biomaterialer14,15,16. For nylig har vi vist, at pepCD47 kan immobiliseres til rustfrit stål stent overflader og reducere den patofysiologiske respons forbundet med restenosis. Bemærk, at pepCD47 modificerede overflader kan modtagelige for relevante brugsbetingelser såsom langtidsopbevaring og ethylenoxidsterilisering17. Med henblik herpå kan pepCD47 være et nyttigt terapeutisk mål for at løse de kliniske begrænsninger af endovaskulære stenter.
Strategien for kovatalt fastgørelse af pepCD47 til en metaloverflade indebærer en række nye kemiske modifikationer af metaloverfladen. Metaloverfladerne er først belagt med polyallaminbifosfonat med latente thiolgrupper (PABT) efterfulgt af deprotection af thioler og fastgørelse af polyethyleneimin (PEI) med installerede pyridyldithiogrupper (PDT). PDT grupper af PEI uforbrugt i reaktionen med debeskyttede PABT thioler reageres derefter med pepCD47 indarbejde thioler i terminalen cystein rester, resulterer i bindende pepCD47 til metaloverfladen via en disulfid obligation14,17,18. Vi brugte en fluorophore konjugeret pepCD47 (TAMRA-pepCD47) til at bestemme inputkoncentrationen af peptid, der resulterer i den maksimale overflade immobilisering af peptid. Endelig evaluerede vi den akutte og kroniske anti-inflammatoriske kapacitet af pepCD47 belagt metal overflader, ex vivo, ved hjælp af Chandler loop apparat, og monocyt vedhæftet fil / makrofag ekspansion assay, henholdsvis.
Dette papir giver en systematisk protokol for fastgørelse af thiolated peptider til metaloverfladen; bestemmelse af peptidets maksimale immobiliseringstæthed og vurdering af de antiinflammatoriske egenskaber ved pepCD47-belagte metaloverflader, der udsættes for fuldblod og isolerede monocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle humane prøver til dette eksperiment blev opnået i overensstemmelse med IRB på Children's Hospital of Philadelphia. Alle dyreforsøg blev udført efter godkendelse fra IACUC fra Children's Hospital of Philadelphia.
1. Belægning nøgne metaloverflader med PEI-PDT
- Håndsværkerne i rustfrit stål (1 cm x 1 cm eller 0,65 cm x 1 cm) eller meshdiske i rustfrit stål med 2-isopropanol i en shaker (60 °C, hastighed på 200 omdr./min.) i 5 min. Udfør dette trin 2x. Derefter vaskes 2x med chloroform (60 °C, hastighed på 200 rpm) i 10 min hver.
- De rensede prøver i rustfrit stål sættes i en ovn ved 220 °C i 30 min.
- Der klargøres 5 ml PABT-opløsning ved at opløse 25 mg polyallaminbifosfonat med latent thiolgrupper (PABT) og 5 mg kaliumbikarbonat (KHCO3) i 5 ml DDW og inkuberes ved 72 °C i en shaker ved 200 omdr./min. i 30 min.
BEMÆRK: For PABT syntese henvises til tidligere offentliggjort litteratur18. - Bagt bagt folien eller maskediskene nedsænkes i 0,5 % vandig opløsning af PABT og inkuberes i en shaker (72 °C, hastighed på 200 omdr./min.) i 1 time.
- De PABT-modificerede prøver vaskes med deioniseret destilleret vand (DDW) i 5x, prøverne overføres i et nyt hætteglas og vaskes igen med DDW i 5x.
- Der klargør i alt 5 ml TCEP-opløsning (12 mg/ml) ved opløsning af 60 mg Tris (2-carboxyethyl) phosphinhydrorid (TCEP) i 5 ml eddikesyre på 0,1 M (0,57 ml iseddike 820 mg natriumacetat i 100 ml DDW).
- De PABT-modificerede prøver behandles med TCEP i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) på en shaker.
BEMÆRK: TCEP bruges til at fjerne beskyttelsen af thiolgrupperne. - Degas DDW i en rund bundkolbe ved hjælp af en vakuumgenereringsanordning, såsom en lyophilizer, og vask de TCEP-behandlede folier eller netdiske med afgasset DDW til 5x. Prøverne overføres i et nyt hætteglas, og 5x vaskes desuden med afgasset DDW.
BEMÆRK: Det er altafgørende at arbejde hurtigt for at forhindre oxidation af thioler på metaloverfladen ved atmosfærisk ilt. - Der klargøres 5 ml 1 % PEI-PDT-opløsning ved fortynding af 212,5 μL bestand PEI-PDT og 125 μL μL μL 0,4 M natriumacetat i afgasset DDW. Trin 1.9 udføres samtidigt med trin 1.8 for at minimere eksponeringen af prøverne for atmosfærisk luft.
BEMÆRK: Syntesen af PEI-PDT er beskrevet i tidligere offentliggjort litteratur18. - Inkuber de vaskede prøver i rustfrit stål med 1% PEI-PDT. Udskift luft med argon gas, forsegle hætteglassene lufttæt og bland på en shaker på RT i 1 time. Fortsæt straks med peptidkonjugationen eller opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
2. Fastgørelse og kvalitativ/kvantitativ vurdering af fluorophore konjugeret pepCD47-retention på metaloverflade ved hjælp af fluorescensmikroskopi og fluorimetri
- Vask folie kuponer eller mesh diske udarbejdet som beskrevet i afsnit 1, trin 1.1-1.10 ovenfor med DDW 5x. Overfør prøverne til et nyt hætteglas og vaskes med DDW for yderligere 5x. Endelig vaskes 2x med afgasset ethanol og 2x med afgasset dimethylformamid (DMF).
- Der klargøres tetramethylrhodamin (TAMRA)-konjugeret pepCD47-lageropløsning ved at opløse TAMRA-konjugeret pepCD47-pulver i afgasset dimethylformamid (DMF) til en endelig koncentration på 1 mg/ml. Aliquot lageropløsningen i 1 ml tildelinger. Opbevares i velforseglede rør under argonatmosfære ved -20 °C.
- Fortyndet 1 mg/ml af stamopløsningen af TAMRA-konjugerede pepCD47 ved hjælp af afgasset DMF til fremstilling af følgende koncentrationer af fluorophore konjugerede pepCD47 - 10, 30, 100 og 200 μg/ml.
BEMÆRK: Hvis TAMRA-konjugeret pepCD47 ser ud til at være udfældet, skal du reducere tamra-konjugeret pepCD47-opløsning ved hjælp af TCEP perler i forhold 1:1 ved RT i 20 min. Bemærk, at før du tilføjer TAMRA-konjugerede pepCD47 til TCEP perler, drej TCEP perler løsning, fjerne supernatant og derefter fortsætte med tilsætning af TAMRA-konjugerede pepCD47. - Inkuber pei-PDT modificerede foliekuponer med 10, 30, 100 eller 200 μg/ml TAMRA-konjugeret pepCD47 i tre eksemplarer for hver tilstand på en shaker ved RT under argonatmosfære i 1 time. Inkuber PEI-PDT modificerede meshdiske samt meshdis disk, der ikke er ændret ud over trin 1.2 (kontrol af bare metal) med 100 μg/ml TAMRA-konjugerede pepCD47 i tre eksemplarer ved RT under argonatmosfære på en shaker i 1 time.
BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter er hætteglassene pakket ind i aluminiumsfolie for at beskytte indholdet mod lys. - Fluorophore konjugeres pepCD47-belagte overflader for at fjerne det ikke-kovalent fastgjorte peptid i følgende rækkefølge: DMF (3x), DMF/DDW kl. DDW (3x), 0,3% SDS i 20 mM Tris pH 7,4 (3x, 5 min hver ved 70 °C på en shaker), DDW (3x), skiftehætteglas og en endelig DDW vask.
- Placer kontrol og kovalent konjugerede mesh diske på et mikroskop glas, tilsæt 50 μL PBS og placere en dæksl. Billedmaskediske ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop udstyret med et rombefiltersæt. Tag repræsentative billeder ved 100x forstørrelse.
- Der klargøres 15 ml 12 mg/ml TCEP-opløsning ved opløsning af 180 mg TCEP i 1:1 v/v blanding af methanol og 0,1 M eddikesyrebuffer.
- Hver vasket folie inkuberes med 1 ml TCEP-opløsning på en shaker ved RT i 15 min.
- Følgende standarder klargøres ved seriel fortyndelse af TAMRA-konjugeret pepCD47-lager (1 mg/ml) – 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml, 0,1 μg/ml og 0,01 μg/ml. Brug TCEP-løsningen som fortyndingst.
- Analysér den TAMRA-konjugerede pepCD47, der frigives fra metaloverfladen, i forhold til den kalibreringskurve, der genereres ved hjælp af standarderne ved fluormetri ved 544/590 nm excitation og emissionsbølgelængder.
3. Fastgørelse af human pepCD47 til PEI-PDT modificerede overflader
- PEI-PDT-belagte prøver, der er formuleret som beskrevet i punkt 1, trin 1.1-1.10 ovenfor, vaskes med afgasset DDW 5x, og hætteglasset skal vaskes med afgasset DDW 5x.
- Forbered human pepCD47 lageropløsning (1 mg/ml) ved at opløse human pepCD47 pulver i afgasset 50% eddikesyre for at opnå en koncentration 1 mg/ml.
- Arbejdskoncentration af human pepCD47 (100 μg/ml) forberedes ved at opløse 500 μL af bestanden af human pepCD47 i 4.500 μL afgasset 1x fosfat bufferet saltvand (PBS).
- De vaskede PEI-PDT-belagte prøver med 100 μg/ml pepCD47 ved RT med omrystning i 1 time.
- Vask de humane pepCD47-belagte prøver for at fjerne overskydende peptid i følgende rækkefølge PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min hver), DDW (3x), skifte hætteglas og endelig DDW vask.
BEMÆRK: Human pepCD47 belagte overflader kan opbevares tørt ved 4 °C i op til 6 måneder.
4. Belægning af PEI-PDT modificerede overflader med forvrænget sekvens (Scr)
- Opløs den rørægtede sekvenspulver i afgasset 0,1% eddikesyre for at forberede en lageropløsning på 1 mg/ml.
- Der klargøres en opløsning på 100 μg/ml røræt peptid ved at opløse 500 μL af den i 4.500 μL afgasset 0,1% eddikesyre.
- De vaskede PEI-PDT-prøver lægges med 100 μg/ml røræstet peptid ved RT med omrystning i 1 time.
- For at fjerne fritliggende rørænt peptid, vaskes overfladerne i følgende rækkefølge 0,01% eddikesyre (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), skifte hætteglas og en DDW vask.
5. Chandler loop til analyse af cellulære fastgørelse til metaloverflader
- Metalfo folier (0,65 cm x 1 cm) coates med enten human pepCD47 eller røræt peptid i henhold til beskrivelsen på punkt 1 efterfulgt af 3 eller 4.
- Skær 1/4" PVC-rør i tre 38 cm lange stykker.
- Sæt op til 8 uændrede, forvrængede peptid eller pepCD47 modificerede metal folier i tre forskellige rør.
- Saml 30 ml blod fra raske menneskelige donorer fri for enhver anti-blodplade medicin som pr institutionelle IRB protokol. Preload sprøjte med 1 ml 4% natriumcitrat for at forhindre koagulation af indsamlet blod.
- Sæt 10 ml blod i hvert rør ved hjælp af en 10 ml sprøjte og tilslut enderne med metaladaptere. Anslå de blodfyldte rør på hjulene på Chandler loop-apparatet.
- Blod langs metalfoolierne føres ved hjulrotation ved 37 °C ved den hastighed, der beregnes til at frembringe forskydningen på 25 dyns/cm2 i 4 timer.
- Hæld vandet fra blodet fra rørene og bortskaf blodet i henhold til IRB-kravene.
- Skær rørene ved hjælp af skalpel til at hente folier fra hvert rør.
- Der forberedes 2% glutaraldehydopløsning ved at fortynde 10 ml glutaraldehydopløsning ved hjælp af 10 ml natriumkakodylatbuffer med 0,1 M natriumchlorid.
- Folie i 2% glutaraldehydopløsning i 15 min. og opbevares ved 4 °C natten over. Før du analyserer, vaskes metalfolierne 3x med PBS.
6. Analyse af cellulære fastgørelse til metaloverflader ved hjælp af CFDA farvestof
- Varm 8 ml PBS i 15 ml rør i et vandbad indstillet til 37 °C.
- Forbered CFDA (carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester) farvestofopløsning som følger - tilsæt 90 μL DMSO til et CFDA farveglas for at opnå en lagerkoncentration på 10 mM. Dernæst forberedes arbejdskoncentrationen på 93,75 μM ved at tilsætte 75 μL af bestanden CFDA til 8 ml varm PBS. Bland ved at vende rørene et par gange og dække røret med aluminiumsfolie.
BEMÆRK: Det er tilrådeligt at tilberede CFDA-farvestoffet frisk før hver brug. - Inkuber hver folie med 1 ml CFDA farvestof i en 24 brøndplade. Pladen dækkes med aluminiumsfolie og inkuberes pladen ved 37 °C i 15 min.
- Metalfopperne vaskes 3x med PBS for at fjerne overskydende farvestof. Billede ved hjælp af det omvendte fluorescensmikroskop.
7. Monocyt fastgørelse og makrofag ekspansion på pepCD47-modificerede og nøgne metal overflader
- Saml 10 ml perifert blod via vena cava adgang under ofringen af en 400-450 g mandlig Sprague-Dawley rotte. Bland straks med 1.000 IE natrium heparin for at forhindre koagulation.
- Pipette 10 ml tæthedsgradient i et konisk rør på 50 ml. Bland blodet med 5 ml PBS, og omhyggeligt lag fortyndet blod over densitet gradient medium ved hjælp af en Pasteur pipette. Centrifuge i en svingende skovrotor ved 800 x g og 18-25 °C i 20 min. med minimale accelerations- og decelerationsindstillinger.
- Ved hjælp af en Pasteur pipette, indsamle en uigennemsigtig lag af buffy pels på grænsefladen mellem plasma og Ficoll. Fortyndet buffy coat 1:3 med PBS og centrifuge ved 550 x g og 4 °C i 10 min til buffy coat celler.
- Re-suspendere buffy pelsceller i 3 ml ACK lysis buffer til lyse forurenende erythrocytter. Inkuber på is i 4 min. Der tilsættes 12 ml celleadskillelsesbuffer (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
- Centrifuge ved 550 x g og 4 °C i 10 min. Re-suspendere pellet i 10 ml CSB.
- Centrifuge ved 200 x g og 4 °C i 10 min. for at fjerne blodplader. Gentag to gange.
- Pelleten skal suspenderes igen i 500 μL CSB. Der tilsættes 10 μg af hvert af følgende anti-rotteantistoffer til mus: CD8a (klon OX-8), anti-CD5 (klon OX-19), anti-CD45RA (klon OX-33) og anti-CD6 (klon OX-52).
- Inkuberes ved 4 °C på en lodret rørrotator i 1 time. Der tilsættes 9,5 ml CSB. Centrifuge ved 300 x g og 4 °C i 10 min. Supernatanten kasseres, pelleten skal hænges igen i 10 ml CSB, og centrifugering gentages.
- Pelleten skal suspenderes igen i 500 μL CSB. Der tilsættes 150 μL ged antimuse-IgG-mikroperler. Inkuberes ved 4 °C på en lodret rørrotator i 20 min. Tilsæt 9,5 ml CSB. Centrifuge ved 300 x g og 4 °C i 10 min.
- Kassér supernatanten. Re-suspendere pellet i 1 ml CSB.
- Placer en LS-kolonne i en magnetisk separator. Prime LS kolonne med 3 ml CSB. Slet kolonneoverførselshastigheden. Der tilsættes 1 ml re-suspenderet cellepellet fra trin 7.10. Begynd at indsamle overførselshastigheden. Efter flowstop skal du tilføje 5 ml CSB og fortsætte med at indsamle kolonnegennemløbet, indtil flowet stopper.
- Centrifuger kolonneoverførselshastigheden (6 ml), der indeholder negativt udvalgte monocytter ved 300 x g og 4 °C i 10 min. Re-suspendere den resulterende lille pellet i 2 ml RPMI-1640 medium suppleret med 10% FCS, 1% pen / strep og 100 ng/mL rotte makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF).
- Tæl monocytterne ved hjælp af hæmocytometer. Juster monocytkoncentrationen til 5 x 105 celler/ml.
- Der tilsættes 1 ml monocytaffustring til de enkelte brønde på en 12 brøndplade med de nøgne folieprøver i rustfrit stål (N=3) eller prøver af rustfrit stål modificeret med rotte pepCD47 (N=3) pr. 1,1-1,10 og 3,1-3,6.
- Skift mediet på dag 3 og 5 efter såning. På dag 6 efter såning vaske cellerne med PBS og fix med 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 15 min. Vask to gange med PBS i 5 min.
- Fjern de rustfrit stål folier og læg dem individuelt i en ny 12 brøndplade. Lad være med at vende folien.
- Inkuberes i 0,5% Tween-20/PBS i 15 minutter for at permeabilisere cellerne. Vask to gange med PBS i 5 min.
- Blok i 10% gedeserum/PBS i 20 min. Aspirere serummet. Må ikke vaskes. Tilsæt mus anti-rotte CD68 antistof (fortyndet 1:100 i 1%BSA/PBS). Inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Vask 3x i PBS i 5 min hver.
- Tilføj ged anti-mus IgG Alexa Fluor 546 (fortyndet 1:200 i 1% BSA / PBS). Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 45 min. Vask i PBS i 5 min. Kontravægt med 1 μg/ml Hoechst 33342 farvestof i mørke ved stuetemperatur i 10 min. Vask 3x i PBS i 5 min hver.
- Vend foliene og billedet ved hjælp af et fluorescerende mikroskop med den omvendte optik. Tag billeder ved 200x forstørrelse med blå og rød filterindstillinger.
- Tæl de vedhæftede monocytter i de enkelte billeder og beregnede gruppegennemsnittene og standardafvigelserne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metaloverfladerne gøres thiolreaktive til peptidtilbehør via en række kemiske modifikationer, som vist i figur 1. PABT inkubation efterfulgt af PEI-PDT behandling gør metaloverfladen modtagelig for peptid vedhæftet fil. Peptid CD47 (pepCD47), der indeholder cysteinrester ved C-terminus, der er forbundet med kerne pepCD47-sekvensen gennem en fleksibel dobbelt AEEAc bro, er kovalent fastgjort til thiolreaktive overflader via disulfidbindinger. Ved hjælp af denne protokol, har vi vist, at pepCD47 forbliver stabilt fastgjort til metaloverfladen i op til seks måneder og kan modstå normal fysiologisk forskydning stress og sterilisation procedurer17.
Den maksimale peptidfastholdelse blev bestemt ved at føje TAMRA-konjugeret pepCD47 til metaloverfladen efterfulgt af den omfattende vask for at eliminere ikke-kovalent bundet peptid, kavalergang af TAMRA-pepCD47 ved reduktion af disulfidbroer, der binder peptidet til overfladen, og analytisk kvantificering ved hjælp af en fluormetrisk analyse. Specifikt blev der vedlagt stigende inputmængder af TAMRA-konjugerede pepD47 (1 ml 10-200 μg/ml opløsning) pei-PDT-belagte overflader og vasket flere gange for at fjerne det ikke-covalentbundne peptid. Koncentrationen af kovalent bundet TAMRA-konjugeret pepCD47 blev bestemt ved hjælp af et reducerende middel TCEP til at frigive det kovalent vedlagte peptid og vurdere dets fluorescens i forhold til standarderne. Inputkoncentrationen på 10, 30, 100 og 200 μg/ml påviste peptidfastholdelse på henholdsvis 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 og 157 ±25 ng/cm 2 (figur 2). Således blev den maksimale immobiliseringstæthed af pepCD47 på metaloverfladen fundet at være ca. 180 ng/cm2, hvilket blev opnået med en inputkoncentration på 100 μg/ml. Den korrekte immobilisering af TAMRA-konjugeret pepCD47 på PABT/PEI-PDT-modificerede metaloverflader blev yderligere bekræftet af fluorescensmikroskopi (Figur 3), der viste en ensartet fluorescens fra overfladen af TAMRA-konjugeret pepCD47-behandlede meshdiske (Figur 3A). Der blev kun påvist minimal fluorescens på overfladen af de kontrolmasker, der manglede PABT/PEI-PDT-modifikation (figur 3B), hvorved der ikke blev ekskluderet en ikke-specifikt bundet TAMRA-konjugeret pepCD47 som den vigtigste kilde til fluorescens.
Dernæst evaluerede vi pepCD47-belagte overfladers evne til at forhindre akut blodbårencelletilbehør sammenlignet med de uændrede og rørægtede sekvens peptid modificerede overflader. Scramble peptid har samme aminosyre sammensætning som pepCD47, men i en anden rækkefølge14,17. Den blodbårne celle vedhæftet fil blev evalueret ved rotation af blod fra raske menneskelige frivillige på tværs af uændrede, røræg, og pepCD47 modificerede overflader i Chandler loop apparat efterfulgt af vask for at fjerne uindsatte celler, fiksering, og farvning med CFDA farvestof. Overfladerne blev visualiseret ved fluorescensmikroskopi. I overensstemmelse med vores tidligere offentliggjorte data14,,17 pepCD47 belagte overflader viser en drastisk reduktion i blodbårne celler vedhæftet fil i forhold til forvrænget modificeret og uændret kontrol (Figur 4).
For at udvide virkningerne af pepCD47 overflade modifikation på inflammatorisk celletilbehør og spredning, vi brugte negative immunoselection af rotte buffy pels celler til at isolere monocytter19, og kulturperler de isolerede monocytter på nøgne metal og pepCD47-modificerede rustfrit stål folier i 6 dage i overværelse af M-CSF. Resultaterne af denne undersøgelse viser en kombineret 58% dæmpning af akut monocyt fastgørelse, deres fænocypiske konvertering til makrofager, og makrofag spredning på pepCD47 funktionaliserede overflader (Figur 5A) sammenlignet med de nøgne metal kontrol (Figur 5 B, C).
Figur 1: Skematisk repræsentation af de trin, der er involveret i tilføjelsen af pepCD47 til metaloverflader. AA) De rene metalprøver blev bagt ved 220 °C for at oxidere metaloverfladen. De bisfosfonat grupper af polallylamin bisfosfonat med latent thiol grupper (PABT) dannede koordinat bindinger med metaloxider og pels metaloverflader til at danne en funktionaliseret monolag. PABT-belagte metaloverflader blev yderligere behandlet med TCEP for deprotection af thiolgrupperne. bB) Strukturen i PEI-PDT og symbolsk repræsentation. cC) PABT-belagte og TCEP-reducerede overflader blev behandlet med PEI-PDT, som forstærkede det samlede antal thiolreaktive grupper, der er til rådighed til fastgørelse af det thiolerede peptid. Endelig blev PEI-PDT-belagte overflader reageret med terminalcystergrupper af pepCD47, og peptidet blev fastgjort til overfladen via disulfidbindinger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bestemmelse af pepCD47's immobiliseringstæthed på metaloverfladen. 1 cm x 1 cm metalfolie blev ændret ved hjælp af stigende koncentrationer (10, 30, 100 og 200 μg/ml) af fluorophore konjugerede pepCD47. Det overskydende peptid blev fjernet ved hjælp af flere vasketrin derefter behandlet med 1 ml TCEP opløsning til at kløve fluorophore konjugeret fluorophore. Koncentrationen af peptidet kovalent fastgjort til metaloverfladen blev analyseret fluormetrisk ved hjælp af en standardkurve fremstillet med definerede koncentrationer af fluorophore konjugeret pepCD47. Immobiliseringstætheden var repræsenteret som ng/cm² peptid fastgjort til metaloverfladen. Data udtrykkes som middelværdi ± SEM og er repræsentative for mindst tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fluorescensmikroskopi af overfladen i rustfrit stål modificeret med TAMRA-konjugeret pepCD47. Meshdiske i rustfrit stål, som er fortløbende modificeret med PABT, TCEP, PEI-PDT (A) eller uændrede (B), blev reageret med TAMRA-konjugeret pepCD47. Den korrekt konjugerede og kontrol nøgne metal masker blev grundigt vasket og afbildet på 100x forstørrelse. Skalaen bar længde er 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Evaluering af pepCD47's akutte antiinflammatoriske og antitrombotiske funktioner. 0,65 cm x 1 cm metalfolie blev belagt med 100 μg/ml af enten human pepCD47 eller røræg og udsat for blod i Chandler loop apparatet. De ubundne celler blev fjernet ved vask med PBS og folier blev fastsat i 2% glutaraldehyd. De uændrede, forvrængede modificerede og humane pepCD47 modificerede overflader blev derefter inkuberet med CFDA-farvestoffet i 15 minutter ved 37 °C, vasket med PBS og analyseret ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: En prævalens af CD68-positive makrofager på de nøgne og pepCD47-funktionaliserede metaloverflader. Rotte perifere blodafledte monocytter blev isoleret ved gradienttæthed centrifugering efterfulgt af negativt immunoselection med magnetiske mikroperler. 5 x 105 monocytter blev tilsat i brøndene på en 12 brøndplade med individuelt placerede bare metalfolieprøver (N=3) eller prøverne derivatized med rotte pepCD47. Makrofagdifferentiering blev stimuleret af 100 ng/ml M-CSF. Seks dage efter såning cellerne blev fastsat, og immunstained med anti-rotte CD68 antistof, sekundær Alexa Fluor-546 (rød) konjugeret antistof og kontrastained med Hoechst 33342 nukleare farvestof (blå). Repræsentative billeder af det nøgne metal (A) og pepCD47-funktionaliserede(B)overflader blev taget ved 200x forstørrelse og fusioneret. Skalaen bar længde er 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer og beskriver en relativt ny kemisk strategi for at føje terapeutiske peptid moieties til en rustfri ståloverflade med det overordnede mål om at reducere overfladens reaktivitet med inflammatoriske celler, der findes i blodet. Bisfosfonat kemi beskrevet heri indebærer koordinatbinding dannelse mellem metaloxider og bisfosfonat grupper af PABT. Tykkelsen af polybisphosphonat monolag dannet på metaloverfladen ikke overstiger 5 nm18,og derfor er ligegyldig for de potentielle proinflammatoriske virkninger af de tykke polymer belægninger20. Deprotection af latent thiol gruppe i alifatiske sidekæder af PABT primtal metaloverflader til yderligere kemisk modifikation med thiol-reaktive forbindelser. PEI-PDT forgrenes polyethyleneimin (gennemsnitlig Mw=25.000), hvor ~20% af ethyleneimine ledne er modificeret med thiol-reaktive pyridyldithio grupper. Da kun et mindretal af PDT-grupper i PEI-PDT forbruges i reaktionen med de PABT-afledte thioler, ændres overfladekemien efter PEI-PDT-tøjring til thiolreaktiv for at muliggøre fastgørelse af thiolerede peptider18. Denne kemiske strategi blev udviklet og udbredt i vores laboratorium til fastgørelse af flere biomolekyler, såsom rekombinant proteiner14,peptider14,17, og virale genvektorer18 til metaloverfladen. Selv om pabt i det meste af vores arbejde har brugt overflader af rustfrit stål, kan det interagere med andre metallegeringer21 og dermed har potentiale til at forbedre biokompatibiliteten og det terapeutiske potentiale i en lang række metalliske biomaterialer.
Vores nuværende metode viser, at den maksimale immobiliseringstæthed af fluorophore konjugeret pepCD47 på metaloverflader er 180 ng/cm2, hvilket er mindre i forhold til vores tidligere offentliggjorte data17. Vi tilskriver denne uoverensstemmelse de forskellige vaskestrategier, der anvendes i begge undersøgelser. I vores nuværende protokol har vi brugt SDS, som helt fjerner ikke-kovalent bundet peptider i forhold til Tween-20, som blev brugt i vores indledende undersøgelser. 180 ng/cm2 svarer dog til ca. 4 x 106 molekyler/μm2 pepCD47. Denne immobiliseringstæthed er meget højere end de fysiologiske niveauer af CD47 på celleoverflader, som er ca. 390 molekyler/μm2,22. Således forudser vi, at strenge vaskeforhold ikke i væsentlig grad vil påvirke de anti-inflammatoriske egenskaber pepCD47 modificerede metaloverflader.
Denne metode til fastgørelse af pepCD47 til metal er meget reproducerbar, men der er flere trin i protokollen, som kræver omhyggelig opmærksomhed. For det første, efter belægning metaloverfladen med PABT og reducere det ved hjælp af TCEP, thioler er tilbøjelige til oxidation, når de udsættes for luft. Det er derfor yderst vigtigt, at overfladerne altid nedsænkes i afgasset vand. Af samme grund til tilsættes PEI-PDT-opløsningen i afgasset vand, og argon tilsættes til hætteglassene under inkubationen af folier belagt med PEI-PDT. For det andet må man overveje potentialet for udfældning af opløselige peptider. PepCD47 har en terminal cystein rester, samt cystein rester i sekvensen. Således, når forkert opbevaret, er der en stor mulighed for, at peptiderne polymerisere og udfældes ud af opløsningen. For at løse dette potentielle problem anbefales det, at peptiderne reduceres ved hjælp af TCEP-perler i 20 min til 1 time før inkubation med PEI-PDT-belagte overflader. TCEP vil bidrage til at reducere peptider og øge deres opløselighed i deres respektive fortyndingst. Det anbefales også at fortrænge omgivende luft med argon i hætteglassene, mens pei-PDT-belagte prøver inkuberes med thioleret peptid.
Hvis ovennævnte forholdsregler følges, er overfladebehandlingsteknikken reproducerbar, og den eneste potentielle begrænsning for denne fremgangsmåde er den kommercielle manglende tilgængelighed af reagenser PABT og PEI-PDT.
Vi brugte en Chandler loop apparat til at give ex vivo proof of concept analyse for at forstå samspillet mellem pepCD47 modificerede metaloverflader medblodlegemer,og det er blevet anvendt med succes af vores laboratorium til at vise de anti-inflammatoriske egenskaber pepCD47 belagte overflader14,,15,,17,23. I denne undersøgelse brugte vi CFDA farvestof, der fluorescerer først efter indtastning af cellerne, når acetat grupper af farvestoffet er kløvet af den intracellulære esterase. Fordelene ved denne farvning procedure er, at det pletter de anucleerede blodplader og røde blodlegemer samt de nukleerede celler såsom leukocytter. Således, udnytte CFDA farvestof giver en vurdering af både akut anti-trombotiske og anti-klæbende egenskaber pepCD47 belagte overflader. Mere detaljeret vurdering kan erhverves ved scanning elektronmikroskopi og / eller immunstaining, som begge vi detaljerede tidligere24. Resultaterne af den nuværende undersøgelse validere, at den menneskelige pepCD47 belagt metal overflader er anti-trombotisk og anti-klæbemiddel i forhold til de uændrede og forvrænget sekvens kontrol.
For yderligere at undersøge, om pepCD47-modificerede overflader ændre vækstegenskaber af vedhæftede inflammatoriske celler, nøgne metal rustfrit stål folier eller folier formuleret med pepCD47 blev udsat for isolerede rotte monocytter i nærvær af syngeneic M-CSF. Cellerne blev dyrket under stationære forhold i 6 dage for at tillade fænoypisk konvertering og udvidelse af makrofager. I overensstemmelse med vores tidligere resultater observeret i de forskellige eksperimentelleindstillinger 14, et dybt fald i inflammatoriskcelletal på pepCD47 funktionaliserede overflader blev påvist i den aktuelle undersøgelse.
Således vores undersøgelser i sidste ende bevise, at den nye polybisfosfonat kemi til belægning metaller med pepCD47 er en effektiv måde at forbedre biokompatibilitet af metaloverflader og kan anvendes i andre biomedicinske anvendelser, såsom kunstige samlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Protokoludvikling og undersøgelser præsenteret i dette dokument blev støttet af NIH (NBIB) R01 finansiering (# EB023921) til IF og SJS, og NIH (NHLBI) R01 finansiering (# HL137762) til IF og RJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W.
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
