Summary
Présenté ici est un protocole pour l’appending peptide CD47 (pepCD47) aux endonts métalliques utilisant la chimie de polybisphosphonate. La fonctionnalisation des enprothents métalliques à l’aide de pepCD47 empêche l’attachement et l’activation des cellules inflammatoires améliorant ainsi leur biocompatibilité.
Abstract
Les complications clés associées aux endos métalliques nus et aux endosseurs d’échappement de drogue sont la restenose en stent et la thrombose en stent tardive, respectivement. Ainsi, l’amélioration de la biocompatibilité des enprothents métalliques reste un défi de taille. Le but de ce protocole est de décrire une technique robuste de modification de surface métallique par peptides biologiquement actifs pour augmenter la biocompatibilité des implants médicaux de contact avec le sang, y compris les enprotes endovasculaires. CD47 est un marqueur immunologique spécifique aux espèces de soi et a des propriétés anti-inflammatoires. Des études ont montré qu’un peptide de 22 acides aminés correspondant au domaine Ig de CD47 dans la région extracellulaire (pepCD47), a des propriétés anti-inflammatoires comme la protéine pleine longueur. Les études in vivo chez les rats, et les études ex vivo dans les systèmes expérimentaux de lapin et de sang humain de notre laboratoire ont démontré que l’immobilisation pepCD47 sur les métaux améliore leur biocompatibilité en empêchant l’attachement et l’activation inflammatoires de cellules. Cet article décrit le protocole étape par étape pour la fonctionnalisation des surfaces métalliques et de l’attachement peptidique. Les surfaces métalliques sont modifiées à l’aide de bisphosphate de polyallylamine avec des groupes de thiol latents (PABT) suivis de la dépprotection des thiols et de l’amplification des sites thiol-réactifs par réaction avec la polyéthylènemine installée avec des groupes pyridyldithio (PEI-PDT). Enfin, pepCD47, incorporant des résidus terminals de cystéine reliés à la séquence du peptide central par un double espaceur 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl, sont fixés à la surface métallique par des liaisons de disulfide. Cette méthodologie d’attachement peptidique à la surface métallique est efficace et relativement peu coûteuse et peut donc être appliquée pour améliorer la biocompatibilité de plusieurs biomatériaux métalliques.
Introduction
L’intervention coronaire percutanée est la première ligne de thérapie pour traiter des maladies coronaires (CAO) et implique principalement enfiler les artères maladie. Cependant, la restenose en stent (ISR) et la thrombose stent sont des complications communes liées au déploiement de stent1. L’interaction sanguine à l’interface sang-stent se caractérise par une adsorption presque immédiate des protéines plasmatiques à la surface métallique, suivie de l’attachement et de l’activation des cellules plaquettaire et inflammatoire2. La libération des cytokines inflammatoires et des chimiokines des cellules inflammatoires activées conduit à la modification phénotypique des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) dans le média tunica et déclenche leur migration centripète vers le compartiment intimal. La prolifération du VSMC activé dans l’intima a comme résultat l’épaississement intimal de couche, le rétrécissement de lumen et la restenosis in-stent3. Des endossés d’échappement de drogue (DES) ont été développés pour empêcher la prolifération de VSMC ; cependant, ces médicaments ont un effet cytotoxique hors cible sur les cellules endothéliales4,5. Par conséquent, la thrombose stent tardive est une complication commune liée au DES6,7. Les endoprothènes faits de polymères biodégradables, tels que le poly-L-lactide, se sont montrés très prometteurs dans les expériences animales et les premiers essais cliniques, mais ont finalement été rappelés lorsque l’utilisation clinique « réelle » a démontré leur infériorité par rapport à la3e génération des DES8. Par conséquent, il est nécessaire d’améliorer la biocompatibilité des enfiles métalliques nues pour de meilleurs résultats pour les patients.
CD47 est une protéine transmembrane omniprésente qui inhibe la réponse immunitaire innée lorsqu’elle est liée à son récepteur cognate Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. Le récepteur SIRPα a un domaine de motif inhibiteur de la tyrosine des cellules immunitaires (ITIM) et les événements de signalisation sur SIRPα - interaction CD47 aboutit finalement à la downregulation de l’activation des cellulesinflammatoires 10,11,12,13. La recherche dans notre laboratoire a prouvé que le CD47 recombinant ou son dérivé de peptide, correspondant au domaine ig d’acide aminé 22 de la région extracellulaire de CD47 (pepCD47), peut réduire la réponse immunisée d’hôte à une gamme de biomatériauxmédicalement pertinents 14,,15,,16. Récemment, nous avons démontré que le pepCD47 peut être immobilisé sur des surfaces en acier inoxydable et réduire considérablement la réponse pathophysiologique associée à la restenose. Il convient de noter que les surfaces modifiées pepCD47 sont favorables à des conditions d’utilisation pertinentes telles que le stockage à long terme et la stérilisation à l’oxyded’éthylène 17. À cette fin, pepCD47 peut être une cible thérapeutique utile pour répondre aux limitations cliniques des enfilents endovasculaires.
La stratégie pour l’attachement covalent du pepCD47 à une surface métallique implique une série de nouvelles modifications chimiques de la surface métallique. Les surfaces métalliques sont d’abord recouvertes de bisphosphonate de polyallylamine avec des groupes de thiol latents (PABT), suivies de la dépprotection des thiols et de l’attachement de la polyéthylèneeimine (Î.-P.-É.) aux groupes pyridyldithio installés (PDT). Les groupes PDT de l’Î.-P.-É. non consommés dans la réaction avec des thiols pabt déprotégés sont alors réagis avec pepCD47 incorporant des thiols dans les résidus terminals de cystéine, ayant pour résultat le pepCD47 liant à la surface de métal par l’intermédiaire d’un lien de disulfide14,,17,18. Nous avons utilisé un pepCD47 conjugué au fluorophore (TAMRA-pepCD47) pour déterminer la concentration d’intrants du peptide qui entraîne l’immobilisation maximale du peptide à la surface. Enfin, nous avons évalué la capacité anti-inflammatoire aiguë et chronique des surfaces métalliques enduites pepCD47, ex vivo, à l’aide de l’appareil de boucle Chandler, et de l’essai d’expansion de l’attachement monocyte/macrophage, respectivement.
Cet article fournit un protocole systématique pour l’attachement des peptides thiolated à la surface en métal ; déterminer la densité maximale d’immobilisation du peptide; et évaluer les propriétés anti-inflammatoires des surfaces métalliques enduites pepCD47 exposées au sang entier et aux monocytes isolés.
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Protocol
Tous les échantillons humains pour cette expérience ont été obtenus conformément à la CISR du Children’s Hospital de Philadelphie. Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées sur approbation de l’IACUC du Children’s Hospital de Philadelphie.
1. Revêtement des surfaces métalliques nues avec PEI-PDT
- Laver les coupons en papier d’aluminium inoxydable (1 cm x 1 cm ou 0,65 cm x 1 cm) ou les disques en maille en acier inoxydable avec 2 isopropanol dans un shaker (60 °C, vitesse de 200 rpm) pendant 5 min. Effectuez cette étape 2x. Laver ensuite 2x avec du chloroforme (60 °C, vitesse de 200 rpm) pendant 10 min chacun.
- Placer les échantillons d’acier inoxydable nettoyés dans un four à 220 °C pendant 30 min.
- Préparer 5 mL de 0,5% de solution PABT en dissolvant 25 mg de bisphosphonate de polyallylamine avec des groupes latents de thiol (PABT) et 5 mg de bicarbonate de potassium (KHCO3)dans 5 mL de DDW et incuber à 72 °C dans un shaker à 200 rpm pendant 30 min.
NOTE : Pour la synthèse de PABT se réfèrent à la littérature précédemmentéditée 18. - Immerger les feuilles cuites au four ou les disques en maille dans une solution 0,5% aqueuse de PABT et incuber dans un shaker (72 °C, vitesse de 200 rpm) pendant 1 h.
- Laver les échantillons modifiés par pabt avec de l’eau distillée déionisée (DDW) pour 5x, transférer les spécimens dans un nouveau flacon et laver à nouveau avec DDW pour 5x.
- Préparer un total de 5 mL de solution TCEP (12 mg/mL) en dissolvant 60 mg d’hydrochlorure de phosphine Tris (2 carboxyethyl) (TCEP) en 5 mL de tampon acétique de 0,1 M (0,57 mL d’acide acétique glaciaire, 820 mg d’acétate de sodium dans 100 mL de DDW).
- Traiter les échantillons modifiés par pabt avec tcep pendant 15 min à température ambiante (RT) sur un shaker.
REMARQUE : Le TCEP est utilisé pour dépectecter les groupes de thiol. - Degas DDW dans un flacon de fond rond à l’aide d’un dispositif générateur de vide, comme un lyophilisateur et laver les feuilles traitées tcep ou disques en maille avec dégazé DDW pour 5x. Transférer les échantillons dans un nouveau flacon, et en outre laver 5x avec dégazé DDW.
REMARQUE : Il est primordial de travailler rapidement pour empêcher l’oxydation des thiols à la surface métallique par l’oxygène atmosphérique. - Préparer 5 mL de solution PEI-PDT à 1 % en diluant 212,5 μL de stock PEI-PDT et 125 μL d’acétate de sodium de 0,4 M dans du DDW dégazé. Effectuez l’étape 1.9 simultanément à l’étape 1.8 afin de minimiser l’exposition des échantillons à l’air atmosphérique.
REMARQUE : La synthèse de pei-PDT est décrite dans la littérature précédemment éditée18. - Incuber les spécimens en acier inoxydable lavés avec 1 % de PEI-PDT. Remplacer l’air par du gaz argon, sceller les flacons étanches à l’air et mélanger sur un shaker à RT pendant 1 h. Soit procéder immédiatement avec la conjugaison peptidique ou stocker à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
2. Fixation et évaluation qualitative/quantitative de la rétention conjuguée de pepCD47 de fluorophore sur la surface métallique utilisant la microscopie et la fluorimétrie de fluorescence
- Laver les coupons de papier d’aluminium ou les disques en maille préparés comme décrit dans la section 1, étapes 1.1-1.10 ci-dessus avec DDW 5x. Transférer les échantillons sur un nouveau flacon et laver avec DDW pour 5x supplémentaires. Enfin laver 2x avec de l’éthanol dégazé et 2x avec du formamide de diméthyle dégazé (DMF).
- Préparer la solution de bouillon pepCD47 conjuguée à la tétraméthylrhodamine (TAMRA) en dissolvant la poudre de pepCD47 conjuguée TAMRA dans du diméthylformamide dégazé (DMF) à une concentration finale de 1 mg/mL. Aliquot la solution d’actions en allotissements de 1 mL. Conserver dans des tubes bien scellés sous atmosphère argon à -20 °C.
- Diluer 1 mg/mL de la solution de stock du pepCD47 conjugué TAMRA à l’aide de DMF dégazé pour préparer les concentrations suivantes de pepCD47 conjugué au fluorophore - 10, 30, 100 et 200 μg/mL.
REMARQUE : Si tamra-conjugué pepCD47 semble être précipité, réduisez le stock TAMRA-conjugué pepCD47 solution utilisant des perles de TCEP dans le rapport 1:1, à RT pendant 20 min. Notez qu’avant d’ajouter le pepCD47 conjugué TAMRA aux perles TCEP, faites tourner la solution de perles TCEP, retirez le supernatant, puis procédez à l’ajout du pepCD47 conjugué TAMRA. - Incuber les coupons de papier d’aluminium modifiés PEI-PDT avec 10, 30, 100 ou 200 μg/mL de pepCD47 conjugué tamra dans des triplicates pour chaque condition sur un shaker à RT sous atmosphère argon pendant 1 heure. Incuber les disques à mailles modifiées PEI-PDT, ainsi que le disque en maille non modifié au-delà de l’étape 1.2 (commandes métalliques nues) avec 100 μg/mL de pepCD47 conjugué TAMRA dans des triplicates à RT sous atmosphère argon sur un shaker pendant 1 h.
REMARQUE : À partir de cette étape, les flacons sont enveloppés dans du papier d’aluminium pour protéger le contenu de la lumière. - Laver les surfaces conjuguées au fluorophore pour enlever le peptide non covalent dans l’ordre suivant : DMF (3x), DMF/DDW à 1:1, DDW (3x), 0.3% SDS en 20 mM Tris pH 7.4 (3x, 5 min chacun à 70 °C sur un shaker), DDW (3x), flacons de changement, et un lavage final de DDW.
- Placez le contrôle et les disques en maille conjugués de façon covalente sur un verre microscope, ajoutez 50 μL de PBS et placez un coverslip. Disques de maille d’image à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé équipé d’un ensemble de filtre rhodamine. Prenez des images représentatives au grossissement 100x.
- Préparer 15 mL de solution TCEP de 12 mg/mL en dissolvant 180 mg de TCEP en mélange 1:1 v/v de méthanol et 0,1 M de tampon acétique.
- Incuber chaque feuille lavée avec 1 mL de solution TCEP sur un shaker à RT pendant 15 min.
- Préparez les normes suivantes en diluant en série le bouillon pepCD47 conjugué tamra (1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0,1 μg/mL et 0,01 μg/mL. Utilisez la solution TCEP comme diluant.
- Analyser le pepCD47 conjugué TAMRA libéré de la surface métallique par rapport à la courbe d’étalonnage générée à l’aide des normes par fluorure à 544/590 nm excitation et longueurs d’onde d’émission.
3. Attacher le pepCD47 humain aux surfaces modifiées de l’Î.-P.-É.
- Laver les échantillons recouverts de P.-É.-P.-É. formulés comme décrit dans la section 1, les étapes 1.1-1.10 ci-dessus, avec le DDW 5x dégazé, changer le flacon et laver avec du DDW 5x dégazé.
- Préparez la solution humaine de stock pepCD47 (1 mg/mL) en dissolvant la poudre humaine de pepCD47 dans l’acide acétique dégazé de 50% pour réaliser une concentration 1 mg/mL.
- Préparer la concentration de travail du pepCD47 humain (100 μg/mL) en dissolvant 500 μL du stock de pepCD47 humain dans 4 500 μL de salin tamponné 1x phosphate dégazé (PBS).
- Incuber les échantillons recouverts de PEI-PDT lavés avec 100 μg/mL de pepCD47 à RT avec secousses pendant 1 h.
- Lavez les échantillons humains recouverts de pepCD47 pour éliminer l’excès de peptide dans l’ordre suivant PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min chacun), DDW (3x), changer les flacons et le lavage final DDW.
REMARQUE : Les surfaces enduites de pepCD47 humain peuvent être conservées à sec à 4 °C jusqu’à 6 mois.
4. Enduire les surfaces modifiées de l’Î.-P.-É. et de la séquence brouillée (Scr)
- Dissoudre la poudre de séquence brouillée dans de l’acide acétique dégazé de 0,1 % pour préparer une solution de stock de 1 mg/mL.
- Préparer une solution de 100 μg/mL de peptide brouillé en dissolvant 500 μL de l’acide acétique dégazé de 4 500 μL.
- Enduire les spécimens lavés de PEI-PDT de 100 μg/mL de peptide brouillé à RT en secouant pendant 1 h.
- Pour éliminer le peptide brouillé non attaché, lavez les surfaces dans l’ordre suivant 0,01 % d’acide acétique (3x), de DDW (3x), de 0,2 % de Tween-20 (3x, 5 min), de DDW (3x), de flacons de changement et d’un lavage DDW.
5. Boucle chandler pour analyser l’attachement cellulaire aux surfaces métalliques
- Enduire les feuilles métalliques (0,65 cm x 1 cm) de pepCD47 humain ou de peptide brouillé selon la description de la section 1 suivie de 3 ou 4.
- Couper les tubes en PVC de 1/4 po en trois morceaux de 38 cm de long.
- Insérez jusqu’à 8 feuilles métalliques modifiées non modifiées, brouillées ou pepCD47 dans trois tubes différents.
- Recueillir 30 mL de sang auprès de donneurs humains en bonne santé exempts de tout médicament anti-plaquettaire selon le protocole institutionnel de la CISR. Précharger la seringue avec 1 mL de citrate de sodium à 4 % pour prévenir la coagulation du sang recueilli.
- Mettez 10 mL de sang dans chaque tube à l’aide d’une seringue de 10 mL et connectez les extrémités avec des adaptateurs métalliques. Placez les tubes remplis de sang sur les roues de l’appareil de boucle Chandler.
- Passez le sang le long des feuilles métalliques par rotation des roues à 37 °C à la vitesse calculée pour produire le cisaillement de 25 dyns/cm2 pendant 4 h.
- Drainer le sang des tubes et éliminer le sang selon les exigences de la CISR.
- Couper les tubes à l’aide du scalpel pour récupérer les feuilles de chaque tube.
- Préparer une solution de glutaraldehyde de 2 % en diluant la solution de glutaraldehyde de 10 ml de 4 % à l’aide de 10 ml de tampon cacodylate de sodium avec du chlorure de sodium de 0,1 M.
- Incuber les feuilles dans une solution de glutaraldehyde à 2 % pendant 15 min et les conserver à 4 °C pendant la nuit. Avant d’analyser, laver les feuilles métalliques 3x avec PBS.
6. Analyser l’attachement cellulaire aux surfaces métalliques à l’aide du colorant CFDA
- Chauffer 8 mL de PBS dans un tube de 15 mL dans un bain d’eau réglé à 37 °C.
- Préparez la solution de colorant CFDA (carboxy-fluorescéine, succinimidyl ester) comme suit - ajouter 90 μL de DMSO à un flacon de colorant CFDA pour atteindre une concentration de stock de 10 mM. Ensuite, préparez la concentration de travail de 93,75 μM en ajoutant 75 μL du stock CFDA à 8 mL de PBS chaud. Mélanger en inversant les tubes à quelques reprises et couvrir le tube de papier d’aluminium.
REMARQUE : Il est conseillé de préparer fraîchement le colorant CFDA avant chaque utilisation. - Incuber chaque feuille avec 1 mL de colorant CFDA dans une assiette de 24 puits. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber la plaque à 37 °C pendant 15 min.
- Laver les feuilles métalliques 3x avec PBS pour enlever l’excès de colorant. Image utilisant le microscope inversé de fluorescence.
7. Fixation des monocytes et expansion du macrophage sur les surfaces métalliques modifiées et nues pepCD47
- Recueillir 10 mL de sang périphérique via l’accès vena cava lors du sacrifice d’un rat Sprague-Dawley mâle de 400-450 g. Mélanger immédiatement avec 1 000 UI d’héparine de sodium pour prévenir la coagulation.
- Pipette 10 mL de dénivelé moyen dans un tube conique de 50 mL. Mélanger le sang avec 5 mL de PBS, et superposer soigneusement le sang dilué sur le milieu de gradient de densité à l’aide d’une pipette Pasteur. Centrifugeuse dans un rotor balançant de seau à 800 x g et 18-25 °C pendant 20 min avec des réglages minimaux d’accélération et de décélération.
- À l’aide d’une pipette Pasteur, recueillir une couche opaque de manteau bouffi sur l’interface entre le plasma et Ficoll. Diluer le pelage bouffi 1:3 avec le PBS et la centrifugeuse à 550 x g et 4 °C pendant 10 min pour polir les cellules du pelage.
- Suspendre à nouveau les cellules du pelage buffy dans 3 mL de tampon de lyse ACK pour contaminer les érythrocytes. Incuber sur la glace pendant 4 min. Ajouter 12 mL de tampon de séparation cellulaire (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
- Centrifugeuse à 550 x g et 4 °C pendant 10 min. Suspendre à nouveau la pastille dans 10 mL de CSB.
- Centrifugeuse à 200 x g et 4 °C pendant 10 min pour éliminer les plaquettes. Répétez deux fois.
- Suspendre à nouveau la pastille dans 500 μL de CSB. Ajoutez 10 μg de chacun des anticorps anti-rats de souris suivants : CD8a (clone OX-8), anti-CD5 (clone OX-19), anti-CD45RA (clone OX-33) et anti-CD6 (clone OX-52).
- Incuber à 4 °C sur un rotateur à tube vertical pendant 1 h. Ajouter 9,5 mL de CSB. Centrifugeuse à 300 x g et 4 °C pendant 10 min. Jeter le supernatant, suspendre à nouveau la pastille dans 10 mL de CSB et répéter la centrifugation.
- Suspendre à nouveau la pastille dans 500 μL de CSB. Ajouter 150 μL de microbilles IgG anti-souris de chèvre. Incuber à 4 °C sur un rotateur à tube vertical pendant 20 min. Ajouter 9,5 mL de CSB. Centrifugeuse à 300 x g et 4 °C pendant 10 min.
- Jeter le surnatant. Suspendre à nouveau la pastille dans 1 mL de CSB.
- Placez une colonne LS dans un séparateur magnétique. Primez la colonne LS avec 3 mL de CSB. Jetez le débit de la colonne. Ajouter 1 mL de granulés cellulaires re-suspendus de l’étape 7.10. Commencez à collecter le débit. Après l’arrêt du débit, ajouter 5 mL de CSB et continuer à recueillir le débit de la colonne jusqu’à ce que le débit s’arrête.
- Centrifugeuse le débit de la colonne (6 mL) contenant des monocytes sélectionnés négativement à 300 x g et 4 °C pendant 10 min. Suspendre à nouveau la petite pastille résultante dans 2 mL de RPMI-1640 moyen complété par 10% FCS, 1% stylo / streptocoque et 100 ng / mL rat macrophage colonie facteur stimulant (M-CSF).
- Comptez les monocytes à l’aide d’hémocytomètre. Ajuster la concentration des monocytes à 5 x 105 cellules/mL.
- Ajouter 1 mL de suspension monocyte aux puits individuels d’une plaque de 12 puits avec les échantillons de papier d’aluminium en acier inoxydable nu (N=3) ou les échantillons d’acier inoxydable modifiés avec le pepCD47 de rat (N=3) selon 1.1-1.10 et 3.1-3.6.
- Changer le milieu les jours 3 et 5 après l’ensemencement. Le jour 6 après l’ensemencement laver les cellules avec PBS et fixer avec 4% de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 15 min. Laver deux fois avec PBS pendant 5 min.
- Retirer les feuilles d’acier inoxydable et les placer individuellement dans une nouvelle plaque de 12 puits. Ne retournez pas les feuilles.
- Incuber en 0,5% Tween-20/PBS pendant 15 min pour perméabiliser les cellules. Laver deux fois avec PBS pendant 5 min.
- Bloquer dans 10% sérum de chèvre / PBS pendant 20 min. Aspirez le sérum. Ne vous lavez pas. Ajouter l’anticorps cd68 anti-rat de souris (dilué 1:100 dans 1%BSA/PBS). Incuber à température ambiante pendant 1 h. Laver 3x en PBS pendant 5 min chacun.
- Ajouter chèvre anti-souris IgG Alexa Fluor 546 (dilué 1:200 en 1% BSA / PBS). Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 45 min. Laver en PBS pendant 5 min. Counterstain avec 1 μg/mL Hoechst 33342 colorant dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min. Laver 3x en PBS pendant 5 min chacun.
- Retournez les feuilles et l’image à l’aide d’un microscope fluorescent avec l’optique inversée. Capturez des images au grossissement 200x avec des paramètres de filtre bleu et rouge.
- Comptez les monocytes ci-joints dans les images individuelles et calculez les moyennes du groupe et les écarts types.
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Representative Results
Les surfaces métalliques sont rendues thiol-réactives pour l’attachement au peptide par une série de modifications chimiques, comme l’illustre la figure 1. L’incubation pabt suivie d’un traitement PEI-PDT rend la surface métallique utilisable pour l’attachement au peptide. Peptide CD47 (pepCD47) contenant des résidus de cystéine à C-terminus joints à la séquence pepCD47 de base par un pont AEEAc double flexible est covalently attaché aux surfaces thiol-réactives par des liaisons de disulfide. En utilisant ce protocole, nous avons démontré que le pepCD47 reste solidement attaché à la surface métallique jusqu’à six mois et peut résister à l’effort physiologique normal de cisaillement et aux procédures de stérilisation17.
La rétention maximale de peptide a été déterminée en appending TAMRA-conjugué pepCD47 à la surface métallique suivie par le lavage étendu pour éliminer le peptide non covalently lié, clivage de TAMRA-pepCD47 par réduction des ponts de disulfide attacher le peptide à la surface, et quantification analytique utilisant un essai fluorimétrique. Plus précisément, des quantités croissantes d’intrants de pepD47 conjugués tamra (1 mL de solution de 10 à 200 μg/mL) ont été annexées aux surfaces enduites de l’Î.-P.-É. et lavées à plusieurs reprises pour éliminer le peptide non lié de façon covalente. La concentration de pepCD47 conjugué tamra covalently lié a été déterminée en utilisant un agent réducteur TCEP pour libérer le peptide covalently attaché et en évaluant sa fluorescence par rapport aux normes. La concentration d’intrants de 10, 30, 100 et 200 μg/mL a démontré la rétention de peptide de 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 et 157 ± 25 ng/cm2 respectivement (figure 2). Ainsi, la densité maximale d’immobilisation du pepCD47 à la surface du métal s’est élevée à environ 180 ng/cm2, ce qui a été réalisé avec une concentration d’intrants de 100 μg/mL. L’immobilisation appropriée du pepCD47 conjugué TAMRA sur les surfaces métalliques modifiées par pabt/PEI-PDT a été corroborée par une microscopie par fluorescence (figure 3) qui a démontré une fluorescence uniforme émise par la surface des disques à mailles conjugués tamra-conjugués par TAMRA47 (figure 3A). Seule une fluorescence minimale a été détectée à la surface des mailles de contrôle qui n’ont pas été modifiées par pabt/PEI-PDT(figure 3B),excluant ainsi un pepCD47 conjugué tamra non spécifiquement lié comme principale source de fluorescence.
Ensuite, nous avons évalué la capacité des surfaces enduites pepCD47 pour empêcher l’attachement aigu de cellules sang-nées par rapport aux surfaces modifiées non modifiées et brouillées de peptide de séquence. Le peptide brouillé a la même composition d’acides aminés que pepCD47 mais dans un ordredifférent 14,17. L’attachement de cellules sang-née a été évalué par rotation du sang des volontaires humains en bonne santé à travers les surfaces modifiées non modifiées, brouillées, et pepCD47 dans l’appareil de boucle de Chandler suivie du lavage pour enlever les cellules non attachées, la fixation, et la coloration avec le colorant de CFDA. Les surfaces ont été visualisées par microscopie de fluorescence. Conformément à nos données précédemment publiées14,17 surfaces enduites pepCD47 montrent une réduction drastique de l’attachement cellulaire transmiss par le sang par rapport aux contrôles brouillés modifiés et non modifiés ( Figure4).
Pour développer les effets de la modification de surface pepCD47 sur l’attachement et la prolifération inflammatoires des cellules, nous avons utilisé l’immunosélection négative des cellules de couches buffy de rat pour isoler les monocytes19, et cultivé les monocytes isolés sur le métal nu et les feuilles d’acier inoxydable modifiées par pepCD47 pendant 6 jours en présence de M-CSF. Les résultats de cette étude montrent une atténuée combinée de 58 % de l’attachement aigu des monocytes, de leur conversion phénotypique en macrophages et de la prolifération des macrophages sur les surfaces fonctionnalisées pepCD47 (figure 5A) par rapport aux commandes métalliques nues (figure 5 B,C).
Figure 1 : Représentation schématique des étapes impliquées dans l’appading pepCD47 aux surfaces métalliques. (A) Les échantillons de métal propre ont été cuits à 220 °C pour oxyder la surface métallique. Les groupes de bisphosphonate du bisphosphonate de polallylamine avec les groupes latents de thiol (PABT) ont formé des liaisons coordonnées avec les oxydes métalliques et enrobent les surfaces métalliques pour former un monocouche fonctionnalisé. Les surfaces métalliques enduites PABT ont été traitées avec TCEP pour la dépprotection des groupes de thiol. ( B )Lastructure de l’Î.-P.-É. -PDT et la représentation symbolique. (C) Les surfaces réduites enduites par PABT et TCEP ont été traitées avec PEI-PDT qui a amplifié le nombre total de groupes thiol-réactifs disponibles pour l’attachement du peptide thiolated. Enfin, les surfaces enduites de PEI-PDT ont été réagies avec des groupes terminals de cystéine de pepCD47, et le peptide a été attaché à la surface par des liaisons de disulfide. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Détermination de la densité d’immobilisation du pepCD47 sur la surface métallique. Des feuilles métalliques de 1 cm x 1 cm ont été modifiées en utilisant des concentrations croissantes (10, 30, 100 et 200 μg/mL) de pepCD47 conjugué au fluorophore. L’excès de peptide a été enlevé à l’aide de plusieurs étapes de lavage, puis traité avec la solution TCEP de 1 mL pour fendre le fluorophore conjugué fluorophore. La concentration du peptide covalently attaché à la surface métallique a été analysée fluorimétriquement à l’aide d’une courbe standard préparée avec des concentrations définies de pepCD47 conjugué fluorophore. La densité d’immobilisation était représentée sous forme de ng/cm² de peptide attaché à la surface métallique. Les données sont exprimées en ± sem et sont représentatives d’au moins trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Imagerie par microscopie par fluorescence de la surface en acier inoxydable modifiée avec pepCD47 conjugué tamra. Des disques en maille en acier inoxydable, modifiés consécutivement avec PABT, TCEP, PEI-PDT (A) ou non modifiés (B) ont été réagis avec tamra-conjugué pepCD47. Les mailles métalliques nues correctement conjuguées et contrôlant ont été largement lavées et photographiées à 100x grossissement. La longueur de la barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Évaluation des fonctions anti-inflammatoires et antithroombotiques aiguës du pepCD47. Des feuilles métalliques de 0,65 cm x 1 cm ont été recouvertes de 100 μg/mL de pepCD47 humain ou de peptide brouillé et exposées au sang dans l’appareil de boucle chandler. Les cellules non liées ont été enlevées en lavant avec PBS et les feuilles ont été fixées dans 2% de glutaraldehyde. Les surfaces modifiées pepCD47 non modifiées, brouillées et humaines ont ensuite été incubées avec le colorant CFDA pendant 15 minutes à 37 °C, lavées avec du PBS et analysées à l’aide d’un microscope à fluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Prévalence des macrophages CD68 positifs sur les surfaces métalliques nues et pepCD47-fonctionnalisées. Des monocytes périphériques de rat blood-derived ont été isolés par centrifugation de densité de gradient suivie de l’immunosélection négative avec des microbilles magnétiques. 5 x 105 monocytes ont été ajoutés dans les puits d’une plaque de 12 puits avec des échantillons de papier d’aluminium en métal nu placés individuellement (N =3) ou les échantillons dérivés avec du pepCD47 de rat. La différenciation de macrophage a été stimulée par 100 ng/ml M-CSF. Six jours après l’ensemencement des cellules ont été fixés, et immuno tachés avec anticorps anti-rat CD68, secondaire Alexa Fluor-546 (rouge) anticorps conjugué et contre-taché avec Hoechst 33342 colorant nucléaire (bleu). Des images représentatives des surfaces du métal nu (A) et du pepCD47 -fonctionnalisé(B)ont été capturées au grossissement de 200x et fusionnées. La longueur de la barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous démontrons et décrivons une stratégie chimique relativement nouvelle pour annexer les moieties thérapeutiques de peptide à une surface en acier inoxydable avec l’objectif global de réduire la réactivité de la surface avec les cellules inflammatoires trouvées dans le sang. La chimie du bisphosphonate décrite dans le ci-après implique la formation de liaisons coordonnées entre les oxydes métalliques et les groupes de bisphosphonate de PABT. L’épaisseur du monomère polybisphosphonate formé sur la surface métallique ne dépasse pas 5 nm18,et, par conséquent, est sans conséquence pour les effets pro-inflammatoires potentiels des revêtements polymères épais20. La dépprotection du groupe latent de thiol dans les chaînes latérales aliphatiques de PABT amorce les surfaces métalliques pour davantage de modification chimique avec des composés thiol-réactifs. Pei-PDT est une polyéthylène ram ram ramée (Mw=25 000 en moyenne) dans laquelle environ 20 % des liaisons éthyleneimine sont modifiées avec des groupes pyridyldithio thiol-réactifs. Étant donné que seule une minorité de groupes pdt de l’Île-du-Prince-Édouard-PDT sont consommés dans la réaction avec les thiols dérivés du PABT, la chimie de surface après l’attache PEI-PDT est changée en thiol-réactif pour permettre l’attachement des peptides thiolés18. Cette stratégie chimique a été développée et largement utilisée dans notre laboratoire pour l’attachement de plusieurs biomolécules, telles que les protéines recombinantes14,peptides14,17, et les vecteurs génétiques viraux18 à la surface métallique. Bien que, pour la plupart de nos travaux, nous avons utilisé des surfaces en acier inoxydable, PABT peut interagir avec d’autres alliagesmétalliques 21 et a donc le potentiel d’améliorer la biocompatibilité et le potentiel thérapeutique d’une large gamme de biomatériaux métalliques.
Notre méthodologie actuelle indique que la densité maximale d’immobilisation du pepCD47 conjugué fluorophore sur les surfaces métalliques est de 180 ng/cm2,ce qui est moins par rapport à nos donnéespubliées précédemment 17. Nous attribuons cet écart aux différentes stratégies de lavage utilisées dans les deux études. Dans notre protocole actuel, nous avons utilisé le SDS qui élimine complètement les peptides non liés de façon covalente par rapport à Tween-20 qui a été utilisé dans nos études initiales. Cependant, 180 ng/cm2 correspond à environ 4 x 106 molécules/μm2 de pepCD47. Cette densité d’immobilisation est beaucoup plus élevée que les niveaux physiologiques de CD47 sur les surfaces cellulaires qui sont d’environ 390 molécules/μm2,22. Ainsi, nous prévoyons que des conditions de lavage rigoureuses n’affecteraient pas significativement les propriétés anti-inflammatoires des surfaces métalliques modifiées pepCD47.
Cette méthodologie d’attachement du pepCD47 au métal est hautement reproductible, mais il y a plusieurs étapes dans le protocole qui ont besoin d’une attention particulière. Tout d’abord, après avoir recouvert la surface métallique de PABT et l’avoir réduit à l’aide du TCEP, les thiols sont sujets à l’oxydation lorsqu’ils sont exposés à l’air. Ainsi, il est de la plus haute importance que les surfaces soient toujours submergées dans de l’eau dégazée. Pour la même raison, la solution PEI-PDT est fabriquée dans de l’eau dégazée et l’argon est ajouté aux flacons pendant l’incubation de feuilles recouvertes de PEI-PDT. Deuxièmement, il faut tenir compte du potentiel de précipitation des peptides solubilisés. PepCD47 a un résidu terminal de cystéine, ainsi que des résidus de cystéine dans la séquence. Ainsi, lorsqu’ils sont mal stockés, il y a une forte possibilité que les peptides polymérisent et précipitent hors de la solution. Pour résoudre ce problème potentiel, il est recommandé de réduire les peptides à l’aide de perles TCEP pendant 20 min à 1 h avant l’incubation avec des surfaces enduites pei-PDT. TCEP aiderait à réduire les peptides et augmenter leur solubilité dans leur diluant respectif. Il est également recommandé de déplacer l’air ambiant avec de l’argon dans les flacons tout en incubant les échantillons recouverts de peptide thiolated de l’Î.-P.-É.
Si les précautions susmentionnées sont suivies, la technique de revêtement est reproductible et la seule limite potentielle pour cette approche est la non-disponibilité commerciale des reagents PABT et PEI-PDT.
Nous avons utilisé un appareil en boucle Chandler pour fournir une preuve ex vivo de l’analyse du concept pour comprendre l’interaction des surfaces métalliques modifiées pepCD47 avec les cellules sanguines et il a été utilisé avec succès par notre laboratoire pour montrer les propriétés anti-inflammatoires des surfaces enduites pepCD4714,15,17,23. Dans cette étude, nous avons utilisé le colorant CFDA que les fluoresces seulement après être entré dans les cellules lorsque les groupes d’acétate du colorant sont fendu par l’esterase intracellulaire. Les avantages de cette procédure de coloration sont qu’il tache les plaquettes anucléées et les globules rouges ainsi que les cellules nucléées telles que les leucocytes. Ainsi, l’utilisation du colorant CFDA fournit une évaluation des propriétés aiguës anti-thrombotiques et antiadhésives des surfaces enduites pepCD47. Une évaluation plus détaillée peut être acquise par microscopie électronique à balayage et/ou immunostaining, que nous avons tous deux détaillé précédemment24. Les résultats de l’étude actuelle valident que les surfaces métalliques enduites de pepCD47 humain sont anti-thrombotiques et antiadhésives par rapport aux commandes de séquence non modifiées et brouillées.
Pour étudier plus en détail si les surfaces pepCD47-modifiées modifient des caractéristiques de croissance des cellules inflammatoires attachées, des feuilles ou des foils en acier inoxydable en métal nu formulés avec pepCD47 ont été exposés aux monocytes isolés de rat en présence du M-CSF syngénéique. Les cellules ont été cultivées dans des conditions stationnaires pendant 6 jours pour permettre la conversion phénotypique et l’expansion des macrophages. Conformément à nos résultats précédents observés dans les différents paramètres expérimentaux14, une diminution profonde du nombre de cellules inflammatoires sur les surfaces fonctionnalisées pepCD47 a été démontrée dans l’étude actuelle.
Ainsi, nos études prouvent en fin de compte que la nouvelle chimie du polybisphosphonate pour le revêtement des métaux avec pepCD47 est un moyen efficace d’améliorer la biocompatibilité des surfaces métalliques et peut être appliquée dans d’autres applications biomédicales, telles que les articulations artificielles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
L’élaboration de protocoles et les études présentées dans le présent document ont été appuyées par le financement R01 des NIH (NBIB) (# EB023921) à la FI et au SJS, et par le financement R01 des NIH (NHLBI) (# HL137762) à if et RJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W.
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
