Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הקלת הדם נישא תא מצורף שתלים מתכת באמצעות CD47 נגזר פפטיד אימוביליזציה

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/61545
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, *1,2, *1,2
1The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לציריפת פפטיד CD47 (pepCD47) סטנטים מתכת באמצעות כימיה פוליביספוספונט. פונקציונליזציה של סטנטים מתכת באמצעות pepCD47 מונע את ההחזקה וההפעלה של תאים דלקתיים ובכך לשפר את תאימות ביולוגית שלהם.

Abstract

הסיבוכים העיקריים הקשורים סטנטים מתכת חשופים סטנטים מבריחים סמים הם restenosis ב סטנט ופקקת סטנט מאוחר, בהתאמה. לכן, שיפור התוואת הביולוגית של סטנטים מתכת נשאר אתגר משמעותי. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר טכניקה חזקה של שינוי פני משטח מתכת על ידי פפטידים פעילים ביולוגית כדי להגביר את תאימות ביולוגית של דם יצירת קשר עם שתלים רפואיים, כולל סטנטים אנדווסקולריים. CD47 הוא סמן אימונולוגי ספציפי למינים של עצמי ויש לו תכונות אנטי דלקתיות. מחקרים הראו כי פפטיד חומצת אמינו 22 המתאים לתחום Ig של CD47 באזור חוץ תאי (pepCD47), יש תכונות אנטי דלקתיות כמו חלבון באורך מלא. במחקרי vivo בחולדות, ובדיקות ויוו לשעבר במערכות ניסוי ארנב ודם אנושי מהמעבדה שלנו הראו כי pepCD47 immobilization על מתכות משפר את תאימות ביולוגית שלהם על ידי מניעת חיבור והפעלה של תאים דלקתיים. נייר זה מתאר את פרוטוקול שלב אחר שלב עבור פונקציונליזציה של משטחי מתכת וקובץ מצורף פפטיד. משטחי מתכת משתנים באמצעות ביספוספט פוליאלילמין עם קבוצות תיול סמוי (PABT) ואחריו פירוק של thiols והגדלה של אתרים תגובתיים תיול באמצעות תגובה עם פוליאתילן מותקן עם קבוצות pyridyldithio (PEI-PDT). לבסוף, pepCD47, שילוב שאריות ציסטאין מסוף המחוברים לרצף פפטיד הליבה באמצעות כפול 8-אמינו-3,6-dioxa-אוקטנויל spacer, מחוברים על פני המתכת באמצעות איגרות חוב disulfide. מתודולוגיה זו של חיבור פפטיד למשטח מתכת היא יעילה וזולת יחסית ולכן ניתן ליישם כדי לשפר את התואם הביולוגי של מספר חומרים ביולוגיים מתכתיים.

Introduction

התערבות כלילית מרדנית היא הקו הראשון של טיפול לטיפול במחלות עורקים כליליים (CAD) וכרוכה בעיקר בסטינג העורקים החולים. עם זאת, restenosis in-סטנט (ISR) ופקקת סטנט הם סיבוכים נפוצים הקשורים פריסת סטנט1. אינטראקציית דם בממשק סטנט הדם מאופיינת בהספיגה כמעט מיידית של חלבוני פלזמה על פני המתכת, ואחריו טסיות דם וחיבור תאי דלקתיותוהפעלה 2. שחרורו של ציטוקינות דלקתיות ו chemokines מתאי דלקתיים מופעלים מוביל לשינוי פנוטיפי של תאי שריר חלק כלי דם (VSMCs) בתקשורת tunica ומפעיל הנדידה הצנטריפטלית שלהם לתא אינטימי. התפשטות VSMC מופעל בתוצאות intima עיבוי שכבה אינטימית, לומן צמצום ו restenosis in-סטנט3. סטנטים לתרופה (DES) פותחו כדי למנוע התפשטות VSMC; עם זאת, תרופות אלה יש השפעה ציטוקסית מחוץ ליעד על תאי אנדותל4,,5. לכן, פקקת סטנט מאוחר הוא סיבוך נפוץ המשויך DES6,7. סטנטים עשויים פולימרים מתכלים, כגון poly-L-lactide הראו הבטחה רבה בניסויים בבעלי חיים וניסויים קליניים ראשוניים, אבל נזכרו בסופו של דבר כאשר השימוש הקליני "בחיים האמיתיים" הפגין נחיתותם 3rd דור DES8. לכן, יש צורך לשפר את התוואת הביולוגית של סטנטים מתכת חשופים לתוצאות טובות יותר של המטופל.

CD47 הוא חלבון transmembrane מבוטא בכל מקום המעכב את התגובה החיסונית המולדת כאשר קשור קולטן הקוניט שלה אות רגולציה חלבון אלפא (SIRPα)9. קולטן SIRPα יש תא חיסוני מעכב טירוסין מוטיב (ITIM) תחום ואת אירועי איתות על SIRPα - אינטראקציה CD47 בסופו של דבר לגרום ל downregulation של הפעלת תאים דלקתיים10,,11,,12,,13. מחקרים במעבדה שלנו הראו כי CD47 רקומביננטי או נגזרת פפטיד שלה, המקביל 22 חומצת אמינו איג תחום של האזור החוץ תאי של CD47 (pepCD47), יכול להפחית את התגובה החיסונית המארח למגוון של חומרים ביולוגייםרלוונטיים קלינית 14,15,,16. לאחרונה, הוכחנו כי pepCD47 יכול להיות משותק למשטחי סטנט נירוסטה ולהפחית באופן משמעותי את התגובה הפתופיזיולוגית הקשורים restenosis. שים לב, pepCD47 משטחים שונה הם מותאים לתנאי שימוש רלוונטיים כגון אחסון לטווח ארוך ועיקור תחמוצת אתילן17. כתוצאה מכך, pepCD47 עשוי להיות יעד טיפולי שימושי כדי לטפל במגבלות הקליניות של סטנטים אנדווסקולריים.

האסטרטגיה עבור ההחזקה הקוולנטית של pepCD47 למשטח מתכת כרוכה בסדרה של שינויים כימיים חדשניים של פני המתכת. משטחי מתכת מצופים תחילה ביספוספונט פוליאלילמין עם קבוצות thiol סמוי (PABT) ואחריו פירוק של thiols וחיבור של פוליאתילן (PEI) עם קבוצות פיריילדיתיו מותקן (PDT). קבוצות PDT של PEI לא קוסם בתגובה עם thiols PABT לא מוגן לאחר מכן מגיבים עם pepCD47 שילוב תיול במסוף שאריות ציסטאין, וכתוצאה מכך pepCD47 מחייב על פני משטח המתכת באמצעות אג"ח disulfide14,17,18. השתמשנו pepCD47 פלואורופור התואם (TAMRA-pepCD47) כדי לקבוע את ריכוז הקלט של פפטיד שתוצאות אי-תנועה המרבית של פני השטח של פפטיד. לבסוף, הערכנו את הקיבולת האנטי דלקתית חריפה וכרונית של משטחי מתכת מצופים pepCD47, ex vivo, באמצעות חלונית לולאה צ'נדלר, וחיבור מונוציט / התרחבות מקרופאג', בהתאמה.

נייר זה מספק פרוטוקול שיטתי לחיבור פפטידים thiolated על פני משטח המתכת; קביעת צפיפות ההשתקה המרבית של הפפטיד; והערכת המאפיינים האנטי דלקתיים של משטחי מתכת מצופים pepCD47 חשופים לדם שלם ומונוציטים מבודדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הדגימות האנושיות לניסוי זה הושגו בהתאם ל-IRB של בית החולים לילדים של פילדלפיה. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור IACUC של בית החולים לילדים של פילדלפיה.

1. ציפוי משטחי מתכת חשופים עם PEI-PDT

  1. לשטוף את קופוני רדיד פלדת אל-חלד (1 ס"מ x 1 ס"מ או 0.65 ס"מ x 1 ס"מ) או דיסקים רשת נירוסטה עם 2-isopropanol בשייקר (60 °C, מהירות של 200 סל"ד) במשך 5 דקות. בצע שלב זה 2x. לאחר מכן לשטוף 2x עם כלורופורם (60 °C, מהירות של 200 סל"ד) עבור 10 דקות כל אחד.
  2. מניחים את דגימות הנירודה הנקיות בתנור ב-220 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. להכין 5 מ"ל של 0.5% של פתרון PABT על ידי המסת 25 מ"ג של ביספוספונט פוליאלילמין עם קבוצות תיול סמוי (PABT) ו 5 מ"ג של אשלגן ביקרבונט (KHCO3)ב 5 מ"ל של DDW ולדגור ב 72 מעלות צלזיוס ב שייקר ב 200 סל"ד במשך 30 דקות.
    הערה: עבור סינתזת PABT עיין בספרות שפורסמה בעבר18.
  4. לטבול את רדידות אפוי או רשת שינוי דיסקים בתמיסה מדומה 0.5% של PABT דגירה שייקר (72 °C, מהירות של 200 סל"ד) עבור 1 שעה.
  5. לשטוף את דגימות PABT שונה עם מים מזוקקים deionized (DDW) עבור 5x, להעביר את הדגימות בבקנה חדשה ולשטוף שוב עם DDW עבור 5x.
  6. להכין סך של 5 מ"ל של פתרון TCEP (12 מ"ג / מ"ל) על ידי המסת 60 מ"ג של Tris (2-carboxyethyl) פוספין הידרוכלוריד (TCEP) ב 5 מ"ל של 0.1 M מאגר אצטי (0.57 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני, 820 מ"ג נתרן אצטט ב 100 מ"ל של DDW).
  7. טפל בדגימות ששונו על-ידי PABT עם TCEP למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר.
    הערה: TCEP משמש כדי להגן על קבוצות thiol.
  8. Degas DDW בקבוקון תחתון עגול באמצעות התקן ייצור ואקום, כגון lyophilizer ולשטוף את רדידות TCEP שטופלו או דיסקים רשת עם DDW degassed עבור 5x. העבר את הדגימות במבען חדש, ובנוסף לשטוף פי 5 עם DDW degassed.
    הערה: זה בעל חשיבות עליונה לעבוד מהר כדי למנוע חמצון של thiols על פני משטח המתכת על ידי חמצן אטמוספרי.
  9. להכין 5 מ"ל של 1% פתרון PEI-PDT על ידי דילול 212.5 μL של מניות PEI-PDT ו 125 μL של 0.4 M נתרן אצטט ב DDW degassed. לבצע שלב 1.9 בו-זמנית עם שלב 1.8 כדי למזער את החשיפה של הדגימות לאוויר אטמוספרי.
    הערה: הסינתזה של PEI-PDT מתוארת בספרות שפורסמה בעבר18.
  10. דגירה דגימות נירוסטה שטופות עם 1% PEI-PDT. החליפו את האוויר בגז ארגון, אטמו את הבקבוקונים היטב ומערבבים על שייקר ב-RT למשך שעה אחת. או להמשיך מיד עם ההתייחדות פפטיד או לאחסן ב 4 ° C עד שבוע אחד.

2. החזקה והערכה איכותית/כמותית של שימור pepCD47 פלואורופור על משטח מתכת באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצנט ופלואורומטריה

  1. לשטוף קופונים רדיד או דיסקים רשת שינוי מוכן כמתואר בסעיף 1, שלבים 1.1-1.10 לעיל עם DDW 5x. העבר את הדגימות למבען חדש ושטוף עם DDW לקבלת פי 5 נוספים. לבסוף לשטוף 2x עם אתנול degassed ו 2x עם degassed דימתיל formamide (DMF).
  2. להכין טטרמתילרודאמין (TAMRA)-conjugated פפסיקה פפסיקה פתרון מניות על ידי המסת אבקת pepCD47 pepCD47 ב- degassed dimethylformamide (DMF) לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. אליקוט פתרון המניות בהקצאות 1 מ"ל. לאחסן בצינורות אטומים היטב תחת אווירת ארגון ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. לדלל 1 מ"ג/מ"ל של פתרון המניות של PEPCD47 בהדפס TAMRA באמצעות DMF degassed כדי להכין את הריכוזים הבאים של pepCD47 פלואורופור - 10, 30, 100, ו 200 μg/mL.
    הערה: אם PEPCD47 tamra-conjugated נראה זירז, להפחית את המניה TAMRA-conjugated pepCD47 פתרון באמצעות חרוזי TCEP ביחס 1:1, ב RT במשך 20 דקות. שים לב כי לפני הוספת pepCD47 התואם-התואם לחרוזי TCEP, לסובב את פתרון חרוזי TCEP, להסיר את supernatant ולאחר מכן להמשיך עם תוספת של pepCD47 TAMRA-conjugated.
  4. דגירה PEI-PST שונה רדיד קופונים עם 10, 30, 100 או 200 μg / מ"ל של pepCD47 בהדפסים tamra-conjugated בשלושה מקרים עבור כל תנאי על שייקר ב RT תחת אווירת ארגון במשך 1 שעה. דגירה PEI-PST שונה רשת דיסקים, כמו גם דיסק רשת שינוי לא השתנה מעבר לשלב 1.2 (פקדי מתכת חשופים) עם 100 μg / מ"ל של pepCD47 tamra-conjugated בשלושה ב RT תחת אווירת ארגון על שייקר במשך 1 שעות.
    הערה: ממדרגה זו ואילך, הבקבוקונים עטופים בנייר אלומיניום כדי להגן על התוכן מפני אור.
  5. לשטוף את המשטחים מצופה pepCD47 פלואורופור כדי להסיר את הפפטיד שאינו מחובר covalentented בסדר הבא: DMF (3x), DMF / DDW ב 1:1, DDW (3x), 0.3% SDS ב- 20 mM Tris pH 7.4 (3x, 5 דקות כל אחד ב- 70 °C על שייקר), DDW (3x), בקבוקונים שינוי, ושטיפה DDW הסופי.
  6. מקם את הבקרה ואת הדיסקים רשת שינוי covalent באופן קוצני על זכוכית מיקרוסקופ, להוסיף 50 μL של PBS ולמקם כיסוי. דיסקים רשת שינוי תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנס הפוך מצויד סט מסנן רודמין. לצלם תמונות מייצגות בהגדלה של פי 100.
  7. להכין 15 מ"ל של 12 מ"ג /מ"ל TCEP פתרון על ידי המסת 180 מ"ג של TCEP ב 1:1 v / v תערובת של מתנול ו 0.1 M מאגר אצטי.
  8. דגירה כל רדיד שטף עם 1 מ"ל של פתרון TCEP על שייקר ב RT במשך 15 דקות.
  9. הכן את הסטנדרטים הבאים על-ידי דילול סדרתי של מניית PEPCD47 (1 מ"ג/מ"ל) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0.1 μg/mL, ו- 0.01 μg/mL. השתמש בפתרון TCEP כדלול.
  10. נתח את pepCD47 המופרך על-ידי TAMRA ששוחרר מפני משטח המתכת כנגד עקומת הכיול שנוצרה באמצעות הסטנדרטים על ידי פלואורימיה ב 544/590 מילימטרים מילימטרים לאורכי גל פליטה.

3. הצמדת pepCD47 אנושי למשטחים מותאמים PEI-PDT

  1. לשטוף PEI-PDT מצופה דגימות ניסח כמתואר בסעיף 1, שלבים 1.1-1.10 לעיל, עם DDW degassed 5x, לשנות את הבקבוקון ולשטוף עם DDW degassed 5x.
  2. להכין פתרון מלאי pepCD47 אנושי (1 מ"ג / מ"ל) על ידי המסת אבקת pepCD47 אדם בחומצה אצטית degassed 50% כדי להשיג ריכוז 1 מ"ג/ מ"ל.
  3. להכין ריכוז עבודה של pepCD47 אנושי (100 μg / מ"ל) על ידי המסת 500 μL של המלאי של pepCD47 אנושי ב 4,500 μL של degassed 1x פוספט חוצץ תמיסת מלח (PBS).
  4. דגירה דגימות מצופה PEI-PDT שטף עם 100 μg / מ"ל של pepCD47 ב RT עם רועד במשך 1 שעות.
  5. לשטוף את הדוגמאות האנושית pepCD47 מצופה כדי להסיר פפטיד עודף בסדר הבא PBS (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 דקות כל אחד), DDW (3x), שינוי בקבוקונים ושטיפה DDW הסופי.
    הערה: משטחים מצופים pepCD47 אנושיים ניתן לאחסן יבש ב 4 ° C עד 6 חודשים.

4. ציפוי משטחי PEI-PDT שונה עם רצף מקושקשות (Scr)

  1. להמיס את אבקת רצף מקושקשת בחומצה אצטית degassed 0.1% כדי להכין פתרון מניות של 1 מ"ג/ מ"ל.
  2. להכין פתרון של 100 μg / מ"ל של פפטיד מקושקשת על ידי המסת 500 μL של ב 4,500 μL של חומצה אצטית degassed 0.1%.
  3. לכסות את דגימות PEI-PDT שטף עם 100 μg / מ"ל של פפטיד מקושקשת ב RT עם רועד במשך 1 שעות.
  4. כדי להסיר פפטיד מקושקשות לא מחובר, שטפו את המשטחים בסדר הבא 0.01% חומצה אצטית (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 דקות), DDW (3x), בקבוקונים שינוי ושטיפה DDW אחת.

5. לולאת צ'נדלר לניתוח חיבור תאי למשטחי מתכת

  1. ציפוי רדידות המתכת (0.65 ס"מ x 1 ס"מ) עם פפסיק47 אנושי או פפטיד מקושקשת לפי התיאור בסעיף 1 ואחריו 3 או 4.
  2. חותכים צינורות PVC "1/4 לשלוש חתיכות באורך 38 ס"מ.
  3. הכנס עד 8 רדיד מתכת לא שונה, מקושקשות או pepCD47 שונה בשלושה צינורות שונים.
  4. לאסוף 30 מ"ל של דם מתורמים אנושיים בריאים ללא כל תרופות נגד טסיות דם לפי פרוטוקול IRB מוסדי. מזרק preload עם 1 מ"ל של 4% נתרן ציטראט כדי למנוע קרישה של דם שנאסף.
  5. לשים 10 מ"ל של דם לתוך כל צינור באמצעות מזרק 10 מ"ל ולחבר את הקצוות עם מתאמי מתכת. שים את הצינורות המלאים בדם על הגלגלים של אפליקציית הלולאה של צ'נדלר.
  6. להעביר את הדם לאורך רדידות מתכת על ידי סיבוב גלגל ב 37 ° C במהירות מחושב כדי לייצר את גימה של 25 dyns / ס"מ2 עבור 4 שעות.
  7. לנקז את הדם מהצינורות ולהיפטר מהדם על פי דרישות IRB.
  8. חותכים את הצינורות באמצעות האזמל כדי לאחזר את הרדידות מכל צינור.
  9. להכין 2% תמיסת גלוטרלדהייד על ידי דילול 10 מ"ל של 4% גלוטרלדהייד פתרון באמצעות 10 מ"ל של נתרן cacodylate מאגר עם 0.1 M נתרן כלוריד.
  10. דגירה רדידות בתמיסת גלוטראלדהייד 2% במשך 15 דקות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לילה. לפני הניתוח, לשטוף את המתכת רדידות 3x עם PBS.

6. ניתוח קובץ מצורף תאי למשטחי מתכת באמצעות צבע CFDA

  1. חם 8 מ"ל של PBS בצינור 15 מ"ל באמבט מים להגדיר 37 מעלות צלזיוס.
  2. להכין את פתרון הצבע CFDA (carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester) כדלקמן - להוסיף 90 μL של DMSO למבחנה אחת של צבע CFDA כדי להשיג ריכוז מלאי של 10 מ"ר. לאחר מכן, להכין את ריכוז העבודה של 93.75 μM על ידי הוספת 75 μL של CFDA המניה ל 8 מ"ל של PBS חם. מערבבים על ידי היפוך הצינורות כמה פעמים ולכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום.
    הערה: מומלץ להכין מחדש את צבע CFDA לפני כל שימוש.
  3. דגירה כל רדיד עם 1 מ"ל של צבע CFDA בצלחת 24 באר. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדגירה את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  4. שוטפים את המתכת מברדות פי 3 עם PBS כדי להסיר צבע עודף. תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנס הפוך.

7. מצורף מונוצייט והרחבת מקרופאג על משטחי מתכת pepCD47 ששונו וחשופים

  1. לאסוף 10 מ"ל של דם היקפי באמצעות גישה קאווה וונה במהלך ההקרבה של 400-450 גרם זכר ספראג-Dawley חולדה. מערבבים מיד עם 1,000 IU של נתרן הפרין כדי למנוע קרישה.
  2. פיפט 10 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית לתוך צינור חסין 50 מ"ל. מערבבים את הדם עם 5 מ"ל של PBS, ובזהירות שכבה מדוללת דם על מדיום הדרגתי צפיפות באמצעות פיפטה פסטר. צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב 800 x g ו 18-25 ° C במשך 20 דקות עם הגדרות מינימליות של האצה והאטה.
  3. באמצעות פיפטה פסטר, לאסוף שכבה אטומה של מעיל באפי על הממשק בין פלזמה Ficoll. דילל מעיל באפי 1:3 עם PBS וצנטריפוגה ב 550 x g ו 4 ° C עבור 10 דקות לתאי מעיל באפי.
  4. להשעות מחדש תאי מעיל באפי ב 3 מ"ל של מאגר lysis ACK כדי lyse אריתרושיטים מזהמים. דגירה על קרח במשך 4 דקות. הוסף 12 מ"ל של מאגר הפרדת תאים (CSB; 0.5% BSA, 0.5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
  5. צנטריפוגה ב-550 x g ו-4°C למשך 10 דקות. x g להשעות מחדש את הכדור ב 10 מ"ל של CSB.
  6. צנטריפוגה ב-200 x g ו-4°C למשך 10 דקות כדי למנוע טסיות דם. x g חזור על זה פעמיים.
  7. להשעות מחדש את הכדור ב 500 μL של CSB. הוסף 10 μg של כל אחד מהנוגדנים הבאים נגד חולדות עכבר: CD8a (משובוט OX-8), אנטי CD5 (משוכפל OX-19), אנטי CD45RA (משוכפל OX-33), ואנטי CD6 (משובוט OX-52).
  8. דגירה ב 4 °C על מסובב צינור אנכי עבור 1 שעה. להוסיף 9.5 מ"ל של CSB. צנטריפוגה ב-300 x g ו-4°C למשך 10 דקות. x g השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של CSB וחזרו על צנטריפוגציה.
  9. להשעות מחדש את הכדור ב 500 μL של CSB. להוסיף 150 μL של מיקרו-חרוזים IgG אנטי-עכבר עז. דגירה ב 4 °C על מסובב צינור אנכי במשך 20 דקות. הוסף 9.5 מ"ל של CSB. צנטריפוגה ב-300 x g ו-4°C למשך 10 דקות. x g
  10. זרוק את הסופרנטנט. להשעות מחדש את הכדור ב 1 מ"ל של CSB.
  11. מקם עמודת LS במפריד מגנטי.  ראש עמודת LS עם 3 מ"ל של CSB. בטל את תפוקת העמודה. הוסף 1 מ"ל של גלולת תא מושהה מחדש מהצעד 7.10. תתחיל לאסוף את התפוקה. לאחר שהזרימה נעצרת, הוסף 5 מ"ל של CSB והמשיך לאסוף את תפוקת העמודה עד שהזרימה תיפסק.
  12. צנטריפוגה בתפוקת העמודה (6 מ"ל) המכילה מונוציטים שנבחרו באופן שלילי ב- 300 x g ו- 4 °C למשך 10 דקות. להשעות מחדש את הכדור הקטן שנוצר ב 2 מ"ל של RPMI-1640 בינוני בתוספת עם 10% FCS, 1% עט / סטרפטוקוקוס ו 100 ng/mL עכברוש מקרופאים מושבת מגרה גורם מגרה (M-CSF).
  13. ספור את המונוציטים באמצעות המוציטומטר. כוונן את ריכוז המונוציט ל- 5 x10 5 תאים/מ"ל.
  14. הוסף 1 מ"ל נפחים של מתלה monocyte לבארות בודדות של צלחת 12 גם עם דגימות רדיד נירוסטה חשופה (N = 3) או דוגמאות נירוסטה שונה עם pepCD47 חולדה (N = 3) לפי 1.1-1.10 ו 3.1-3.6.
  15. שנה את המדיום בימים 3 ו-5 לאחר זריעה. ביום 6 לאחר זריעה לשטוף את התאים עם PBS ולתקן עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות.
  16. הסר את רדידות נירוסטה ולמקם אותם בנפרד לתוך צלחת חדשה 12 באר. אל תהפוך את נייר הכסף.
  17. דגירה ב 0.5% Tween-20/PBS במשך 15 דקות כדי לחלחל לתאים. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות.
  18. לחסום 10% סרום עיזים / PBS במשך 20 דקות. תאטפי את הנסיוב. אל תתרחץ. הוסף נוגדן CD68 נגד עכברים (מדולל 1:100 ב- 1%BSA/PBS). דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לשטוף 3x ב PBS במשך 5 דקות כל אחד.
  19. הוסף עז נגד העכבר IgG אלקסה פלור 546 (מדולל 1:200 ב 1% BSA / PBS). דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. לשטוף PBS במשך 5 דקות. נגד עם 1 μg / מ"ל Hoechst 33342 צבע בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לשטוף 3x ב PBS במשך 5 דקות כל אחד.
  20. הפוך את הרדידות והתמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט עם האופטיקה הפוכה. לכוד תמונות בהגדלה של 200x עם הגדרות מסנן כחול ואדום.
  21. ספור את המונוציטים המצורפים בתמונות הבודדות ותחשב את ממוצעי הקבוצה ואת סטיות התקן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

משטחי מתכת מעובדים thiol-תגובתי עבור חיבור פפטיד באמצעות סדרה של שינויים כימיים, כפי שמוצג איור 1. דגירה PABT ואחריו טיפול PEI-PDT עושה את פני המתכת ניתן לחיבור פפטיד. פפטיד CD47 (pepCD47) המכיל שאריות ציסטאין ב C-terminus הצטרף לרצף פפסיק47 הליבה באמצעות גשר AEEAc כפול גמיש מחובר באופן קוולנטי למשטחים תגובתי תיול באמצעות איגרות חוב disulfide. באמצעות פרוטוקול זה, הוכחנו כי pepCD47 נשאר מחובר באופן יציב על פני משטח המתכת עד שישה חודשים והוא יכול לעמוד בלחץ גימה פיזיולוגי נורמלי והליכי עיקור17.

שימור פפטיד המרבי נקבע על ידי צירוף PEPCD47 TAMRA-conjugated על פני משטח המתכת ואחריו כביסה נרחבת כדי לחסל פפטיד שאינו קשור covalentently, מחשוף של TAMRA-pepCD47 על ידי הפחתת גשרים disulfide לקשר את הפפטיד אל פני השטח, כימות אנליטית באמצעות אסיפת פלואורדי. באופן ספציפי, הגדלת כמויות הקלט של PEPD47 מצופה TAMRA -conjugated (1 מ"ל של 10 - 200 μg / mL פתרון) צורפו PEI-PDT מצופה משטחים ונשטף מספר פעמים כדי להסיר את פפטיד קשור באופן לא קוולנטי. הריכוז של pepCD47 טמרה מאוגד covalented בהתחברות נקבע על ידי שימוש TCEP סוכן הפחתת לשחרר פפטיד מצורף קוולנטיות ולהעריך את הפלואורסצנטיות שלה נגד הסטנדרטים. ריכוז הקלט של 10, 30, 100 ו 200 μg/mL הפגינו שימור פפטיד של 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 ו 157 ± 25 ng/cm2 בהתאמה (איור 2). כך, צפיפות ההשתקה המקסימלית של pepCD47 על פני המתכת נמצאה כ 180 ng/cm2 אשר הושג עם ריכוז קלט של 100 μg/ מ"ל. ההשתקה הנכונה של PEPCD47 TAMRA-conjugated על משטחי מתכת PABT / PEI-PDT שונה אומתה עוד יותר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנט (איור 3) שהפגין פלואורסצנט אחיד הנפלט מפני השטח של TAMRA-conjugated pepCD47 שטופלו בדיסקים רשת(איור 3א). רק פלואורסצנט מינימלי זוהה על פני השטח של רשתות הבקרה שחסר PABT / PEI-PDT שינוי (איור 3B), ובכך להוציא pepCD47 TAMRA-conjugated מחויב באופן ספציפי כמקור העיקרי של פלואורסצנט.

לאחר מכן, הערכנו את היכולת של משטחים מצופים pepCD47 כדי למנוע חיבור תא המועבר בדם חריפה בהשוואה למשטחים פפטיד רצף לא שונה וקוששות. פפטיד לטרוף יש את אותה הרכב חומצת אמינו כמו pepCD47 אבל בסדרשונה 14,17. קובץ המצורף לתא המועבר בדם הוערך על ידי סיבוב של דם ממתנדבים אנושיים בריאים על פני משטחים לא משתנים, מקושקשות, pepCD47 שונה במתקן לולאה צ'נדלר ואחריו כביסה כדי להסיר תאים לא מחוברים, קיבעון, וכתמים עם צבע CFDA. המשטחים היו חזותיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסץ. עולה בקנה אחד עם הנתונים שלנו שפורסמובעבר 14,17 pepCD47 מצופים משטחים מראים ירידה דרסטית בקובץ מצורף תא המועבר בדם בהשוואה לפקדים מקושקשות ששונו ולא שונו(איור 4).

כדי להרחיב על ההשפעות של pepCD47 פני השטח שינוי על קובץ מצורף תאים דלקתיים והתפשטות, השתמשנו בחיסונים שליליים של תאי מעיל באפי חולדה לבודד מונוציטים19, ותרבות מונוציטים מבודדים על מתכת חשופה ונייר כסף נירוסטה שונה pepCD47 במשך 6 ימים בנוכחות M-CSF. תוצאות המחקר מראים התענחות משולבת של 58% של קובץ מצורף חד ציצי, המרה פנוטיפית שלהם מקרופאגים, והתפשטות מקרופאג על pepCD47משטחים פונקציונליים (איור 5A)בהשוואה לפקדי מתכת חשופים(איור 5 B,C).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של השלבים הכרוכים בהוספת pepCD47 למשטחי מתכת. (א)דגימות מתכת נקיות היו אפויים ב 220 מעלות צלזיוס כדי חמצון פני המתכת. קבוצות הביספוספונט של ביספוספונט פולילאמיין עם קבוצות thiol סמוי (PABT) יצרו קשרים מתואמים עם תחמוצות מתכת ולציפוי משטחי מתכת כדי ליצור מונושכבאי פונקציונלי. משטחי מתכת מצופים PABT טופלו עוד יותר עם TCEP עבור פירוק של קבוצות thiol. (ב)המבנה של PEI-PDT וייצוג סמלי. (ג)PABT מצופה TCEP משטחים מופחתים טופלו PEI-PDT אשר הגביר את המספר הכולל של קבוצות תיול-תגובתי זמין לחיבור של פפטיד thiolated. לבסוף, PEI-PDT מצופים משטחים הגיבו עם קבוצות ציסטאין מסוף של pepCD47, ואת הפפטיד היה מחובר לפני השטח באמצעות איגרות חוב disulfide. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: קביעת צפיפות ההשתקה של pepCD47 על משטח מתכת. 1 ס"מ x 1 ס"מ רדידות מתכת שונו באמצעות ריכוזים גוברים (10, 30, 100 ו 200 μg / מ"ל) של pepCD47 פלואורופור. פפטיד עודף הוסר באמצעות מספר שלבי כביסה לאחר מכן טופל עם 1 פתרון TCEP mL כדי ללקט את פלואורופור ההתייחדות. הריכוז של הפפטיד המחובר באופן קוולנטי לפנימת המתכת נותח באופן פלורי באמצעות עקומה סטנדרטית שהוכנה עם ריכוזים מוגדרים של פפסיקים פלואורופור התוצר pepCD47. צפיפות ההתעטשות הוצגה כ-ng/cm² של פפטיד המחובר למשטח המתכת. הנתונים מתבטאים כ± SEM ומייצגים לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הדמיית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של משטח נירוסטה שונה עם pepCD47 בהדפסת TAMRA. דיסקים רשת נירוסטה, שונה ברצף עם PABT, TCEP, PEI-PDT (A) או ללא שינוי (B) הגיבו עם pepCD47 בהתמזגות TAMRA. רשתות המתכת החשופות, המשופשות כהלכה, נשטפו ותמונה בהגדלה של פי 100. אורך סרגל קנה המידה הוא 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 4
איור 4: הערכת פונקציות אנטי דלקתיות ואנטי-טרומבוטיות חריפות של pepCD47. 0.65 ס"מ x 1 ס"מ רדידות מתכת היו מצופים עם 100 μg / מ"ל של פפסיק47 אנושי או פפטיד מקושקשות ונחשף לדם בהנגנון לולאה צ'נדלר. התאים הלא מאוגדים הוסרו על ידי כביסה עם PBS וניירות הכסף תוקנו ב 2% גלוטראלדהייד. המשטחים הלא משתנים, המקושקשות וה-pepCD47 האנושיים שינו אותם, התבססו לאחר מכן עם צבע CFDA במשך 15 דקות ב-37°C, נשטפו ב-PBS וניתחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: שכיחות של מקרופאגים חיוביות CD68 על משטחי מתכת חשופים ופונקציונליים pepCD47. מונוציטים הנגזרים מדם היקפי חולדה היו מבודדים על ידי צנטריפוגה צפיפות הדרגתית ואחריו חיסון שלילי עם microbeads מגנטי. 5 x 105 מונוציטים נוספו לתוך הבארים של צלחת 12 באר עם דגימות רדיד מתכת חשופה בנפרד (N = 3) או הדגימות נגזר עם pepCD47 חולדה. בידול מקרופאג' היה מגורה על ידי 100 ng/ml M-CSF. שישה ימים לאחר זריעת התאים תוקנו, וחיסונים עם נוגדן CD68 נגד חולדה, משני Alexa Fluor-546 (אדום) נוגדן יחד עם Hoechst 33342 צבע גרעיני (כחול). תמונות מייצגות של משטחי המתכת החשופה(A)ו-pepCD47(B)צולמו בהגדלה של פי 200 ומוזגו. אורך סרגל קנה המידה הוא 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מדגימים ומתארים אסטרטגיה כימית חדשנית יחסית לצרף moieties פפטיד טיפולית על משטח נירוסטה במטרה overarching של הפחתת תגובתיות פני השטח עם תאים דלקתיים נמצאו בדם. הכימיה ביספוספונט המתואר בזאת כרוך תיאום היווצרות קשר בין תחמוצות מתכת וקבוצות ביספוספונט של PABT. העובי של מונושכבה פוליביספונט נוצר על פני משטח המתכת אינו עולה על 5 נה"מ18, ולכן, הוא חסר חשיבות עבור ההשפעות proinflammatory פוטנציאלי של ציפויי פולימר עבה20. פירוק של קבוצת תיול סמויה בשרשראות הצד האליפטיות של PABT מקדם את משטחי המתכת לשינוי כימי נוסף עם תרכובות תגובתיות. PEI-PDT הוא פוליאתילן מסועף (Mw ממוצע = 25,000) שבו ~ 20% של קישורי אתילנזין משתנים עם קבוצות pyridyldithio תיול-תגובתי. מאז רק מיעוט של קבוצות PDT ב PEI-PDT נצרכו בתגובה עם thiols נגזר PABT, הכימיה פני השטח לאחר PEI-PDT רצועה משתנה תיול-תגובתי כדי לאפשר חיבור של פפטידים thiolated18. אסטרטגיה כימית זו פותחה ונעשה בה שימוש נרחב במעבדה שלנו לצורך חיבור של מספר ביומולקולות, כגוןחלבונים רקומביננטיים 14,פפטידים 14,,17,וקטורים גנטיים ויראליים 18 אל פני המתכת. למרות, עבור רוב העבודה שלנו השתמשנו משטחי נירוסטה, PABT יכול לקיים אינטראקציה עם סגסוגות מתכתאחרות 21 ולכן יש את הפוטנציאל לשפר את הביו-תואם ואת הפוטנציאל הטיפולי של מגוון רחב של חומרים ביולוגיים מתכתיים.

המתודולוגיה הנוכחית שלנו מצביעה על כך שצפיפות ההשתקה המרבית של pepCD47 פלואורופור על משטחי מתכת היא 180 ng/cm2, וזה פחות בהשוואה לנתונים שלנו שפורסמובעבר 17. אנו מייחסים פער זה לאסטרטגיות השטיפה השונות המשמשות בשני המחקרים. בפרוטוקול הנוכחי שלנו השתמשנו ב-SDS אשר מסיר לחלוטין פפטידים שאינם קשורים באופן קוולנטי בהשוואה ל-Tween-20 ששימש במחקרים הראשוניים שלנו. עם זאת, 180 ng/cm2 מתאים כ 4 x 106 מולקולות / μm2 של pepCD47. צפיפות אי-תנועה זו גבוהה בהרבה מהרמות הפיזיולוגיות של CD47 על משטחי תאים שהם כ-390 מולקולות/μm2,22. לפיכך, אנו צופים כי תנאי כביסה מחמירים לא ישפיעו באופן משמעותי על המאפיינים האנטי דלקתיים של משטחי מתכת שונה pepCD47.

מתודולוגיה זו של קובץ מצורף pepCD47 למתכת הוא מאוד לשחזור, עם זאת ישנם מספר שלבים בפרוטוקול אשר זקוקים לתשומת לב זהירה. ראשית, לאחר ציפוי משטח המתכת עם PABT והפחתתו באמצעות TCEP, thiols נוטים חמצון כאשר נחשפים לאוויר. לכן, יש חשיבות עליונה כי המשטחים תמיד שקועים במים degassed. מאותה סיבה פתרון PEI-PDT מיוצר במים degassed וארגון מתווסף בקבוקונים במהלך הדגירה של רדידות מצופה PEI-PDT. שנית, יש לקחת בחשבון את הפוטנציאל למשקעים של פפטידים solubilized. PepCD47 יש שאריות ציסטאין מסוף, כמו גם שאריות ציסטאין ברצף. לכן, כאשר מאוחסנים שלא כהלכה, קיימת אפשרות גבוהה כי פפטידים polymerize ולזרז מתוך הפתרון. כדי לטפל בבעיה פוטנציאלית זו, מומלץ כי פפטידים יש להפחית באמצעות חרוזי TCEP במשך 20 דקות עד 1 שעות לפני הדגירה עם PEI-PDT מצופה משטחים. TCEP יעזור להפחית את הפפטידים ולהגדיל את המסיסות שלהם דילול בהתאמה שלהם. מומלץ גם לעקור את אוויר הסביבה עם ארגון הבקבוקונים תוך דגירה של PEI-PDT מצופה דגימות עם פפטיד thiolated.

אם אמצעי הזהירות הנ"ל הם אחריו, טכניקת הציפוי היא לשחזור ואת המגבלה הפוטנציאלית היחידה עבור גישה זו היא אי זמינות מסחרית של ריאגנטים PABT ו PEI-PDT.

השתמשנו במערכת לולאה צ'נדלר כדי לספק ex vivo הוכחה של ניתוח מושג כדי להבין את האינטראקציה של pepCD47 משטחי מתכת שונה עם תאי דם וזה שימש בהצלחה על ידי המעבדה שלנו כדי להראות את המאפיינים אנטי דלקתיים של pepCD47מצופים משטחים 14,,15,,17,,23.  במחקר זה, השתמשנו בצבע CFDA כי פלואורסצס רק לאחר הכניסה לתאים כאשר קבוצות אצטט של הצבע הם סקעים על ידי esterase תאי. היתרונות של הליך כתמים זה הם שזה מכתים את טסיות דם anucleated ותאי דם אדומים, כמו גם תאים גרעין כגון לוקוציטים. לכן, ניצול צבע CFDA מספק הערכה של תכונות אנטי טרומבוטיות ואנטי דביקות חריפה של משטחים מצופים pepCD47. הערכה מפורטת יותר ניתן לרכוש באמצעות סריקת מיקרוסקופאלקטרונים ו / או immunostaining, שניהם פירטנו בעבר24. תוצאות המחקר הנוכחי מאשרות כי משטחי המתכת המצופים pepCD47 האנושיים הם אנטי טרומבוטיים ואנטי דבק בהשוואה לפקדי רצף לא מיובשים ומרופלים.

כדי להמשיך לחקור אם pepCD47 שונה משטחים לשנות את מאפייני הצמיחה של תאים דלקתיים מחוברים, רדידות נירוסטה מתכת חשופה או רדידות ניסוח pepCD47 נחשפו מונוציטים חולדה מבודד בנוכחות M-CSF syngeneic. התאים היו תרבותיים בתנאים ניייחים במשך 6 ימים כדי לאפשר המרה פנוטיפית והרחבה של מקרופאגים. בהתאם לתוצאות הקודמות שנצפו בהגדרותהניסוי השונות 14, ירידה עמוקה של מספר תאים דלקתיים על משטחים פונקציונליים pepCD47 הוכח במחקר הנוכחי.

לכן, המחקרים שלנו בסופו של דבר להוכיח כי הכימיה פוליביפוספונט הרומן עבור ציפוי מתכות עם pepCD47 היא דרך יעילה לשיפור הביו-תואם של משטחי מתכת, ניתן ליישם ביישומים ביו רפואיים אחרים, כגון מפרקים מלאכותיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

פיתוח פרוטוקולים מחקרים שהוצגו בנייר זה נתמכו על ידי מימון NIH (NBIB) R01 (# EB023921) ל- IF ו- SJS, ומימון NIH (NHLBI) R01 (# HL137762) ל- IF ו- RJL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris-HCL Invitrogen 15567-027 pH - 7.5
4% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16539-07
4% Sodium Citrate Sigma S5770
ACK lysing buffer Quality Biologicals 118-156-721
anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) Biolegend 202301
anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) Biolegend 203501
anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) BD Biosciences 550979
anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) BioRad MCA341
anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) Biolegend 201701
Chloroform Certified ACS Fisher Chemical C298-500
Dimethyl Formammide (DMF) Alfa Aesar 39117
Embra stainless steel grid Electron Microscopy Sciences E200-SS stainless steel mesh mesh disks
Ficoll Hypaque GE Healthcare 17-1440-02
Glacial acetic acid ACROS organic 148930025
goat anti-mouse IgG Alexa Fluor ThermoFisher A11030
Heparin sodium Sagent Pharmaceuticals 402-01
Human pepCD47 Bachem 4099101
Isopropanol Fisher Chemical A426P-4
Metal adapters Leur Fitting 6515IND 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end
Methanol RICCA chemical company 4829-32
Microscope Nikon Eclipse TE300
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190-136
Pottasium Bicarbonate (KHCO3) Fisher Chemical P184-500
PVC tubes Terumo-CVS 60050 1/4" X 1/16 8'
sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride Electron Microscopy Sciences 11653
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad laboratories 161-0302
Sodum actetate (C2H3NaO2) Alfa Aesar A13184
Src peptide Bachem 4092599
Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen Microgroup, Medway, MA 20097328 1 cm X 6 mm OD
Stainless steel foils (AISI 316L) Goodfellow, Coraopolis, PA 100 mm X 100 mm X 0.05 mm
Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) Bachem 4100277
TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Thermo Scientific PG82089
Tween-20 Bio-Rad laboratories 170-6531
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen V12883

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
  2. van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, Cairo. 392584 (2013).
  3. Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
  4. Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
  5. Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
  6. Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
  7. Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
  8. Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
  9. Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
  10. Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  11. vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  12. Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
  13. Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
  14. Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
  15. Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
  16. Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
  17. Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
  18. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
  19. Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
  20. vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
  21. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
  22. Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
  23. Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
  24. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 166 תפקוד פני השטח מתכת שתלים סטנטים CD47 דלקת פקקת פפטידים ביו-התיחדות
הקלת הדם נישא תא מצורף שתלים מתכת באמצעות CD47 נגזר פפטיד אימוביליזציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Inamdar, V. V., Fitzpatrick, E. G.,… More

Inamdar, V. V., Fitzpatrick, E. G., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J., Fishbein, I. Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization. J. Vis. Exp. (166), e61545, doi:10.3791/61545 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter