Summary
Presentert her er en protokoll for å legge peptid CD47 (pepCD47) til metall stenter ved hjelp av polybisfosfonat kjemi. Funksjonalisering av metallstenter ved hjelp av pepCD47 forhindrer vedlegg og aktivering av inflammatoriske celler og forbedrer dermed deres biokompatibilitet.
Abstract
De viktigste komplikasjonene forbundet med bare metallstenter og legemiddeluttårne er henholdsvis in-stent restenose og sen stenttrombose. Dermed er forbedring av biokompatibiliteten til metallstenter fortsatt en betydelig utfordring. Målet med denne protokollen er å beskrive en robust teknikk for metalloverflatemodifikasjon av biologisk aktive peptider for å øke biokompatibiliteten til blodkontakting av medisinske implantater, inkludert endovaskulære stenter. CD47 er en immunologisk artsspesifikk markør for selv og har antiinflammatoriske egenskaper. Studier har vist at en 22 aminosyre peptid tilsvarer Ig domenet av CD47 i den ekstracellulære regionen (pepCD47), har antiinflammatoriske egenskaper som full lengde protein. In vivo studier på rotter, og ex vivo studier på kanin og humant blod eksperimentelle systemer fra vårt laboratorium har vist at pepCD47 immobilisering på metaller forbedrer deres biokompatibilitet ved å hindre inflammatorisk celle vedlegg og aktivering. Dette papiret beskriver den trinnvise protokollen for funksjonalisering av metalloverflater og peptidtilbehør. Metalloverflatene er modifisert ved hjelp av polylaminbisfosfat med latente tiolgrupper (PABT) etterfulgt av deprotection av tioler og forsterkning av tiolreaktive steder via reaksjon med polyetylenimin installert med pyridyldithio grupper (PEI-PDT). Til slutt, pepCD47, som omfatter terminal cystein rester koblet til kjernen peptid sekvens gjennom en dobbel 8-amino-3,6-didioxa-octanoyl spacer, er festet til metalloverflaten via disulfid bindinger. Denne metodikken for peptidtilbehør til metalloverflaten er effektiv og relativt billig, og kan dermed brukes til å forbedre biokompatibiliteten til flere metalliske biomaterialer.
Introduction
Perkutan koronar intervensjon er den første linjen av terapi for å behandle koronarsykdom (CAD) og innebærer først og fremst stenting de syke arteriene. In-stent restenosis (ISR) og stenttrombose er imidlertid vanlige komplikasjoner forbundet med stentutplassering1. Blodinteraksjon ved blod-stent grensesnittet er preget av en nesten umiddelbar adsorpsjon av plasmaproteiner på metalloverflaten, etterfulgt av blodplate og inflammatorisk cellevedlegg og aktivering2. Utgivelsen av de inflammatoriske cytokinene og kjemokinene fra aktiverte inflammatoriske celler fører til fenotypisk modifisering av vaskulære glatte muskelceller (VSMCer) i tunikamediet og utløser deres sentripetalmigrasjon til det intimale rommet. Spredning av aktivert VSMC i intima resulterer i intimal lag fortykning, lumen innsnevring og in-stent restenosis3. Legemiddeluttet stenter (DES) ble utviklet for å forhindre VSMC-spredning; Disse stoffene har imidlertid en off-target cytotoksisk effekt på endotelcellene4,5. Derfor er sen stenttrombose en vanlig komplikasjon forbundet med DES6,7. Stenter laget av biologisk nedbrytbare polymerer, som poly-L-lactide har vist mye løfte i dyreforsøk og innledende kliniske studier, men ble til slutt tilbakekalt da den "virkelige" kliniske bruken viste deres mindreverdighet til tredjegenerasjon DES8. Derfor er det behov for å forbedre biokompatibiliteten til nakne metallstenter for bedre pasientutfall.
CD47 er et allestedsnærværende uttrykt transmembraneprotein som hemmer den medfødte immunresponsen når det erbundettil sin kognatreseptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα) 9 . SIRPα-reseptoren har et immunsystemcelle tyrosinhemmersomt motiv (ITIM) domene og signalhendelsene på SIRPα - CD47 interaksjon til slutt resultere i nedregulering av inflammatorisk celleaktivering10,11,12,13. Forskning i vårt laboratorium har vist at rekombinant CD47 eller dets peptidderivat, tilsvarende 22 aminosyreN IG-domenet i den ekstracellulære regionen CD47 (pepCD47), kan redusere vertens immunrespons mot en rekke klinisk relevantebiomaterialer 14,,15,,16. Nylig har vi vist at pepCD47 kan immobiliseres til rustfritt stål stent overflater og redusere patofysiologisk respons forbundet med restenose. Vær oppmerksom på at de pepCD47 modifiserte overflatene er mottagelige for relevante bruksforhold som langsiktig lagring og etylenoksidsterilisering17. For dette formål kan pepCD47 være et nyttig terapeutisk mål for å løse de kliniske begrensningene av endovaskulære stenter.
Strategien for kovalent vedlegg av pepCD47 til en metalloverflate innebærer en rekke nye kjemiske modifikasjoner av metalloverflaten. Metalloverflatene er først belagt med polylaminbisfosfonat med latente tiolgrupper (PABT) etterfulgt av debeskyttelse av tioler og vedlegg av polyetylenimin (PEI) med installerte pyridyldithiogrupper (PDT). PDT grupper av PEI upontbyrdet i reaksjonen med debeskyttede PABT thiols blir deretter reagert med pepCD47 inkorporere thiols i terminalen cystein rester, noe som resulterer i binding pepCD47 til metalloverflaten via en disulfid bånd14,17,18. Vi brukte en fluoroforkonjugert pepCD47 (TAMRA-pepCD47) for å bestemme inngangskonsentrasjonen av peptid som resulterer i maksimal overflateimmobilisering av peptidet. Til slutt evaluerte vi den akutte og kroniske antiinflammatoriske kapasiteten til de pepCD47-belagte metallflatene, ex vivo, ved hjelp av Chandler-sløyfeapparatet og monocytttilbehør / makrofagutvidelsesanalyse.
Dette papiret gir en systematisk protokoll for vedlegg av thiolated peptider til metalloverflaten; bestemme den maksimale immobiliseringstettheten av peptidet; og vurdere de antiinflammatoriske egenskapene til pepCD47 belagte metalloverflater utsatt for fullblod og isolerte monocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menneskelige prøver for dette eksperimentet ble innhentet i samsvar med IRB av Children's Hospital of Philadelphia. Alle dyreforsøk ble utført ved godkjenning fra IACUC ved Children's Hospital of Philadelphia.
1. Belegg nakne metalloverflater med PEI-PDT
- Vask rustfritt stål folie kuponger (1 cm x 1 cm eller 0,65 cm x 1 cm) eller rustfritt stål mesh disker med 2-isopropanol i en shaker (60 ° C, hastighet på 200 rpm) i 5 min. Utfør dette trinnet 2x. Vask deretter 2x med kloroform (60 °C, hastighet på 200 o/min) i 10 min hver.
- Plasser de rensede prøvene i rustfritt stål i ovnen ved 220 °C i 30 min.
- Forbered 5 ml pabt oppløsning ved å oppløse 25 mg polylamin bisfosfonat med latente tiolgrupper (PABT) og 5 mg kaliumbikarbonat (KHCO3) i 5 ml DDW og inkuber ved 72 °C i en shaker ved 200 o/min.
MERK: For PABT-syntese refererer du til tidligere publisert litteratur18. - Senk bakt folier eller nettingskivene i 0,5 % vandig oppløsning av PABT og inkuber i en shaker (72 °C, hastighet på 200 o/min) i 1 time.
- Vask pabt-modifiserte prøver med deionisert destillert vann (DDW) for 5x, overfør prøvene i et nytt hetteglass og vask igjen med DDW for 5x.
- Forbered totalt 5 ml TCEP-oppløsning (12 mg/ml) ved å oppløse 60 mg Tris (2-karboksyetyl) fosforhydroklorid (TCEP) i 5 ml 0,1 M eddikbuffer (0,57 ml glacial eddiksyre, 820 mg natriumacetat på 100 ml DDW).
- Behandle PABT-modifiserte prøver med TCEP i 15 min ved romtemperatur (RT) på en shaker.
MERK: TCEP brukes til å debeskytte thiolgruppene. - Degas DDW i en rund bunnkolbe ved hjelp av en vakuumgenererende enhet, for eksempel en lyofilisator og vask TCEP-behandlede folier eller nettingskivene med avgassede DDW for 5x. Overfør prøvene i et nytt hetteglass, og vask i tillegg 5x med avgassede DDW.
MERK: Det er viktig å arbeide raskt for å forhindre oksidasjon av tioler på metalloverflaten ved atmosfærisk oksygen. - Klargjør 5 ml 1 % PEI-PDT-oppløsning ved å fortynne 212,5 μL lager PEI-PDT og 125 μL på 0,4 M natriumacetat i avgassed DDW. Utfør trinn 1.9 samtidig med trinn 1.8 for å minimere eksponeringen av prøvene for atmosfærisk luft.
MERK: Syntesen av PEI-PDT er beskrevet i tidligere publisert litteratur18. - Inkuber de vasket prøvene i rustfritt stål med 1 % PEI-PDT. Skift ut luft med argongass, forsegle hetteglassene lufttett og bland på en shaker ved RT i 1 time. Enten fortsett umiddelbart med peptidbedømmingen eller oppbevar ved 4 °C opptil 1 uke.
2. Feste og kvalitativ/kvantitativ vurdering av fluoroforkonjugert pepCD47 retensjon på metalloverflaten ved hjelp av fluorescensmikroskopi og fluorimetry
- Vask folie kuponger eller mesh disker utarbeidet som beskrevet i avsnitt 1, trinn 1.1-1.10 ovenfor med DDW 5x. Overfør prøvene til et nytt hetteglass og vask med DDW for ytterligere 5x. Vask til slutt 2x med avgasset etanol og 2x med avgasset dimetylformamid (DMF).
- Klargjør tetrametylrhodamin (TAMRA)-konjugert pepCD47 lagerløsning ved å oppløse TAMRA-konjugert pepCD47 pulver i avgasset dimetylformamid (DMF) til en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml. Aliquot lagerløsningen i 1 ml tildelinger. Oppbevares i godt forseglede rør under argonatmosfære ved -20 °C.
- Fortynn 1 mg/ml av lageroppløsningen av TAMRA-konjugert pepCD47 ved hjelp av avgassede DMF for å forberede følgende konsentrasjoner av fluoroforkonjugert pepCD47 - 10, 30, 100 og 200 μg/ml.
MERK: Hvis TAMRA-konjugert pepCD47 ser ut til å være utfellt, kan du redusere den TAMRA-konjugerte pepCD47-oppløsningen ved hjelp av TCEP-perler i forholdet 1:1 ved RT i 20 min. Merk at før du legger til TAMRA-konjugert pepCD47 til TCEP perler, spinne TCEP perler løsning, fjerne supernatant og deretter fortsette med tillegg av TAMRA-konjugert pepCD47. - Inkuber PEI-PDT modifisert folie kuponger med 10, 30, 100 eller 200 μg / ml TAMRA-konjugert pepCD47 i triplicates for hver tilstand på en shaker ved RT under argon atmosfære i 1 time. Inkuber PEI-PDT modifiserte mesh-disker, samt mesh-disk som ikke er modifisert utover trinn 1.2 (bare metallkontroller) med 100 μg/ml TAMRA-konjugert pepCD47 i triplicates ved RT under argon atmosfære på en shaker i 1 time.
MERK: Fra dette trinnet og utover er hetteglassene pakket inn i aluminiumsfolie for å beskytte innholdet mot lys. - Vask de fluorologiske konjugerte pepCD47-belagte overflatene for å fjerne det ikke-kovalent festet peptidet i følgende rekkefølge: DMF (3x), DMF/DDW kl. DDW (3x), 0,3 % SDS i 20 mM Tris pH 7,4 (3x, 5 min hver ved 70 °C på en shaker), DDW (3x), bytte hetteglass og en endelig DDW vask.
- Plasser kontroll og kovalent konjugert mesh-disker på et mikroskopglass, tilsett 50 μL PBS og plasser en dekkslips. Bildenettskivene ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop utstyrt med et rhodaminfiltersett. Ta representative bilder på 100x forstørrelse.
- Forbered 15 ml 12 mg/ml TCEP-oppløsning ved å oppløse 180 mg TCEP i 1:1 v/v blanding av metanol og 0,1 M eddikbuffer.
- Inkuber hver vasket folie med 1 ml TCEP-oppløsning på en shaker ved RT i 15 min.
- Klargjør følgende standarder ved å fortyte TAMRA-konjugert pepCD47 lager (1 mg/ml) – 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml, 0,1 μg/ml og 0,01 μg/ml. Bruk TCEP-oppløsningen som fortynningsmiddel.
- Analyser den TAMRA-konjugerte pepCD47 som frigjøres fra metalloverflaten mot kalibreringskurven som genereres ved hjelp av standardene ved fluorimetri ved 544/590 nm eksitasjon og utslippsbølgelengder.
3. Feste menneskelig pepCD47 til PEI-PDT modifiserte overflater
- Vask PEI-PDT-belagte prøver formulert som beskrevet i avsnitt 1, trinn 1.1-1.10 ovenfor, med avgassede DDW 5x, endre hetteglasset og vask med avgassedE DDW 5x.
- Forbered human pepCD47 lageroppløsning (1 mg/ml) ved å oppløse humant pepCD47 pulver i avgasset 50 % eddiksyre for å oppnå en konsentrasjon på 1 mg/ml.
- Forbered arbeidskonsentrasjonen av human pepCD47 (100 μg/ml) ved å oppløse 500 μL av bestanden av human pepCD47 i 4500 μL av avgasset 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Inkuber de vasket PEI-PDT-belagte prøvene med 100 μg/ml pepCD47 ved RT med risting i 1 time.
- Vask de menneskelige pepCD47-belagte prøvene for å fjerne overflødig peptid i følgende rekkefølge PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min hver), DDW (3x), endre hetteglass og endelig DDW vask.
MERK: Humane pepCD47-belagte overflater kan oppbevares tørre ved 4 °C i opptil 6 måneder.
4. Belegg pei-PDT modifiserte overflater med kryptert sekvens (Scr)
- Oppløs det krypterte sekvenspulveret i avgassert 0,1 % eddiksyre for å lage en lagerløsning på 1 mg/ml.
- Forbered en oppløsning på 100 μg/ml kryptert peptid ved å oppløse 500 μL av de i 4500 μL av avgasset 0,1 % eddiksyre.
- Belegg de vasket PEI-PDT-prøvene med 100 μg/ml kryptert peptid ved RT med risting i 1 time.
- For å fjerne ufestet eggeren peptid, vask overflatene i følgende rekkefølge 0,01% eddiksyre (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), endre hetteglass og en DDW vask.
5. Chandler loop for å analysere cellulære vedlegg til metalloverflater
- Coat metallfoliene (0,65 cm x 1 cm) med enten menneskelig pepCD47 eller kryptert peptid i henhold til beskrivelsen på avsnitt 1 etterfulgt av 3 eller 4.
- Skjær 1/4" PVC rør i tre 38 cm lange stykker.
- Sett inn opptil 8 umodifiserte, krypterte peptid eller pepCD47 modifiserte metallfolie i tre forskjellige rør.
- Samle 30 ml blod fra friske menneskelige donorer uten noen anti-blodplate medisiner i henhold til institusjonell IRB-protokollen. Preload sprøyte med 1 ml av 4% natriumsitrat for å hindre koagulasjon av samlet blod.
- Sett 10 ml blod i hvert rør ved hjelp av en 10 ml sprøyte og koble endene med metalladaptere. Plasser de blodfylte rørene på hjulene på Chandler loop-apparatet.
- Pass blodet langs metallfoliene ved hjulrotasjon ved 37 °C med hastigheten beregnet for å produsere skjær på 25 dyner/cm2 i 4 timer.
- Tøm blodet fra rørene og kast blodet i henhold til IRB-kravene.
- Klipp rørene ved hjelp av skalpell for å hente foliene fra hvert rør.
- Forbered 2 % glutaraldehydoppløsning ved å fortynne 10 ml 4 % glutaraldehydoppløsning ved hjelp av 10 ml natriumkacodylatbuffer med 0,1 M natriumklorid.
- Inkuber foliene i 2% glutaraldehyd oppløsning i 15 min og oppbevar ved 4 °C over natten. Før du analyserer, vask metallfoliene 3x med PBS.
6. Analysere cellulært feste til metalloverflater ved hjelp av CFDA-fargestoff
- Varm 8 ml PBS i 15 ml rør i et vannbad sett til 37 °C.
- Forbered CFDA (karboksy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester) fargestoff løsning som følger - tilsett 90 μL DMSO til ett CFDA fargestoff hetteglass for å oppnå en lagerkonsentrasjon på 10 mM. Deretter klargjør arbeidskonsentrasjonen på 93,75 μM ved å tilsette 75 μL av lager CFDA til 8 ml varm PBS. Bland ved å invertere rørene et par ganger og dekk røret med aluminiumsfolie.
MERK: Det anbefales å forberede CFDA-fargestoffet før hver bruk. - Inkuber hver folie med 1 ml CFDA-fargestoff i en 24 brønnplate. Dekk platen med aluminiumsfolie og inkuber platen ved 37 °C i 15 min.
- Vask metallfoliene 3x med PBS for å fjerne overflødig fargestoff. Bilde ved hjelp av invertert fluorescensmikroskop.
7. Monocytttilbehør og makrofagutvidelse på de pepCD47-modifiserte og nakne metallflatene
- Samle 10 ml perifert blod via vena cava tilgang under ofringen av en 400-450 g mannlig Sprague-Dawley rotte. Bland umiddelbart med 1000 IE natrium heparin for å forhindre koagulasjon.
- Pipette 10 ml tetthetsgradientmedium i et konisk rør på 50 ml. Bland blodet med 5 ml PBS, og lag forsiktig fortynnet blod over tetthetsgradientmediet ved hjelp av en Pasteurpipette. Sentrifuge i en svingende bøtterotor ved 800 x g og 18-25 °C i 20 min med minimale innstillinger for akselerasjon og retardasjon.
- Bruk en Pasteur pipette, samle et ugjennomsiktig lag av buffy pels på grensesnittet mellom plasma og Ficoll. Fortynn buffy coat 1:3 med PBS og sentrifuge ved 550 x g og 4 °C i 10 min til buffy coat celler.
- Re-suspend buffy pels celler i 3 ml ACK lysis buffer til lyse forurensende erytrocytter. Inkuber på is i 4 min. Legg til 12 ml celleseparasjonsbuffer (CSB; 0,5 % BSA, 0,5 % FBS, 2 mM EDTA/PBS).
- Sentrifuge ved 550 x g og 4 °C i 10 min. Re-suspendere pellet i 10 ml CSB.
- Sentrifuge ved 200 x g og 4 °C i 10 min for å eliminere blodplater. Gjenta to ganger.
- Suspender pelleten igjen i 500 μL CSB. Tilsett 10 μg av hver av følgende mus anti-rotte antistoffer: CD8a (klone OX-8), anti-CD5 (klone OX-19), anti-CD45RA (klone OX-33), og anti-CD6 (klone OX-52).
- Inkuber ved 4 °C på en vertikal rørrotator i 1 time. Tilsett 9,5 ml CSB. Sentrifuge ved 300 x g og 4 °C i 10 min. Kast supernatant, re-suspendere pellet i 10 ml CSB og gjenta sentrifugering.
- Suspender pelleten igjen i 500 μL CSB. Tilsett 150 μL geit anti-mus IgG mikroperler. Inkuber ved 4 °C på en vertikal rørrotator i 20 min. Tilsett 9,5 ml CSB. Sentrifuge ved 300 x g og 4 °C i 10 min.
- Kast det overnaturlige. Re-suspendere pellet i 1 ml CSB.
- Plasser en LS-kolonne i en magnetisk separator. Prime LS-kolonnen med 3 ml CSB. Forkast kolonnegjennomstrømmingen. Legg til 1 ml re-suspendert cellepellet fra trinn 7.10. Begynn å samle gjennomstrømningen. Når flyten stopper, legger du til 5 ml CSB og fortsetter å samle inn kolonnegjennomstrømningen til strømmen stopper.
- Sentrifuger kolonnegjennomstrømningen (6 ml) som inneholder negativt utvalgte monocytter ved 300 x g og 4 °C i 10 min. Re-suspendere den resulterende lille pellet i 2 ml RPMI-1640 medium supplert med 10% FCS, 1% penn / strep og 100 ng / ml rotte makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF).
- Tell monocytter ved hjelp av hemocytometer. Juster monocyttkonsentrasjonen til 5 x10 5 celler/ml.
- Tilsett 1 ml volumer monocytt suspensjon til de enkelte brønnene av en 12 brønnplate med de nakne rustfritt stål folie prøver (N = 3) eller rustfritt stål prøver modifisert med rotte pepCD47 (N = 3) i henhold til 1,1-1,10 og 3,1-3,6.
- Endre mediet på dag 3 og 5 etteråing. På dag 6 etter såing vaske cellene med PBS og fikse med 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 15 min. Vask to ganger med PBS i 5 min.
- Fjern foliene i rustfritt stål og legg dem individuelt i en ny 12 brønnplate. Ikke snu foliene.
- Inkuber i 0,5% Tween-20/PBS i 15 min for å gjennomsyre cellene. Vask to ganger med PBS i 5 min.
- Blokker i 10% geitserum / PBS i 20 min. Aspirerer serumet. Ikke vask. Legg til mus anti-rotte CD68 antistoff (fortynnet 1:100 i 1% BSA / PBS). Inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask 3x i PBS i 5 min hver.
- Legg geit anti-mus IgG Alexa Fluor 546 (fortynnet 1:200 i 1% BSA / PBS). Inkuber i mørket ved romtemperatur i 45 min. Vask i PBS i 5 min. Konstain med 1 μg/ml Hoechst 33342 fargestoff i mørket ved romtemperatur i 10 min. Vask 3x i PBS i 5 min hver.
- Vend foliene og bildet ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med invertert optikk. Ta bilder med 200x forstørrelse med blå og røde filterinnstillinger.
- Telle vedlagte monocytter i de enkelte bildene og beregnet gruppegjennomsnittene og standardavvikene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metalloverflatene gjengis tiolreaktive for peptidtilbehør via en rekke kjemiske modifikasjoner, som vist i figur 1. PABT inkubasjon etterfulgt av PEI-PDT behandling gjør metalloverflaten mottagelig for peptid vedlegg. Peptid CD47 (pepCD47) som inneholder cysteinrester ved C-terminus som er koblet til kjernepepCD47-sekvensen gjennom en fleksibel dobbel AEEAc-bro er kovalent festet til de tiolreaktive overflatene via disulfidbindinger. Ved hjelp av denne protokollen har vi vist at pepCD47 forblir stabilt festet til metalloverflaten i opptil seks måneder og tåler normale fysiologiske skjærstress og steriliseringsprosedyrer17.
Maksimal peptid oppbevaring ble bestemt ved å legge TAMRA-konjugert pepCD47 til metalloverflaten etterfulgt av omfattende vask for å eliminere ikke-kovalent bundet peptid, spalting av TAMRA-pepCD47 ved reduksjon av disulfid broer tethering peptid til overflaten, og analytisk kvantifisering ved hjelp av en fluor analyse. Spesielt ble økende inngangsmengder av TAMRA-konjugert pepD47 (1 ml 10 - 200 μg/ml oppløsning) lagt til PEI-PDT-belagte overflater og vasket flere ganger for å fjerne det ikke-kovalent bundne peptidet. Konsentrasjonen av kovalent bundet TAMRA-konjugert pepCD47 ble bestemt ved hjelp av et reduksjonsmiddel TCEP for å frigjøre kovalent festet peptid og vurdere fluorescensen mot standardene. Inngangskonsentrasjonen på henholdsvis 10, 30, 100 og 200 μg/ml viste peptidoppbevaring på henholdsvis 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 og 157 ± 25 ng/cm2 (figur 2). Dermed ble den maksimale immobiliseringstettheten av pepCD47 på metalloverflaten funnet å være ca. 180 ng/cm2 som ble oppnådd med en inngangskonsentrasjon på 100 μg/ml. Riktig immobilisering av TAMRA-konjugert pepCD47 på PABT/PEI-PDT-modifiserte metalloverflater ble ytterligere bekreftet av fluorescensmikroskopi (figur 3) som viste en jevn fluorescens som slippes ut fra overflaten av TAMRA-konjugert pepCD47-behandlet mesh-disker (figur 3A). Bare minimal fluorescens ble oppdaget på overflaten av kontrollmaskene som manglet PABT/PEI-PDT-modifikasjon (figur 3B), og dermed unntatt en ikke-spesifikt bundet TAMRA-konjugert pepCD47 som hovedkilde til fluorescens.
Deretter evaluerte vi evnen til pepCD47-belagte overflater for å forhindre akutt blodbåren celletilbehør sammenlignet med de umodifiserte og krypterte sekvenspeptidmodifiserte overflatene. Den scramble peptid har samme aminosyre sammensetning som pepCD47, men i en annen rekkefølge14,17. Det blodbårne cellevedlegget ble evaluert ved rotasjon av blod fra friske menneskelige frivillige på tvers av umodifiserte, krypterte og pepCD47 modifiserte overflater i Chandler loop-apparatet etterfulgt av vask for å fjerne ufestede celler, fiksering og farging med CFDA-fargestoff. Overflatene ble visualisert ved fluorescensmikroskopi. I samsvar med våre tidligere publiserte data14,,17 pepCD47 belagte overflater viser en drastisk reduksjon i blodbårne celle vedlegg i forhold til kryptert modifisert og uendret kontroller (Figur 4).
For å utvide effekten av pepCD47 overflatemodifisering på inflammatorisk celletilbehør og spredning, brukte vi negativ immunvalg av rottebuffy coat celler for å isolere monocytter19, og kultivert de isolerte monocytter på bart metall og pepCD47-modifisert rustfritt stål folier i 6 dager i nærvær av M-CSF. Resultatene av denne studien viser en kombinert 58% demping av akutt monocytt vedlegg, deres fenotypisk konvertering til makrofager, og makrofag spredning på pepCD47 funksjonaliserte overflater (Figur 5A) sammenlignet med bare metall kontroller (Figur 5 B, C).
Figur 1: Skjematisk representasjon av trinnene som er involvert i å legge pepCD47 til metalloverflater. (A)De rene metallprøvene ble bakt ved 220 °C for å oksidere metalloverflaten. Bisfosfonatgruppene av polallylaminbisfosfonat med latente tiolgrupper (PABT) dannet koordinerte bindinger med metalloksidene og belegg metallflatene for å danne et funksjonalisert monolag. PABT-belagte metalloverflater ble videre behandlet med TCEP for deprotection av thiolgruppene. (B)Strukturen av PEI-PDT og symbolsk representasjon. (C)PABT-belagte og TCEP reduserte overflater ble behandlet med PEI-PDT som forsterket det totale antallet tiolreaktive grupper tilgjengelig for vedlegg av det thiolated peptidet. Til slutt ble PEI-PDT-belagte overflater reagert med terminale cysteingrupper av pepCD47, og peptidet ble festet til overflaten via disulfidbindinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bestemme immobiliseringstettheten av pepCD47 på metalloverflaten. 1 cm x 1 cm metallfolie ble modifisert ved hjelp av økende konsentrasjoner (10, 30, 100 og 200 μg/ml) av fluoroforkonjugert pepCD47. Overflødig peptid ble fjernet ved hjelp av flere vasketrinn deretter behandlet med 1 ml TCEP løsning for å holde fluorofor konjugert fluorofor. Konsentrasjonen av peptidkovalent festet til metalloverflaten ble analysert fluoristisk ved hjelp av en standardkurve tilberedt med definerte konsentrasjoner av fluoroforkonjugert pepCD47. Immobiliseringstettheten var representert som ng/cm² peptid festet til metalloverflaten. Data uttrykkes som ± SEM og er representativ for minst tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescensmikroskopi avbildning av rustfritt stål overflaten modifisert med TAMRA-konjugert pepCD47. Rustfritt stål mesh disker, etter hverandre modifisert med PABT, TCEP, PEI-PDT (A) eller uendret (B) ble reagert med TAMRA-konjugert pepCD47. De riktig konjugert og kontroll nakne metallnett ble omfattende vasket og avbildet ved 100x forstørrelse. Skalalinjen lengde er 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Evaluering av akutte antiinflammatoriske og antitrombotiske funksjoner av pepCD47. 0,65 cm x 1 cm metallfolie ble belagt med 100 μg/ml enten humant pepCD47 eller kryptert peptid og eksponert for blod i Chandler-sløyfeapparatet. De ubundne cellene ble fjernet ved vask med PBS og foliene ble festet i 2% glutaraldehyd. De umodifiserte, krypterte modifiserte og menneskelige pepCD47 modifiserte overflatene ble deretter inkubert med CFDA-fargestoffet i 15 minutter ved 37 °C, vasket med PBS og analysert ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: En prevalens av CD68-positive makrofager på de nakne og pepCD47-funksjonaliserte metallflatene. Rotte perifere blodavledede monocytter ble isolert ved gradient tetthet sentrifugasjon etterfulgt av negativ immunvalg med magnetiske mikroperler. 5 x 105 monocytter ble lagt inn i brønnene på en 12 brønnplate med individuelt plasserte nakne metallfolieprøver (N = 3) eller prøvene derivatisert med rotte pepCD47. Makrofagdilatering ble stimulert av 100 ng/ml M-CSF. Seks dager etter såing cellene ble løst, og immunostained med anti-rotte CD68 antistoff, sekundær Alexa Fluor-546 (rød) konjugert antistoff og motvirket med Hoechst 33342 kjernefysisk fargestoff (blå). Representative bilder av de nakne metall (A) og pepCD47-funksjonaliserte (B) overflater ble tatt på 200x forstørrelse og fusjonert. Skalalinjen lengde er 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer og beskriver en relativt ny kjemisk strategi for å legge terapeutisk peptid moieties til en rustfritt stål overflate med det overordnede målet om å redusere overflatens reaktivitet med inflammatoriske celler som finnes i blod. Bisfosfonatkjemien som er beskrevet her, innebærer koordinering av bindingsdannelse mellom metalloksider og bisfosfonatgrupper av PABT. Tykkelsen av polybisfosfonat monolag dannet på metalloverflaten overstiger ikke 5 nm18, og er derfor ubetydelig for de potensielle proinflammatoriske effektene av de tykke polymerbelegg20. Deprotection av latent thiol gruppe i alifatiske sidekjeder av PABT primes metalloverflater for ytterligere kjemisk modifikasjon med tiol-reaktive forbindelser. PEI-PDT er forgrenet polyetylenimin (gjennomsnittlig Mw = 25.000) der ~ 20% av etylenimine koblinger er modifisert med thiol-reaktive pyridyldithio grupper. Siden bare et mindretall av PDT-grupper i PEI-PDT forbrukes i reaksjonen med PABT-avledede tioler, endres overflatekjemien etter PEI-PDT-tilknytning til tiolreaktiv for å muliggjøre vedlegg av thiolated peptider18. Denne kjemiske strategien ble utviklet og mye brukt i vårt laboratorium for vedlegg av flere biomolekyler, for eksempel rekombinanteproteiner 14,peptider14,,17og virale genvektorer18 til metalloverflaten. Selv om PABT for det meste av arbeidet vårt har brukt overflater i rustfritt stål, kan PABT samhandle med andre metalllegeringer21 og dermed har potensial til å forbedre biokompatibiliteten og terapeutiskpotensialet til et bredt spekter av metalliske biomaterialer.
Vår nåværende metodikk indikerer at den maksimale immobiliseringstettheten av fluoroforkonjugert pepCD47 på metalloverflater er 180 ng / cm2, som er mindre sammenlignet med våre tidligere publiserte data17. Vi tilskriver denne avviket til de ulike vaskestrategiene som brukes i begge studiene. I vår nåværende protokoll har vi brukt SDS som helt fjerner ikke-kovalent bundet peptider sammenlignet med Tween-20 som ble brukt i våre første studier. 180 ng/cm2 tilsvarer imidlertid ca. 4 x 106 molekyler/μm 2 pepCD47. Denne immobiliseringstettheten er mye høyere enn de fysiologiske nivåene av CD47 på celleoverflater som er ca. 390 molekyler/μm2,22. Dermed spår vi at strenge vaskeforhold ikke vil påvirke de antiinflammatoriske egenskapene til pepCD47 modifiserte metalloverflater.
Denne metodikken for vedlegg av pepCD47 til metall er svært reproduserbar, men det er flere trinn i protokollen som trenger nøye oppmerksomhet. For det første, etter å ha dekket metalloverflaten med PABT og redusert den ved hjelp av TCEP, er tiolene utsatt for oksidasjon når de utsettes for luft. Dermed er det av største betydning at overflatene alltid er nedsenket i avgasset vann. Av samme grunn er PEI-PDT-løsningen laget i avgasset vann og argon tilsettes hetteglassene under inkubasjon av folier belagt med PEI-PDT. For det andre må man vurdere potensialet for nedbør av solubiliserte peptider. PepCD47 har en terminal cystein rester, samt cystein rester i sekvensen. Dermed, når det er feil lagret, er det en høy mulighet for at peptidene polymeriserer og utfeller ut av løsningen. For å løse dette potensielle problemet anbefales det at peptidene reduseres ved hjelp av TCEP-perler i 20 min til 1 time før inkubasjon med PEI-PDT-belagte overflater. TCEP ville bidra til å redusere peptidene og øke deres løselighet i sine respektive fortynningsmiddel. Det anbefales også å fortrenge omgivelsesluft med argon i hetteglassene mens du inkuberer PEI-PDT-belagte prøver med thiolated peptid.
Hvis de ovennevnte forholdsreglene følges, er beleggteknikken reproduserbar, og den eneste potensielle begrensningen for denne tilnærmingen er den kommersielle manglende tilgjengeligheten av reagenser PABT og PEI-PDT.
Vi brukte en Chandler loop apparat for å gi ex vivo bevis på konseptanalyse for å forstå samspillet mellom pepCD47 modifisert metall overflater med blodceller, og det har blitt brukt av vår lab for å vise de antiinflammatoriske egenskapene til pepCD47 belagte overflater14,,15,,17,23. I denne studien brukte vi CFDA-fargestoff som fluoriserer først etter å ha kommet inn i cellene når acetatgruppene i fargestoffet er spaltet av intracellulær esterase. Fordelene med denne fargingsprosedyren er at den flekker de anucleated blodplater og røde blodlegemer som brønner som kjerneceller som leukocytter. Dermed gir bruk av CFDA-fargestoff en vurdering av både akutte antitrombotiske og antiklebende egenskaper av pepCD47-belagte overflater. Mer detaljert vurdering kan oppnås gjennom skanning av elektronmikroskopi og/eller immunstaining, som vi begge detaljerte tidligere24. Resultatene av den nåværende studien bekrefter at de menneskelige pepCD47-belagte metallflatene er antitrombotiske og anti-lim sammenlignet med de umodifiserte og krypterte sekvenskontrollene.
For ytterligere å undersøke om pepCD47-modifiserte overflater endrer vekstegenskapene til vedlagte inflammatoriske celler, ble bare metall rustfritt stål folier eller folier formulert med pepCD47 utsatt for isolerte rottemonocytter i nærvær av syngeneiske M-CSF. Cellene ble dyrket under stasjonære forhold i 6 dager for å tillate fenotypisk konvertering og utvidelse av makrofager. I samsvar med våre tidligere resultater observert i de forskjellige eksperimentelle innstillingene14,ble en dyp reduksjon av inflammatorisk cellenummer på pepCD47 funksjonaliserte overflater demonstrert i den nåværende studien.
Dermed viser våre studier til slutt at romanen polybisfosfonatkjemi for belegg av metaller med pepCD47 er en effektiv måte å forbedre biokompatibiliteten til metalloverflater og kan brukes i andre biomedisinske applikasjoner, for eksempel kunstige ledd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Protokollutvikling og studier presentert i denne artikkelen ble støttet av NIH (NBIB) R01-finansiering (# EB023921) til IF og SJS, og NIH (NHLBI) R01-finansiering (# HL137762) til IF og RJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W.
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
