Summary
ここで提示されるペプチドCD47(pepCD47)をポリビスフォスフォネート化学を用いて金属ステントに付加するためのプロトコルです。pepCD47を用いた金属ステントの機能化は、炎症細胞の付着および活性化を防止し、生体適合性を向上させる。
Abstract
ベアメタルステントと薬物溶出ステントに関連する主要な合併症は、それぞれステント内のレステノーシスと後期ステント血栓症です。したがって、金属ステントの生体適合性の向上は依然として重要な課題である。このプロトコルの目的は、血管内ステントを含む医療インプラントに接触する血液の生体適合性を高めるために生物学的に活性なペプチドによる金属表面修飾の堅牢な技術を記述することです。CD47は、自己の免疫学的種特異的マーカーであり、抗炎症特性を有する。研究は、細胞外領域におけるCD47のIgドメインに対応する22アミノ酸ペプチド(pepCD47)が、全長タンパク質のような抗炎症特性を有することを示している。ラットのインビボ研究、および私たちの研究室からのウサギおよびヒト血液実験システムにおけるex vivo研究は、金属に対するpepCD47固定化が炎症性細胞の付着および活性化を防ぐことによって生体適合性を向上させることを実証した。本論文では、金属表面の機能化とペプチド付着のステップバイステッププロトコルについて説明する。金属表面は、ポリアリアアミンビスリン酸を使用して修飾され、後にチオールの脱保護およびピリジルジチオ基(PEI-PDT)を搭載したポリエチレンイアミンとの反応によるチオール反応性部位の増幅が続く。最後に、pepCD47は、二重8-アミノ-3,6-dioxa-オクタノイルスペーサーを介してコアペプチド配列に接続された末端システイン残基を組み込んで、ジスルフィド結合を介して金属表面に結合される。この金属表面へのペプチド付着の方法論は効率的で比較的安価であり、したがって、いくつかの金属生体材料の生体適合性を改善するために適用することができる。
Introduction
経皮的冠動脈介入は、冠動脈疾患(CAD)を治療するための治療の第一行であり、主に疾患のある動脈をステント化することを含む。しかし、ステント内のレステノーシス(ISR)およびステント血栓症は、ステント展開1に関連する一般的な合併症である。血液ステント界面での血液相互作用は、金属表面上の血漿タンパク質のほぼ即時吸着によって特徴付け、その後に血小板および炎症性細胞の付着および活性化2が続く。活性化された炎症細胞からの炎症性サイトカインおよびケモカインの放出は、チュニカ培地における血管平滑筋細胞(VSMC)の表皮修飾をもたらし、その遠心性インティカルコンパートメントへの移行を引き起こす。インティマにおける活性化VSMCの増殖は、インティミカル層の肥厚、内腔狭化およびステントレステノーシス3をもたらす。VSMCの増殖を防ぐために、薬物溶出ステント(DES)が開発されました。しかしながら、これらの薬物は、内皮細胞44,55に対するオフターゲット細胞傷害作用を有する。したがって、後期ステント血栓症は、DES66,77に関連する一般的な合併症である。ポリ-L-ラクチドのような生分解性ポリマーで作られたステントは、動物実験および初期臨床試験において多くの約束を示したが、「現実の」臨床使用が第3世代DES8に劣っていることを示した時に最終的にリコールされた。したがって、より良い患者の転帰のためにベアメタルステントの生体適合性を改善する必要がある。
CD47は、その同結合受容体シグナル調節タンパク質α(SIRPα)9に結合した場合に自然免疫応答を阻害する、ユビキタスに発現する膜貫通タンパク質である。SIRPα受容体は、免疫細胞チロシン阻害モチーフ(ITIM)ドメインとSIRPα-CD47相互作用のシグナル伝達事象を有し、最終的には炎症性細胞活性化10、11、12、13,12,のダウンレギュレーションをもたらす。10,13我々の研究室での研究は、組換えCD47またはそのペプチド誘導体が、CD47の細胞外領域の22アミノ酸Igドメイン(pepCD47)に相当し、臨床的に関連する生体材料14、15、16,15,16の範囲に対する宿主免疫応答を低下させることができることを示している。最近、pepCD47をステンレス鋼のステント表面に固定化し、修復に伴う病態生理学的応答を大幅に低下させることができることを実証した。なお、pepCD47改質面は、長期保存やエチレンオキシド滅菌法17などの関連する使用条件に適している。そのために、pepCD47は、血管内ステントの臨床的限界に対処するのに有用な治療標的であり得る。
pepCD47を金属表面に共有結合させる戦略は、金属表面の一連の新しい化学修飾を伴う。金属表面は、まずポリアリンアミンビスホスホネートを潜伏チオール基(PABT)でコーティングし、続いてチオールの脱保護とピリジルジチオ基(PDT)を搭載したポリエチレンイミン(PEI)の付着物を施した。脱保護PABTチオールとの反応で消費されないPEIのPDT基は、次いで、末端システイン残基にチオールを組み込んだpepCD47と反応し、ジスルフィド結合14、17、18,17,18を介してpepCD47を金属表面に結合させる。ペプチドの最大表面固定化をもたらすペプチドの入力濃度を求めるフルオロフォア共役pepCD47(TAMRA-pepCD47)を用いた。最後に、pepCD47被覆金属表面の急性および慢性抗炎症能力を評価し、ex vivo、チャンドラーループ装置、及び単球接続/マクロファージ拡張アッセイを用いてそれぞれ評価した。
本論文は、金属表面へのチオラ化ペプチドの付着のための系統的なプロトコルを提供する。ペプチドの最大固定化密度を決定する;全血および単球に曝露されたpepCD47被覆金属表面の抗炎症特性を評価する。
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Protocol
この実験のためのすべてのヒトサンプルは、フィラデルフィア小児病院のIRBに従って得られた。すべての動物実験は、フィラデルフィア小児病院のIACUCの承認を得て行われました。
1. PEI-PDT でベアメタル表面をコーティング
- ステンレス箔クーポン(1cm x 1cmまたは0.65 cm x 1cm)または2-イソプロパノールを使用したステンレス鋼メッシュディスクをシェーカー(60°C、200rpmの速度)で5分間洗浄します。このステップ 2x を実行します。その後、クロロホルム(60°C、速度200rpm)で2倍をそれぞれ10分間洗います。
- 220°Cのオーブンに洗浄したステンレス鋼のサンプルを30分間置きます。
- DDWの5mLにポリアリラミンビスホスホネート25mgを潜伏チオール基(PABT)と5mgの重炭酸カリウム(KHCO3)で溶解し、200rpmで72°Cで30分間シェーカーでインキュベートし、PABT溶液の0.5%の5 mLを調製します。
注:PABT合成については、以前に公開された文献18を参照してください。 - 焼いたホイルまたはメッシュディスクをPABTの0.5%水溶液に浸し、シェーカー(72°C、200rpmの速度)で1時間インキュベートします。
- PABT修飾サンプルを脱イオン蒸留水(DDW)で5倍洗い、新しいバイアルで標本を移し、DDWで再び5倍洗います。
- 0.1 M酢酸(0.57mLの氷酢酸、820mgの酢酸ナトリウム)の5 mLにトリス(2-カルボキセチル)塩酸塩(TCEP)60mgを溶解して、合計5mLのTCEP溶液(12mg/mL)を調製します。
- PABT修飾サンプルをTCEPで、シェーカー上の室温(RT)で15分間処理します。
注: TCEP は、チオール グループの保護を解除するために使用されます。 - 凍結乾燥機などの真空発生装置を用いて丸底フラスコ中のDDWを脱ガスし、TCEP処理したホイルまたはメッシュディスクを脱気DDWで5倍洗う。サンプルを新しいバイアルで移し、さらに脱気したDDWで5倍洗います。
注:大気酸素による金属表面のチオールの酸化を防ぐために、迅速に作業することが最も重要です。 - 212.5 μLのストック PEI-PDT と 0.4 M 酢酸ナトリウムを脱気DDWに希釈して、1%PEI-PDT溶液の5 mLを調製します。ステップ1.9をステップ1.8と同時に実行し、大気へのサンプルの暴露を最小限に抑えます。
注: PEI-PDT の合成は、以前に公開された文献18に記載されています。 - 洗浄したステンレス鋼の試料を1%PEI-PDTでインキュベートします。空気をアルゴンガスに置き換え、バイアルを気密に密封し、RTのシェーカーで1時間混ぜます。ペプチド結合を直ちに進めるか、4°Cで1週間まで保存する。
2. 蛍光顕微鏡法と蛍光測定法を用いた金属表面のフッ素体結合型pepCD47保持の付着性及び定性評価
- セクション1に記載されているように作成した箔クーポンまたはメッシュディスクを洗浄し、DDW 5xで上記のステップ1.1〜1.10。サンプルを新しいバイアルに移し、DDWで洗浄して5倍にします。最後に、脱ガスエタノールで2倍、脱気ジメチルホルムアミド(DMF)で2倍洗浄します。
- テトラメチルロダミン(TAMRA)と共役したpepCD47ストック溶液を脱ガスジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させて最終濃度1mg/mLに調製します。1 mLの割り当てでストック溶液をアリコートする。アルゴン雰囲気下で密閉チューブで-20 °Cで保管してください。
- 脱気DMFを使用してTAMRA共役pepCD47のストック溶液の1mg/mLを希釈し、以下の濃度のフルオロフォアを共役するpepCD47-10、30、100、および200 μg/mLを調製した。
注:TAMRA共役pepCD47が沈殿しているように見える場合は、TCEPビーズを1:1、RTで20分間使用して、ストックTAMRA共役pepCD47溶液を減らしてください。TAMRA 結合 pepCD47 を TCEP ビーズに追加する前に、TCEP ビーズ溶液をスピンし、上清を除去してから TAMRA 結合 pepCD47 を追加して進みます。 - PEI-PDT改変箔クーポンを、1時間アルゴン雰囲気下でRTのシェーカー上の各条件に対して、TAMRA共役pepCD47の10、30、100、または200 μg/mLでインキュベートします。インキュベートPEI-PDTはメッシュディスクを改変し、ステップ1.2(ベアメタルコントロール)を超えてメッシュディスクを変更せず、TAMRA共役pepCD47の100 μg/mLを1時間のシェーカー上のアルゴン雰囲気の下でRTで三重化します。
注:このステップ以降、バイアルは、光から内容物を保護するためにアルミ箔で包まれています。 - フルオロフォア結合pepCD47コーティングされた表面を洗浄して、非共有結合ペプチドを次の順序で除去します: DMF (3x), DMF/DDW 1:1, DDW(3x)、0.3%のSDSを20 mMトリスpH 7.4(シェーカーで70°Cでそれぞれ3、5分)、DDW(3x)、バイアル交換、最終DDW洗浄。
- 制御と共有結合メッシュディスクを顕微鏡ガラスに配置し、50 μLのPBSを追加し、カバースリップを配置します。ローダミンフィルターセットを搭載した反転蛍光顕微鏡を用いた画像メッシュディスク。100倍の倍率で代表的な画像を撮ります。
- 12 mg/mL TCEP溶液の15 mLを、メタノールと0.1 Mの酢液の1:1 v/v混合物に180mgのTCEPを溶解して調製します。
- RTで1mLのTCEP溶液を1mLずつインキュベートします。
- TAMRA結合pepCD47ストック(1 mg/mL)~100μg/mL、1μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mL、0.01 μg/mLを連続希釈して、以下の基準を準備してください。希釈剤として TCEP ソリューションを使用します。
- 544/590 nm励起波長および発光波長で蛍光測定によって生成された較正曲線に対して、金属表面から放出されたTAMRA共役pepCD47を解析します。
3. PEI-PDT 改質面へのヒトpepCD47の取り付け
- セクション1に記載されているように配合された洗浄PEI-PDT被覆サンプル、上記のステップ1.1-1.10、脱気DDW 5xで、バイアルを交換し、脱気DDW 5xで洗浄する。
- ヒトpepCD47ストック溶液(1mg/mL)を脱気50%酢酸に溶解して1mg/mLの濃度を達成する。
- ヒトpepCD47(100 μg/mL)の作業濃度を、4,500 μLの脱ガス1xリン酸緩衝生理食塩基(PBS)の4,500 μLにヒトpepCD47のストックを溶解して調製します。
- 洗浄されたPEI-PDT被覆サンプルを1時間振盪してRTでpepCD47の100 μg/mLでコーティングしたサンプルをインキュベートします。
- ヒトpepCD47コーティングサンプルを洗浄して、以下の順序で余分なペプチドを除去し、PBS(3x)、DDW(3x)、0.2%Tween-20(3x、各5分)、DDW(3x)、バイアルの交換および最終DDW洗浄を行います。
注:ヒトpepCD47被覆表面は、最大6ヶ月間4°Cで乾燥して保存することができます。
4. PEI-PDT 改変された表面をスクランブルシーケンス(Scr)でコーティング
- スクランブルされた配列粉末を脱気0.1%の酢酸に溶解し、1mg/mLのストック液を調製する。
- 4,500 μLの脱気0.1%酢酸を溶解して、スクランブルペプチドの100 μg/mLの溶液を調製します。
- 洗浄したPEI-PDT検体にスクランブルペプチド100μg/mLをRTで1時間振盪してコーティングします。
- 取り付けられたスクランブルペプチドを除去するには、次の順序で表面を洗浄 0.01% 酢酸 (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 分), DDW (3x), バイアルを変更し、1 DDW 洗浄.
5. 金属表面への細胞の接続を分析するためのチャンドラーループ
- セクション1の説明に従って、金属箔(0.65 cm x 1cm)をヒトpepCD47またはスクランブルペプチドのいずれかでコーティングし、その後に3または4を続けます。
- 1/4インチのPVCチューブを3本の38cmの長さに切ります。
- 3つの異なる管の8つまで無変、スクランブルされたペプチドまたはpepCD47の変性金属箔を挿入する。
- 健康なヒトドナーから30 mLの血液を収集し、機関IRBプロトコルに従って抗血小板薬を含まない。採取した血液の凝固を防ぐために、4%クエン酸ナトリウムの1 mLでシリンジをプリロードします。
- 10 mLのシリンジを使用して各チューブに10mLの血液を入れ、端部を金属アダプターで接続します。チャンドラーループ装置の車輪に血液で満たされた管を置きます。
- 計算した速度で37°Cで車輪回転で金属箔に沿って血液を渡し、25 dyns/cm2 のせん断を4時間で生成します。
- チューブから血液を排出し、IRBの要件に従って血液を処分します。
- 各チューブからホイルを取り出すためにメスを使用してチューブをカットします。
- 10 mLのカコチル酸ナトリウムバッファーを0.1 Mの塩化ナトリウムを用いて10mlの4%グルタルアルデヒド溶液を希釈して2%グルタルアルデヒド溶液を調製する。
- 2%グルタルアルデヒド溶液でホイルを15分間インキュベートし、一晩4°Cで保存します。分析する前に、金属箔3倍をPBSで洗浄してください。
6. CFDA染料を用いた金属表面への細胞の付着性の分析
- 37°Cに設定した水浴で15mLチューブ内のPBSの8mLを温めます。
- CFDA(カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシニミジルエステル)染料溶液を次のように準備し、1つのCFDA色素バイアルに90μLのDMSOを加えて、10mMのストック濃度を達成します。次に、8 mLの温かいPBSに75 μLのストックCFDAを加えて、93.75 μMの作業濃度を調製します。チューブを数回反転して混ぜ、チューブをアルミホイルで覆います。
注:すべての使用の前に、CFDA染料を新たに調製することをお勧めします。 - 24ウェルプレートにCFDA染料1mLを用いて各ホイルをインキュベートします。プレートをアルミホイルで覆い、37°Cで15分間インキュベートします。
- 金属箔3倍をPBSで洗浄し、過剰な染料を除去します。反転蛍光顕微鏡を用いた画像。
7. pepCD47改変およびベアメタル表面上の単球の付着およびマクロファージ拡張
- 400-450 g雄スプレイグドーリーラットの犠牲の間に静脈のアクセスを介して末梢血の10 mLを収集します。凝固を防ぐために、ヘパリンナトリウムの1,000 IUとすぐに混合します。
- 50 mL円錐管に10 mLの密度勾配媒体のピペット。PBSの5 mLと血液を混合し、慎重にパスツールピペットを使用して密度勾配培地上に希釈された血液を層化します。800 x g のスイング バケット ローターの遠心分離機と 20 分間の 18~25 °Cで、最小の設定で加速と減速を行います。
- パスツールピペットを使用して、プラズマとフィコールの間の界面にバフィーコートの不透明な層を収集します。550 x g でPBSと遠心分離機で1:3を希釈したバフィーコートセルに10分間 10分間。
- ACKリシスバッファーの3 mLにバフィーコート細胞を再中断し、赤血球を汚染してリセレートする。氷の上で4分間インキュベートします。12 mLの細胞分離バッファー(CSB;0.5% BSA、0.5% FBS、2 mM EDTA/PBS)を追加します。
- 550 x g で遠心分離機、4 °C で 10 分間。ペレットをCSBの10mLに再懸濁します。
- 200 x g で遠心分離機、4 °Cで 10 分間血小板を除去します。2 回繰り返します。
- ペレットをCSBの500 μLに再懸濁します。CD8a(クローンOX-8)、抗CD5(クローンOX-19)、抗CD45RA(クローンOX-33)、抗CD6(クローンOX-52)の各マウス抗ラット抗体のそれぞれ10 μgを加えます。
- 垂直チューブ回転翼で4°Cで1時間インキュベートし、9.5mLのCSBを加えます。遠心分離機は 300xg で、4°Cで10分間。上清を捨て、CSBの10mLでペレットを再懸濁し、遠心分離を繰り返す。
- ペレットをCSBの500 μLに再懸濁します。150 μLのヤギ抗マウス IgG マイクロビーズを加えます。垂直チューブ回転翼で4°Cで20分間インキュベートし、9.5mLのCSBを加えます。遠心分離機は 300xg で、4°Cで10分間。
- 上清を捨てます。CSBの1 mLにペレットを再懸濁します。
- 磁気セパレータに LS カラムを配置します。 CSB の 3 mL で LS カラムをプライムします。列のスループットを破棄します。ステップ7.10から再懸濁細胞ペレット1mLを加える。スループットの収集を開始します。フローが停止した後、CSB を 5 mL 追加し、フローが停止するまで列のスループットを収集し続けます。
- 遠心分離 300xg での負選択された単球を含むカラムスループット(6mL)と10分間の4°Cを含む。得られた小ペレットを10%FCS、1%のペン/ストレップおよび100 ng/mLラットマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を補充したRPMI-1640培地の2 mLで再懸濁する。
- 血球計を使用して単球を数えます。単球濃度を5 x 105 細胞/mLに調整します。
- 1.1-1.10および3.1-3.6に従ってラットpepCD47(N=3)で修飾されたステンレス鋼のサンプル(N =3)またはステンレス鋼のサンプルと12ウェルプレートの個々の井戸に1mLの単球懸濁液の量を加える。
- 3日目と5日目のシード後に培地を変更します。6日目にPBSで細胞を洗浄し、室温で4%パラホルムアルデヒドを15分間固定します。PBSで2回5分間洗います。
- ステンレス鋼のホイルを取り外し、新しい12ウェルプレートに個別に置きます。ホイルを反転させないでください。
- 細胞を透過させるために0.5%Tween-20/PBSで15分間インキュベートします。PBSで2回5分間洗います。
- 10%ヤギ血清/PBSで20分間ブロックします。血清を吸引する。洗わないで下してください。マウス抗ラットCD68抗体を加える(1%BSA/PBSで1:100を希釈)。室温で1時間インキュベートする。PBSで3倍の洗浄をそれぞれ5分間洗います。
- ヤギの抗マウスIgGアレクサフルオール546(1%BSA /PBSで1:200希釈)を追加します。室温で暗く45分間インキュベートします。PBSで5分間洗います。1 μg/mL Hoechst 33342 色素を室温で10分間暗くしてカウンターステイン。PBSで3倍の洗浄をそれぞれ5分間洗います。
- 蛍光顕微鏡を逆光光学で、ホイルと画像を反転させます。青と赤のフィルタ設定で200倍の倍率で画像をキャプチャします。
- 個々の画像に添付された単球をカウントし、グループ平均と標準偏差を計算します。
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Representative Results
図 1に示すように、金属表面は、一連の化学修飾によってペプチドの付着に対してチオール反応性をレンダリングします。PABTインキュベーションに続いてPEI-PDT処理を行うと、金属表面がペプチドの付着に適しています。C末流でシステイン残基を含むペプチドCD47(pepCD47)は、フレキシブルな二重AEEAcブリッジを介してコアpepCD47配列に結合し、ジスルフィド結合を介してチオール反応性表面に共有結合する。このプロトコルを用いて、pepCD47が最大6ヶ月間金属表面に安定して付着し続け、通常の生理的剪断応力および滅菌手順17に耐えることができることを実証した。
最大ペプチド保持率は、TAMRA共役pepCD47を金属表面に加え、続いて広範な洗浄を行い、非共有結合ペプチドを排除し、ペプチドを表面にテザリングするジスルフィド橋梁の切断によるTAMRA-pepCD47の切断、およびフルオリメトリックアッセイを用いた分析定量化を行った。具体的には、TAMRA共役pepD47(1mLの10〜200μg/mL溶液)の入力量を増加させ、PEI-PDT被覆面に付加し、数回洗浄して非共有結合ペプチドを除去した。共有結合型TAMRA結合pepCD47の濃度は、還元剤TCEPを用いて共有結合ペプチドを放出し、その蛍光を標準に対して評価することによって決定した。10,30,100及び200μg/mLの入力濃度は、それぞれ28±2、78±2、182±14、157 ±のペプチド保持を示した(図2)。このように、金属表面上のpepCD47の最大固定化密度は、100μg/mLの入力濃度で達成2された約180ng/cm2であることが判明した。PABT/PEI-PDT変性金属表面上のTAMRA共役pepCD47の適切な固定化は、TAMRA共役pepCD47処理されたメッシュディスクの表面から放出される均一な蛍光を示す蛍光顕微鏡法(図3)によってさらに裏付けられた(図3A)。PABT/PEI-PDT修飾を欠いた対照メッシュの表面に検出された蛍光は最小のみ(図3B)、それによって非特異的に結合したTAMRA結合pepCD47を蛍光の主な供給源として除外した。
次に、ペプCD47被覆表面の能力を評価し、非改変およびスクランブルされた配列ペプチド改変面と比較して急性の血液細胞の付着を防ぐ。スクランブルペプチドはpepCD47と同じアミノ酸組成を有するが、14,17,17の異なる順序で。血液中の細胞の付着は、CFDA染色による未修飾、スクランブル、およびpepCD47改変面を介して、修飾されていないヒトのボランティアからの血液の回転、および、CFDA染色での染色、固定、および染色を洗浄することによって評価された。表面を蛍光顕微鏡で可視化した。以前に公開されたデータ14と一致して、17 pepCD47コーティングされた表面は、スクランブル改変および未改変制御と比較して、血中細胞の付着物の大幅な減少を示す(図4)。
炎症性細胞の付着および増殖に対するpepCD47表面改変の効果を拡大するために、ラットバフィーコート細胞の陰性免疫選択を使用して単球19を単球単球に分離し、M-CSFの存在下で6日間、裸金属およびpepCD47改変ステンレス箔上で単離された単球を培養した。本研究の結果は、急性単球付着の58%減衰、マクロファージへのその表向きの変換、およびpepCD47機能化された表面上のマクロファージの増殖を、ベアメタル制御と比較して示した(図5Figure 5 B,C)。
図1:pepCD47を金属表面に追加する手順の概略図。(A)クリーンメタルサンプルを220°Cで焼き、金属表面を酸化した。ポラリラミンビスホスホネートのビスホスホネート基と潜伏チオール基(PABT)は、金属酸化物と共に共調結合を形成し、金属表面を被覆して機能性単層を形成した。PABT被覆金属表面をさらにチオール基の脱保護のためにTCEPで処理した。(B) PEI-PDTと記号表現の構造。(C)PABTコーティングおよびTCEP還元面をPEI-PDTで処理し、チオラ化ペプチドの付着に利用可能なチオール反応性基の総数を増幅した。最後に、PEI-PDT被覆表面をpepCD47の末端システイン基と反応させ、そして、そのペプチドをジスルフィド結合を介して表面に結合した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 金属表面上のpepCD47の固定化密度を決定する。1 cm x 1cmの金属箔は、フルオロフォア共役pepCD47の濃度(10、30、100および200 μg/mL)を使用して改変した。過剰なペプチドを、いくつかの洗浄ステップを用いて除去し、その後、フルオロフォア共役フルオロフォアを切断するために1mL TCEP溶液で処理した。金属表面に共有結合されたペプチドの濃度を、定義された濃度のフルオロフォア結合pepCD47で調製した標準曲線を用いて蛍光測定的に分析した。固定化密度を、金属表面に結合したペプチドのng/cm²として表した。データはSEM±平均として表され、少なくとも3つの独立した実験を代表するものである。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TAMRA結合pepCD47で修飾されたステンレス表面の蛍光顕微鏡イメージング。ステンレス鋼メッシュディスクは、PABT、TCEP、PEI-PDT(A)またはA未改変(B)で連続的に改変し、TAMRA共役pepCD47と反応した。適切に結合および制御ベアメタルメッシュを広範囲に洗浄し、100倍の倍率で画像化しました。スケールバーの長さは100 μmです。
図4:pepCD47の急性抗炎症および抗血栓機能の評価0.65 cm x 1cmの金属箔は、100 μg/mLのヒトpepCD47またはスクランブルペプチドのいずれかでコーティングされ、チャンドラーループ装置で血液にさらされた。非結合細胞をPBSで洗浄して除去し、箔を2%グルタルアルデヒドに固定した。改変されていない、スクランブル修飾されたヒトpepCD47表面を、CFDA色素を37°Cで15分間インキュベートし、PBSで洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて分析した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:裸およびpepCD47機能性金属表面上のCD68陽性マクロファージの有病率。 ラット末梢血由来単球は、次いで磁気マイクロビーズによる陰性免疫選択を続けて、勾配密度遠心分離によって単離した。5 x 105 単球を、個別に配置されたベアメタルホイルサンプル(N=3)またはラットpepCD47で誘導体化したサンプルを用いて12ウェルプレートのウェルに添加した。マクロファージ分化は、100 ng/ml M-CSFによって刺激された。細胞を播種してから6日後に固定し、抗ラットCD68抗体で免疫染色し、二次Alexa Fluor-546(赤色)共役抗体と、Hoechst 33342核色素で抗体を共役した対数(青)。ベアメタル(A)およびpepCD47機能化された(B)表面の代表的な画像を200倍の倍率で撮影し、マージした。スケールバーの長さは100 μm です。
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Discussion
我々は、血液中に見られる炎症細胞に対する表面の反応性を低下させるという包括的な目標を持つステンレス鋼表面に治療ペプチド部分を付加する比較的新しい化学戦略を実証し、記述する。本明細書に記載されるビスホスホネート化学は、PABTの金属酸化物とビスホスホネート基との間の協調結合形成を含む。金属表面に形成されるポリビスホスホネート単層の厚さは5nm18を超えないが、したがって、厚いポリマーコーティング20の潜在的な炎症効果に対して重要ではない。PABTの脂肪族側鎖における潜在的チオール基の脱保護は、チオール反応性化合物を用いた更なる化学修飾のために金属表面をプライミングする。PEI-PDTは、チオール反応性ピリジルジチオ基で約20%のエチレンイミンリンクが修飾されているポリエチレンイミン(平均Mw=25,000)である。PABT由来チオールとの反応では、PAI-PDT中のPDT群のごく一部しか消費されないので、PEI-PDTテザリング後の表面化学はチオール反応性に変化し、チオラ化ペプチド18の付着を可能にする。この化学戦略は、組換えタンパク質14、ペプチド14、17、およびウイルス遺伝子ベクター18を金属表面に14付着させるために、我々の研究室で開発され、17広く使用された。しかし、私たちの仕事のほとんどは、ステンレス鋼の表面を使用してきましたが、PABTは他の金属合金21と相互作用することができ、したがって、金属バイオ材料の広い範囲の生体適合性および治療可能性を改善する可能性を有する。
我々の現在の方法論は、金属表面上のフルオロフォア共役pepCD47の最大固定化密度が180 ng/cm2であることを示しており2、これは以前に公表されたデータ17と比較して少ない。この不一致は、両方の研究で使用されるさまざまな洗浄戦略に起因する。現在のプロトコルでは、最初の研究で使用されたTween-20と比較して、非共有結合ペプチドを完全に除去するSDSを使用しています。しかし、180 ng/cm2はpepCD47の約4 x 106分子/μm2に相当する。2この固定化密度は、約390分子/μm2,2222である細胞表面上のCD47の生理学的レベルよりもはるかに高い。従って、厳しい洗浄条件は、pepCD47変性金属表面の抗炎症特性に大きな影響を与えないと予測する。
pepCD47の金属への付着のこの方法論は非常に再現性が高いが、プロトコルには注意深く注意が必要ないくつかのステップがある。まず、PABTで金属表面をコーティングし、TCEPを用いて還元した後、チオールは空気にさらされると酸化しやすくなる。したがって、表面が常に脱気水に沈むことが最も重要です。同じ理由で、PEI-PDT溶液は脱ガス水で作られ、アルゴンはPEI-PDTでコーティングされたホイルのインキュベーション中にバイアルに加えられる。第二に、可溶化ペプチドの沈殿の可能性を考慮しなければならない。PepCD47は、末端システイン残基、並びにシステイン残基を配列に有する。したがって、不適切に保存されると、ペプチドが溶液から重合して沈殿する可能性が高い。この潜在的な問題に対処するために、PEI-PDTコーティングされた表面でインキュベーションする前に、20分間TCEPビーズを使用して1時間にペプチドを減らすことをお勧めします。TCEPは、ペプチドを減らし、それぞれの希釈液中の溶解度を高めるのに役立つだろう。また、ピオラ化されたペプチドでコーティングされたサンプルをインキュベートしながら、バイアル内のアルゴンで周囲の空気を置き換えることをお勧めします。
上記の注意事項に従えば、コーティング技術は再現可能であり、このアプローチの唯一の潜在的な制限は試薬PABTおよびPEI-PDTの市販の非入手可能性である。
我々は、ペプCD47変性金属表面と血液細胞との相互作用を理解するためにex vivo概念実証分析を提供するためにチャンドラーループ装置を使用し、pepCD47被覆表面14、15、17、2315の抗14炎症特性を示すために我々の研究室で正常に使用されている。,17,23 本研究では、細胞内エステラーゼによって色素のアセテート基が切断された場合にのみ蛍光を発するCFDA色素を用いた。この染色手順の利点は、白血球などの有核細胞と同様に、核血小板および赤血球を染色することです。このように、CFDA色素を利用すると、pepCD47被覆表面の急性抗血栓性および抗接着性の両方の評価を提供する。より詳細な評価は、走査型電子顕微鏡および/または免疫染色を通じて取得することができ、どちらも以前に詳述した24.現在の研究の結果は、ヒトpepCD47被覆金属表面が、未改変およびスクランブルされた配列制御と比較して、抗血栓および抗接着剤であることを検証する。
pepCD47修飾面が付着した炎症細胞の成長特性を変化させるかどうかをさらに調べるため、pepCD47を配合したベアメタルステンレス箔または箔を、異質性M-CSFの存在下で単離ラット単球にさらした。細胞を6日間静止条件下で培養し、マクロファージの表向きの変換および増殖を可能にした。異なる実験設定14で観察された我々の以前の結果に従って、pepCD47機能化された表面上の炎症性細胞数の深い減少が現在の研究で実証された。
このように、我々の研究は、最終的にpepCD47を用いた金属をコーティングするための新しいポリビスホスホネート化学が金属表面の生体適合性を改善する有効な方法であり、人工関節のような他の生物医学用途に適用できることを証明している。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
本論文で発表されたプロトコルの開発と研究は、IFおよびSJSへのNIH(NBIB)R01資金(#EB023921)、IFおよびRJLへのNIH(NHLBI)R01資金(#HL137762)によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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