Summary
Presenteras här är ett protokoll för appending peptid CD47 (pepCD47) till metall stent med hjälp av polybisfosfonat kemi. Funktionalisering av metallstent med hjälp av pepCD47 förhindrar fastsättning och aktivering av inflammatoriska celler därmed förbättra deras biokompatibilitet.
Abstract
De viktigaste komplikationerna som är associerade med bare metal stent och drog elusing stents är i-stent restenosis och sen stent blodpropp, respektive. Således är förbättring av biokompatibiliteten för metallstent fortfarande en betydande utmaning. Målet med detta protokoll är att beskriva en robust teknik för metall ytmodifiering av biologiskt aktiva peptider för att öka biokompatibiliteten hos blod som kontaktar medicinska implantat, inklusive endovaskulära stent. CD47 är en immunologisk artspecifik markör för själv och har antiinflammatoriska egenskaper. Studier har visat att en 22 aminosyra peptid som motsvarar Ig domän av CD47 i extracellulära regionen (pepCD47), har antiinflammatoriska egenskaper som den fullängds protein. In vivo studier på råttor, och ex vivo studier i kanin och mänskliga blod experimentella system från vårt labb har visat att pepCD47 immobilisering på metaller förbättrar deras biokompatibilitet genom att förhindra inflammatoriska cell fastsättning och aktivering. Detta papper beskriver steg-för-steg-protokollet för funktionalisering av metallytor och peptidtillsats. Metallytorna modifieras med hjälp av polyallaminbisfosfat med latent tiolgrupper (PABT) följt av deprotection av tioler och förstärkning av tioolreaktiva ställen via reaktion med polyetenylenimin installerad med pyridyldithio-grupper (PEI-PDT). Slutligen, pepCD47, som innehåller terminal cystein rester ansluten till kärnan peptidsekvens genom en dubbel 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl spacer, är knutna till metallytan via disulfid obligationer. Denna metodik av peptid fastsättning till metallyta är effektiv och relativt billig och kan därmed tillämpas för att förbättra biokompatibiliteten hos flera metalliska biomaterial.
Introduction
Perkutan koronar intervention är den första raden av terapi för att behandla kranskärlssjukdomar (CAD) och i första hand innebär stenting de sjuka artärerna. Däremot är in-stent restenosis (ISR) och stent trombos vanliga komplikationer i samband med stent utplacering1. Blodinteraktion vid blod-stent-gränssnittet kännetecknas av en nästan omedelbar adsorption av plasmaproteiner på metallyta, följt av trombocyt och inflammatorisk celltillsats ochaktivering 2. Frisättningen av de inflammatoriska cytokinerna och kemokineerna från aktiverade inflammatoriska celler leder till den fenotypiska modifieringen av de vaskulära glattmuskelcellerna (VSMCs) i tunicamedierna och utlöser deras centrilamalmigration till intimalfacket. Spridning av aktiverad VSMC i intimiteten resulterar i intimalskikt förtjockning, lumen förträngning och i-stent restenosis3. Drug eluing stents (DES) utvecklades för att förhindra VSMC spridning; dessa läkemedel har dock en cytotoxisk effekt utanför målgruppen på de endotelceller4,5. Därför är sen stenttrombos en vanlig komplikation som är associerad med DES6,7. Stent av biologiskt nedbrytbara polymerer, såsom poly-L-laktid har visat mycket lovande i djurförsök och inledande kliniska prövningar, men så småningom återkallades när "verkliga" kliniska användningen visat sin underlägsenhet till 3rd generation DES8. Därför finns det ett behov av att förbättra biokompatibiliteten hos nakna metallstent för bättre patientresultat.
CD47 är ett allestädes närvarande uttryckt transmembran protein som hämmar det medfödda immunsvaret när det är bundet till dess kongnatre receptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. SIRPα-receptorn har en immuncellstyrosinhämmande motiv (ITIM) domän och signalhändelserna vid SIRPα - CD47-interaktionen resulterar i slutändan i nedreglering av inflammatoriskcellaktivering 10,11,12,13. Forskning i vårt labb har visat att rekombinanta CD47 eller dess peptidderivat, motsvarande 22 aminosyra Ig domän av extracellulära regionen CD47 (pepCD47), kan minska värd immunsvaret till en rad kliniskt relevanta biomaterial14,15,16. Nyligen har vi visat att pepCD47 kan immobiliseras till rostfritt stål stent ytor och avsevärt minska det patofysiologiska svaret i samband med restenosis. Att notera, de pepCD47 modifierade ytorna är mottagliga för relevanta användningsförhållanden såsom långtidslagring och etylenoxidsterilisering17. För detta ändamål kan pepCD47 vara ett användbart terapeutiskt mål att ta itu med de kliniska begränsningarna av endovaskulära stent.
Strategin för kovalent fastsättning av pepCD47 till en metallyta innebär en serie nya kemiska modifieringar av metallytan. Metalytorna belagda först med polyallaminbisfosfonat med latent tiolsgrupper (PABT) följt av deprotection av tiolerorna och fastsättning av polyetenimin (PEI) med installerade pyridyldithiogrupper (PDT). PDT grupper av PEI unconsumed i reaktionen med deprotected PABT tioler sedan reageras med pepCD47 införliva thiols i terminalen cystein rester, vilket resulterar i bindande pepCD47 till metallytan via en disulfid bond14,17,18. Vi använde en fluorophore konjugerad pepCD47 (TAMRA-pepCD47) för att bestämma ingångskoncentrationen av peptid som resulterar i den maximala ytan immobilisering av peptiden. Slutligen utvärderade vi den akuta och kroniska antiinflammatoriska kapaciteten hos pepCD47 belagda metallytor, ex vivo, med hjälp av Chandler loop apparaten och monocyt fastsättning/makrofag expansion assay, respektive.
Detta papper ger ett systematiskt protokoll för fastsättning av tiolerat peptider till metallyta; bestämmande av peptidens maximala immobiliseringsdensitet; och bedöma de antiinflammatoriska egenskaperna hos pepCD47 belagda metallytor som utsätts för helblod och isolerade monocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mänskliga prover för detta experiment erhölls i enlighet med IRB av Children's Hospital of Philadelphia. Alla djurförsök utfördes efter godkännande från IACUC av Children's Hospital of Philadelphia.
1. Beläggning av kala metallytor med PEI-PDT
- Tvätta de rostfria foliekupongerna (1 cm x 1 cm eller 0,65 cm x 1 cm) eller nätskivor i rostfritt stål med 2-isopropanol i en shaker (60 °C, hastighet på 200 varv/min) i 5 min. Utför detta steg 2x. Tvätta sedan 2x med kloroform (60 °C, hastighet på 200 rpm) i 10 min vardera.
- Placera de rengjorda rostfria proverna i en ugn vid 220 °C i 30 min.
- Förbered 5 mL av 0,5% av PABT-lösning genom att lösa upp 25 mg polyallaminbisfosfonat med latenta tiolergrupper (PABT) och 5 mg kaliumbikarbonat (KHCO3) i 5 mL DDW och inkubera vid 72 °C i en shaker vid 200 rpm i 30 min.
OBS: För PABT syntes hänvisa till tidigare publicerad litteratur18. - Sänk ned de bakade folierna eller nätskivorna i 0,5 % vattenlösning av PABT och inkubera i en skakmaskin (72 °C, hastighet på 200 varv/min) i 1 h.
- Tvätta de PABT-modifierade proverna med avjoniserat destillerat vatten (DDW) för 5x, överför exemplaren i en ny injektionsflaska och tvätta igen med DDW för 5x.
- Bered totalt 5 mL TCEP-lösning (12 mg/mL) genom att lösa upp 60 mg Tris (2-carboxyethyl) fosfinhydroklorid (TCEP) i 5 mL 0,1 M ättiksbuffert (0,57 mL glacial syra, 820 mg natriumacetat i 100 mL DDW).
- Behandla de PABT-modifierade proverna med TCEP i 15 min vid rumstemperatur (RT) på en skakser.
OBS: TCEP används för att deskydda de tioleriska grupperna. - Degas DDW i en rund bottenkolv genom att använda en vakuumgenererande anordning, till exempel en lyofilat och tvätta TCEP-behandlade folier eller mesh-diskar med avgasad DDW för 5x. Överför proverna i en ny injektionsflaska, och dessutom tvätta 5x med avgasad DDW.
OBS: Det är av största vikt att arbeta snabbt för att förhindra oxidation av tioler på metallytan genom atmosfäriskt syre. - Bered 5 mL 1% PEI-PDT-lösning genom att späda 212,5 μL lager PEI-PDT och 125 μL på 0,4 M natriumacetat i avgasad DDW. Utför steg 1.9 samtidigt med steg 1.8 för att minimera exponeringen av proverna för atmosfärisk luft.
OBS: Syntesen av PEI-PDT beskrivs i tidigare publicerad litteratur18. - Inkubera de tvättade exemplaren i rostfritt stål med 1% PEI-PDT. Ersätt luft med argongas, försegla injektionsflaskan lufttät och blanda på en shaker vid RT i 1 h. Antingen fortsätt omedelbart med peptidkonjugering eller förvara vid 4 °C upp till 1 vecka.
2. Fastsättning och kvalitativ/kvantitativ bedömning av fluorophorekonjugerad pepCD47 retention på metallyta med hjälp av fluorescensmikroskopi och fluorimetry
- Tvätta folie kuponger eller mesh diskar beredda enligt beskrivningen i avsnitt 1, steg 1.1-1.10 ovan med DDW 5x. Överför proverna till en ny injektionsflaska och tvätta med DDW för ytterligare 5x. Tvätta slutligen 2x med avgasad etanol och 2x med avgasad dimetylformamid (DMF).
- Förbered tetrametylrhodamine (TAMRA)-konjugerad pepCD47 stamlösning genom att lösa upp TAMRA-konjugerat pepCD47 pulver i avgassad dimetylformamid (DMF) till en slutlig koncentration av 1 mg/mL. Alikvot stamlösningen i 1 mL-kolonilotter. Förvaras i välförstärde rör under argonatmosfär vid -20 °C.
- Späd 1 mg/mL av stamlösningen av TAMRA-konjugerad pepCD47 med hjälp av avgasad DMF för att förbereda följande koncentrationer av fluorophore konjugerad pepCD47 - 10, 30, 100, och 200 μg/mL.
OBS: Om TAMRA-konjugerad pepCD47 verkar vara utfälld, minska beståndet TAMRA-konjugerad pepCD47 lösning med hjälp av TCEP pärlor i förhållandet 1:1, vid RT i 20 min. Observera att innan du lägger till TAMRA-konjugerade pepCD47 till TCEP pärlorna, snurra TCEP pärlor lösning, ta bort supernatant och sedan fortsätta med tillägg av TAMRA-konjugerad pepCD47. - Inkubera KUPONGERNA FÖR PEI-PDT-modifierad folie med 10, 30, 100 eller 200 μg/mL tamra-konjugerat pepCD47 i tre exemplar för varje villkor på en shaker vid RT under argonatmosfär under 1 timme. Inkubera PEI-PDT-modifierade mesh-diskar, samt mesh-disk som inte modifierats utöver steg 1.2 (bare metal controls) med 100 μg/mL TAMRA-konjugerad pepCD47 i tre exemplar vid RT under argonatmosfär på en shaker i 1 h.
OBS: Från detta steg och framåt är injektionsflaskan insvept i aluminiumfolie för att skydda innehållet från ljus. - Tvätta de fluorophorekonjugerade pepCD47-belagda ytorna för att avlägsna den icke-kovalent bifogade peptiden i följande ordning: DMF (3x), DMF/DDW vid 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS i 20 mM Tris pH 7,4 (3x, 5 min vardera vid 70 °C på en shaker), DDW (3x), ändra injektionsflaska, och en slutlig DDW tvätt.
- Placera kontroll och kovalent konjugerade mesh-diskar på ett mikroskopglas, tillsätt 50 μL PBS och placera ett täckskydd. Bildnätskivor med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop utrustat med ett rhodaminfilterset. Ta representativa bilder vid 100x förstoring.
- Bered 15 mL 12 mg/mL TCEP-lösning genom att lösa upp 180 mg TCEP i 1:1 v/v blandning av metanol och 0,1 M ättiksbuffert.
- Inkubera varje tvättad folie med 1 mL TCEP-lösning på en skakmaskin vid RT i 15 min.
- Förbered följande standarder genom att seriellt späda tamra-konjugerat beståndet pepCD47 (1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0,1 μg/mL, och 0,01 μg/mL. Använd TCEP-lösningen som spädningsvätska.
- Analysera TAMRA-konjugerade pepCD47 frigörs från metallyta mot kalibreringskurvan genereras med hjälp av normerna genom fluorimetry vid 544/590 nm excitation och utsläpp våglängder.
3. Fästa mänskliga pepCD47 till PEI-PDT modifierade ytor
- Tvätta PEI-PDT belagda prover formulerade enligt beskrivningen i avsnitt 1, steg 1.1-1.10 ovan, med avgasad DDW 5x, ändra injektionsflaskan och tvätta med avgasad DDW 5x.
- Förbered mänskliga pepCD47 stamlösning (1 mg/mL) genom att lösa upp mänskliga pepCD47 pulver i avgasade 50% ättiksyra för att uppnå en koncentration 1 mg/mL.
- Förbered arbetskoncentrationen av human pepCD47 (100 μg/mL) genom att lösa upp 500 μL av beståndet av human pepCD47 i 4 500 μL avgasad 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Inkubera de tvättade PEI-PDT-belagda proverna med 100 μg/mL pepCD47 vid RT med skakning i 1 h.
- Tvätta de mänskliga pepCD47-belagd prover för att ta bort överskott peptid i följande ordning PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min vardera), DDW (3x), ändra injektionsflaska och slutliga DDW tvätta.
OBS: Mänskliga pepCD47 belagda ytor kan förvaras torrt vid 4 °C i upp till 6 månader.
4. Beläggning av PEI-PDT-modifierade ytorna med förvrängd sekvens (Scr)
- Lös upp det förvrängda sekvenspulvret i avgasad 0,1% ättiksyra för att bereda en stamlösning på 1 mg/mL.
- Bered en lösning på 100 μg/mL förvrängd peptid genom att lösa upp 500 μL av i 4 500 μL avgasad 0,1% ättiksyra.
- Täck de tvättade PEI-PDT-exemplaren med 100 μg/mL förvrängd peptid vid RT med skakning i 1 h.
- För att ta bort oansenlig förvrängd peptid, tvätta ytorna i följande ordning 0,01% ättiksyra (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), ändra injektionsflaska och en DDW tvätt.
5. Chandler slinga för analys av cellulära fastsättning till metallytor
- Coat metallfolier (0,65 cm x 1cm) med antingen mänskliga pepCD47 eller förvrängd peptid enligt beskrivningen på avsnitt 1 följt av 3 eller 4.
- Skär 1/4" PVC-rör i tre 38 cm långa bitar.
- Sätt in upp till 8 omodifierade, scrambled peptid eller pepCD47 modifierade metallfolier i tre olika rör.
- Samla in 30 mL blod från friska mänskliga givare fri från alla anti-trombocyt mediciner enligt institutionella IRB-protokollet. Förladda spruta med 1 mL av 4% natriumcitrat för att förhindra koagulering av uppsamlat blod.
- Sätt 10 mL blod i varje rör med hjälp av en 10 mL spruta och anslut ändarna med metalladaptrar. Placera de blodfyllda rören på hjulen på Chandlers slingapparat.
- För blodet längs metallfolien genom hjulrotation vid 37 °C vid den hastighet som beräknas för att producera skjuvning av 25 dyns/cm2 i 4 h.
- Töm blodet ur rören och kasta av blodet enligt IRB-kraven.
- Skär rören med hjälp av skalpell för att hämta folier från varje rör.
- Bered 2% glutaraldehydlösning genom att späda ut 10 ml 4% glutaraldehydlösning med hjälp av 10 mL natriumceodylatbuffert med 0,1 M natriumklorid.
- Inkubera folierna i 2% glutaraldehydlösning i 15 min och förvara vid 4 °C över natten. Innan du analyserar, tvätta metallfolien 3x med PBS.
6. Analysera cellulär fastsättning till metallytor med hjälp av CFDA färgämne
- Värm 8 mL PBS i 15 mL-rör i ett vattenbad satt till 37 °C.
- Förbered färgämneslösningen CFDA (karboxoxi-fluorescein, succinimidylester) enligt följande - tillsätt 90 μL DMSO till en CFDA-färgflaska för att uppnå en lagerkoncentration på 10 mM. Därefter förbereder arbetskoncentrationen på 93,75 μM genom att tillsätta 75 μL av beståndet CFDA till 8 mL varm PBS. Blanda genom att invertera rören några gånger och täck röret med aluminiumfolie.
OBS: Det är lämpligt att nybereda CFDA-färgämnet före varje användning. - Inkubera varje folie med 1 mL CFDA-färgämne i en 24 brunnsplatta. Täck plattan med aluminiumfolie och inkubera plattan vid 37 °C i 15 min.
- Tvätta metallfolien 3x med PBS för att avlägsna överflödigt färgämne. Bild med hjälp av det inverterade fluorescensmikroskopet.
7. Monocyttillsats och makrofagexpansion på pepCD47-modifierade och kala metallytor
- Samla in 10 mL perifert blod via vena cava tillgång under offret av en 400-450 g hane Sprague-Dawley råtta. Blanda omedelbart med 1 000 IE av natrium heparin för att förhindra koagulering.
- Pipett 10 mL av densitetsgradientmedium till ett 50 mL koniskt rör. Blanda blodet med 5 mL PBS, och försiktigt lager utspädd blod över densiteten gradient medium med hjälp av en Pasteur pipett. Centrifugera i svängande skoprotor vid 800 x g och 18-25 °C i 20 min med minimala inställningar av acceleration och deceleration.
- Med hjälp av en Pasteur-pipett, samla ett ogenomskinligt lager av buffy coat på gränssnittet mellan plasma och Ficoll. Späd buffy coat 1:3 med PBS och centrifug vid 550 x g och 4 °C i 10 min till buffy coat celler.
- Re-suspendera buffy coat celler i 3 mL av ACK lys buffert att lyse förorenande erytrocyter. Ruva på is i 4 min. Lägg till 12 mL av cellsepareringsbuffert (CSB; 0,5 % BSA, 0,5 % FBS, 2 mM EDTA/PBS).
- Centrifugera vid 550 x g och 4 °C i 10 min. Åter upphäva pelleten i 10 mL csb.
- Centrifugera vid 200 x g och 4 °C i 10 min för att eliminera blodplättar. Upprepa två gånger.
- Åter upphäva pelleten i 500 μL av CSB. Tillsätt 10 μg av var och en av följande anti-rat-antikroppar för musen: CD8a (klon OX-8), anti-CD5 (klon OX-19), anti-CD45RA (klon OX-33), och anti-CD6 (klon OX-52).
- Inkubera vid 4 °C på en vertikal rörrotator i 1 h. Lägg till 9,5 mL CSB. Centrifugera vid 300 x g och 4 °C i 10 min. Kassera supernatant, åter upphäva pelleten i 10 mL CSB och upprepa centrifugeringen.
- Åter upphäva pelleten i 500 μL av CSB. Tillsätt 150 μL av get anti-mus IgG mikropärlor. Inkubera vid 4 °C på en vertikal rörrotator i 20 min. Lägg till 9,5 mL CSB. Centrifugera vid 300 x g och 4 °C i 10 min.
- Kassera supernatanten. Åter upphäva pelleten i 1 mL csb.
- Placera en LS-kolonn i en magnetisk separator. Prime LS-kolonnen med 3 mL CSB. Kasta kolumngenomströmningen. Lägg till 1 mL åter upphängd cellpellet från steget 7.10. Börja samla dataflödet. Efter flödesstopp lägger du till 5 mL CSB och fortsätter samla in kolumngenomflödet tills flödet upphör.
- Centrifugera kolonngenomströmningen (6 mL) som innehåller negativt utvalda monocyter vid 300 x g och 4 °C i 10 min. Åter upphäva den resulterande små pelleten i 2 mL av RPMI-1640 medium kompletteras med 10% FCS, 1% penna/strep och 100 ng/mL råtta makrofariska koloni stimulerande faktor (M-CSF).
- Räkna monocyterna med hjälp av hemocytometer. Justera monocytekoncentrationen till 5 x 105 celler/mL.
- Tillsätt 1 mL-volymer av monocyte suspension till de enskilda brunnarna i en 12 brunnsplatta med de kala rostfria folieproverna (N=3) eller rostfria stålprover som modifierats med rått pepCD47 (N=3) enligt 1,1–1,10 och 3,1–3,6.
- Byt medium på dag 3 och 5 efter-seedning. På dag 6 post-seeding tvätta cellerna med PBS och fixera med 4% paraformaldehyd vid rumstemperatur i 15 min. Tvätta två gånger med PBS i 5 min.
- Ta bort folierna i rostfritt stål och placera dem individuellt i en ny 12 brunnsplatta. Vänd inte folierna.
- Inkubera i 0,5% Tween-20/PBS i 15 min för att genomsyra cellerna. Tvätta två gånger med PBS i 5 min.
- Block i 10% getserum/PBS i 20 min. Aspirera serumet. Tvätta inte. Lägg till mus anti-råtta CD68 antikropp (utspädd 1:100 i 1%BSA/PBS). Inkubera i rumstemperatur i 1 h. Tvätta 3x i PBS i 5 min vardera.
- Lägg till get anti-mus IgG Alexa Fluor 546 (utspädd 1:200 i 1% BSA/ PBS). Inkubera i mörker i rumstemperatur i 45 min. Tvätta i PBS i 5 min. Counterstain med 1 μg/mL Hoechst 33342 färgämne i mörker vid rumstemperatur i 10 min. Tvätta 3x i PBS i 5 min vardera.
- Vänd folierna och bilden med hjälp av ett fluorescerande mikroskop med den inverterade optiken. Ta bilder i 200x förstoring med blå och röda filterinställningar.
- Räkna bifogade monocyter i de enskilda bilderna och beräknade gruppgenomsnitten och standardavvikelserna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metalytorna återges tioolreaktiv för peptidtillsats via en serie kemiska modifieringar, vilket illustreras i figur 1. PABT inkubation följt av PEI-PDT behandling gör metallytan mottaglig för peptid fastsättning. Peptid CD47 (pepCD47) som innehåller cystein rester vid C-terminus förenade till kärnan pepCD47 sekvens genom en flexibel dubbla AEEAc bro är kovalent fäst på de thiol-reaktiva ytor via disulfid obligationer. Med hjälp av detta protokoll har vi visat att pepCD47 förblir stabilt fäst vid metallytan i upp till sex månader och tål normal fysiologisk skjuvning stress och sterilisering förfaranden17.
Den maximala peptidretentionen fastställdes genom appending TAMRA-konjugerad pepCD47 till metallyta följt av den omfattande tvätten för att eliminera icke-kovalent bunden peptid, klyvning av TAMRA-pepCD47 genom minskning av disulfidbroar som tjuderar peptiden till ytan och analytisk kvantifiering med hjälp av en fluoretisk analys. Specifikt var ökande ingående mängder TAMRA-konjugerad pepD47 (1 mL av 10 - 200 μg/mL lösning) läggas till PEI-PDT belagda ytor och tvättas flera gånger för att avlägsna den icke-kovalent bundna peptiden. Koncentrationen av kovalent bunden TAMRA-konjugerad pepCD47 fastställdes genom att använda ett reduktionsmedel TCEP att släppa den kovalent bifogade peptid och bedöma dess fluorescens mot normerna. Den ingående koncentrationen av 10, 30, 100 och 200 μg/mL påvisad peptidretention på 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 respektive 157 ± 25 ng/cm2 ). Således konstaterades den maximala immobilisering densitet pepCD47 på metallyta vara ungefär 180 ng/cm2 som uppnåddes med en insatskoncentration på 100 μg/mL. Den korrekta immobiliseringen av TAMRA-konjugerad pepCD47 på DE PABT/PEI-PDT-modifierade metallytorna bekräftades ytterligare genom fluorescensmikroskopi (Figur 3) som påvisade en enhetlig fluorescens som avges från ytan av TAMRA-konjugerade pepCD47-behandlade meshskivor (figur 3A). Endast minimal fluorescens upptäcktes på ytan av kontroll maskor som saknade PABT/PEI-PDT modifiering (Figur 3B), och därmed utesluta en icke-specifikt bunden TAMRA-konjugerat pepCD47 som den viktigaste källan till fluorescens.
Därefter utvärderade vi förmågan hos pepCD47 belagda ytor för att förhindra akut blodburna cell fastsättning jämfört med den omodifierade och förvrängda sekvens peptid modifierade ytor. Scramble peptiden har samma aminosyra sammansättning som pepCD47 men i en annan ordning14,17. Den blodburna cellen kvarstad utvärderades genom rotation av blod från friska mänskliga frivilliga över omodifierade, kodade och pepCD47 modifierade ytor i Chandler loop apparaten följt av tvätt för att ta bort obundna celler, fixering och färgning med CFDA färgämne. Ytorna visualiserades genom fluorescensmikroskopi. Överensstämmer med våra tidigare publicerade data14,17 pepCD47 belagda ytor visar en drastisk minskning av blodburna cellen fastsättning jämfört med den kodade modifierade och omodifierade kontroller ( Figur4).
För att expandera på effekterna av pepCD47 yta modifiering på inflammatoriska cellen fastsättning och spridning, vi använde negativa immunoselection av råtta buffy coat celler att isolera monocyter19, och odlade de isolerade monocyterna på bare metal och pepCD47-modifierade rostfria folier i 6 dagar i närvaro av M-CSF. Resultaten av denna studie visar en kombinerad 58% dämpning av akut monocyt fastsättning, deras fenotypiska konvertering till makrofager, och makrofag spridning på pepCD47 funktionaliserade ytor (Figur 5A) jämfört med de kala metallkontrollerna (Figur 5 B,C).
Bild 1: Schematisk återgivning av de steg som är inblandade i appending pepCD47 till metallytor. (A) De rena metallproverna bakades vid 220 °C för att oxidera metallytan. De bisphosphonate grupperna av den polallylamine bisphosphonate med latent thiolgrupper (PABT) bildade koordinerar förbindelser med belägga med metall oxider och täcker belägga med metall ytbehandlar för att bilda en functionalized monolayer. De PABT belagda metallytorna behandlades vidare med TCEP för deprotection av tiolengrupperna. (B) Strukturen av PEI-PDT och symbolisk representation. (C) De PABT-belagda och TCEP-reducerade ytorna behandlades med PEI-PDT som förstärkte det totala antalet tioolreaktiva grupper som var tillgängliga för fastsättning av den tiolerade peptiden. Slutligen pei-PDT belagda ytor reagerade med terminal cystein grupper av pepCD47, och peptiden var fäst på ytan via disulfide bindningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Bestämma immobiliseringsdensiteten hos pepCD47 på metallyta. 1 cm x 1cm metallfolier modifierades med hjälp av ökande koncentrationer (10, 30, 100 och 200 μg/mL) av fluorophore konjugerad pepCD47. Överskottet peptid togs bort med hjälp av flera tvättsteg sedan behandlas med 1 mL TCEP lösning att klyva fluorophore konjugerade fluorophore. Koncentrationen av peptiden kovalent fästs på metallyta var analyseras fluorimetrically med hjälp av en standard kurva beredd med definierade koncentrationer av fluorophore konjugerat pepCD47. Immobiliseringsdensiteten representerades som ng/cm² av peptid som fästes på metallytan. Data uttrycks som medelvärde ± SEM och är representativ för minst tre oberoende experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Fluorescensmikroskopiavbildning av den rostfria ytan som modifierats med TAMRA-konjugerad pepCD47. Rostfria mesh diskar, efter varandra modifierade med PABT, TCEP, PEI-PDT (A) eller omodifierade (B) reagerades med TAMRA-konjugerad pepCD47. Den korrekt konjugerade och kontroll nakna metallmaskor var omfattande tvättas och avbildas vid 100x förstoring. Skalstångens längd är 100 μm. Var god klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Utvärdera akuta antiinflammatoriska och antitrombotiska funktioner hos pepCD47. 0,65 cm x 1cm metallfolier var belagda med 100 μg/mL av antingen mänskliga pepCD47 eller förvrängd peptid och utsätts för blod i Chandler loop apparaten. De obundna cellerna avlägsnades genom tvättning med PBS och folierna fixerades i 2% glutaraldehyd. Den omodifierade, kodade modifierade och mänskliga pepCD47 modifierade ytor inkuberades sedan med CFDA färgämnet för 15 minuter vid 37 ° C, tvättas med PBS och analyseras med hjälp av en fluorescens mikroskop. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: En prevalens av CD68-positiva makrofager på de kala och pepCD47-funktionaliserade metallytorna. Råtta perifert blod-härledda monocyter var isolerade av gradient densitet centrifugation följt av negativa immunoselection med magnetiska microbeads. 5 x 105 monocyter tillsattes i brunnarna i en 12 brunnsplatta med individuellt placerade kalmetallfolieprover (N=3) eller de prover som härletts med råtta pepCD47. Macrophage differentiering stimulerades av 100 ng/ml M-CSF. Sex dagar efter sådd cellerna var fast, och immunostained med anti-råtta CD68 antikroppar, sekundära Alexa Fluor-546 (röd) konjugerad antikropp och motverkas med Hoechst 33342 nukleära färgämne (blå). Representativa bilder av den kala metallen (A) och pepCD47-functionalized (B) ytor fångades vid 200x förstoring och samman. Skalstångens längd är 100 μm. Var god klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerar och beskriver en relativt ny kemisk strategi för att lägga till terapeutisk peptid moieties till en rostfri yta med det övergripande målet att minska ytans reaktivitet med inflammatoriska celler som finns i blodet. Bisfosfonatkemin som beskrivs häri innebär att man koordinerar bindningsbildning mellan metalloxiderna och bisfosfonatgrupperna av PABT. Tjockleken på polybisfosfonat monolayer bildas på metallyta inte överstiger 5 nm18, och, därför, är oviktiga för de potentiella proinflammatory effekterna av den tjocka polymer beläggningar20. Deprotection av latent thiol grupp i alifatiska sidan kedjor av PABT primler de metallytor för ytterligare kemisk modifiering med tiool-reaktiva föreningar. PEI-PDT är förgrenad polyetenimin (genomsnittlig Mw=25 000) i vilken ~20% av etyleniminlänkarna modifieras med tioolreaktiva pyridyldithio-grupper. Eftersom endast en minoritet av PDT-grupper i PEI-PDT konsumeras i reaktionen med de PABT-härledda tioler, ändras ytkemin efter PEI-PDT-tjudra till tiool-reaktiv för att möjliggöra fastsättning av tiolerade peptider18. Denna kemiska strategi utvecklades och används ofta i vårt labb för fastsättning av flera biomolekyler, såsom rekombinanta proteiner14, peptider14,17, och viral genvektorer18 till metallytan. Även om PABT för det mesta av vårt arbete har använt rostfria ytor kan interagera med andrametallegeringar 21 och därmed ha potential att förbättra biokompatibiliteten och den terapeutiska potentialen hos ett brett spektrum av metalliska biomaterial.
Vår nuvarande metodik indikerar att den maximala immobiliseringsdensiteten av fluoroforekonjugerad pepCD47 på metallytor är 180 ng/cm2, vilket är mindre jämfört med våra tidigare publicerade data17. Vi tillskriver denna diskrepans till de olika tvättstrategier som används i båda studierna. I vårt nuvarande protokoll har vi använt SDS som helt tar bort icke-kovalent bundna peptider jämfört med Tween-20 som användes i våra inledande studier. 180 ng/cm2 motsvarar dock cirka 4 x 106 molekyler/μm2 av pepCD47. Denna immobiliseringsdensitet är mycket högre än de fysiologiska nivåerna av CD47 på cellytor som är ungefär 390 molekyler/μm2,22. Således förutspår vi att stränga tvättvillkor inte skulle avsevärt påverka de antiinflammatoriska egenskaperna hos pepCD47 modifierade metallytor.
Denna metodik av fastsättning av pepCD47 till metall är mycket reproducerbar, men det finns flera steg i protokollet som behöver noggrann uppmärksamhet. För det första, efter beläggning av metallytan med PABT och minska den med hjälp av TCEP, är de tioler benägna att oxidation när de utsätts för luft. Således är det av yttersta vikt att ytorna alltid är nedsänkta i avgasat vatten. Av samma skäl görs PEI-PDT-lösningen i avgasat vatten och argon tillsätts till injektionsflaskan under inkubation av folier belagda med PEI-PDT. För det andra måste man överväga potentialen för utfällning av löslubiliserade peptider. PepCD47 har en terminal cystein rester, liksom cystein rester i sekvensen. Således, när felaktigt lagras, det finns en stor möjlighet att peptiderna polymerisera och fällning ut ur lösningen. För att åtgärda detta potentiella problem rekommenderas att peptiderna ska minskas med hjälp av TCEP-pärlor i 20 min till 1 h före inkubation med PEI-PDT belagda ytor. TCEP skulle bidra till att minska peptiderna och öka deras löslighet i deras respektive spädningsvätska. Det rekommenderas också att tränga undan omgivningsluft med argon i injektionsflaskan medan inkubering av PEI-PDT-belagd prover med tiolerad peptid.
Om ovan nämnda försiktighetsåtgärder följs är beläggningstekniken reproducerbar och den enda potentiella begränsningen för detta tillvägagångssätt är den kommersiella icke-tillgängligheten av reagenserna PABT och PEI-PDT.
Vi använde en Chandler loop apparat för att ge ex vivo proof of concept analys för att förstå samspelet mellan pepCD47 modifierade metallytor med blodkroppar och det har framgångsrikt använts av vårt labb för att visa de antiinflammatoriska egenskaperna hos pepCD47 belagda ytor14,15,17,23. I denna studie använde vi CFDA färgämne som fluorescerar först efter att ha kommit in i cellerna när acetat grupper av färgämnet är klyvda av den intracellulära esteras. Fördelarna med denna färgning förfarande är att det fläckar de anucleated blodplättarna och röda blodkroppar samt de kärnor som de kärnor celler såsom leukocyter. Således, utnyttja CFDA färgämne ger en bedömning av både akut anti-trombotisk och anti-självhäftande egenskaper av pepCD47 belagda ytor. Mer detaljerad bedömning kan förvärvas genom scanning elektronmikroskopi och / eller immunfärgning, som vi båda detaljerade tidigare24. Resultaten av den aktuella studien validerar att de mänskliga pepCD47-belagda metallytorna är anti-trombotiska och antihäftande jämfört med de omodifierade och förvrängda sekvenskontrollerna.
För att ytterligare undersöka om pepCD47-modifierade ytor ändra tillväxt egenskaper av bifogade inflammatoriska celler, bare metal rostfritt stål folier eller folier formulerade med pepCD47 utsattes för isolerade råtta monocyter i närvaro av syngeneic M-CSF. Cellerna var odlade under stationära förhållanden i 6 dagar för att tillåta fenotypisk omvandling och expansion av makrofager. I enlighet med våra tidigare resultat som observerats i de olika experimentellainställningar 14,en djupgående minskning av inflammatoriska cell nummer på pepCD47 functionalized ytor visades i den aktuella studien.
Således bevisar våra studier i slutändan att romanen polybisfosfonat kemi för beläggning av metaller med pepCD47 är ett effektivt sätt att förbättra biokompatibilitet av metallytor och kan tillämpas i andra biomedicinska tillämpningar, såsom konstgjorda leder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Protokollutveckling och studier som presenterades i detta dokument stöddes av NIH (NBIB) R01 finansiering (# EB023921) till IF och SJS, och NIH (NHLBI) R01 finansiering (# HL137762) till IF och RJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W.
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
