Summary
Presentato qui è un protocollo per l'aggiunta di peptide CD47 (pepCD47) a stent metallici usando la chimica del polibisfosfonato. La funzionalizzazione degli stent metallici utilizzando pepCD47 impedisce l'attacco e l'attivazione di cellule infiammatorie migliorando così la loro biocompatibilità.
Abstract
Le complicazioni chiave associate agli stent bare metal e agli stent di eluizione dei farmaci sono rispettivamente la restenosi in-stent e la trombosi dello stent tardivo. Pertanto, migliorare la biocompatibilità degli stent metallici rimane una sfida significativa. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere una robusta tecnica di modifica della superficie metallica da parte di peptidi biologicamente attivi per aumentare la biocompatibilità degli impianti medici che contattano il sangue, compresi gli stent endovascolari. CD47 è un marcatore immunologico specifico per specie di sé e ha proprietà antinfiammatorie. Studi hanno dimostrato che un peptide aminoacido 22 corrispondente al dominio Ig del CD47 nella regione extracellulare (pepCD47), ha proprietà antinfiammatorie come la proteina a figura intera. Studi in vivo sui ratti e studi ex vivo su sistemi sperimentali di conigli e sangue umano del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'immobilizzazione pepCD47 sui metalli migliora la loro biocompatibilità prevenendo l'attaccamento e l'attivazione delle cellule infiammatorie. Questo documento descrive il protocollo passo-passo per la funzionalizzazione delle superfici metalliche e l'attacco peptidico. Le superfici metalliche sono modificate utilizzando bisfosfato di poliallammina con gruppi tioli latenti (PABT), seguiti dalla deprotezione dei tioli e dall'amplificazione dei siti tiolo-reattivi per reazione con polietileneimina installata con gruppi piridilditio (PEI-PDT). Infine, pepCD47, incorporando residui terminali di cisteina collegati alla sequenza peptidica del nucleo attraverso un doppio distanziale 8-ammino-3,6-diossa-ottanoil, sono attaccati alla superficie metallica tramite legami disolfuro. Questa metodologia di attacco peptidico alla superficie metallica è efficiente e relativamente economica e può quindi essere applicata per migliorare la biocompatibilità di diversi biomateriali metallici.
Introduction
L'intervento coronarica percutanea è la prima linea di terapia per il trattamento delle malattie coronarie (CAD) e comporta principalmente lo stenting delle arterie mante. Tuttavia, la restenosi in-stent (ISR) e la trombosi stent sono complicazioni comuni associate alla distribuzione stent1. L'interazione del sangue all'interfaccia sangue-stent è caratterizzata da un adsorbimento quasi immediato delle proteine plasmatiche sulla superficie metallica, seguito da attacco piastrinica e cellulare infiammatorio e attivazione2. Il rilascio delle citochine infiammatorie e delle chemiochine dalle cellule infiammatorie attivate porta alla modifica fenotipica delle cellule muscolari lisce vascolari (VSPC) nel supporto di tunica e innesca la loro migrazione centripeta al compartimento intimale. La proliferazione del VSMC attivato nell'intima si traduce in ispessimento dello strato intimale, restringimento del lume e restenosi in-stent3. Gli stent di eluizione dei farmaci (DES) sono stati sviluppati per prevenire la proliferazione vsmc; tuttavia, questi farmaci hanno un effetto citotossico fuori bersaglio sulle cellule endoteliali4,5. Pertanto, la trombosi dello stent tardivo è una complicazione comune associata al DES6,7. Gli stent fatti di polimeri biodegradabili, come il poli-L-lactide, hanno mostrato molte promesse negli esperimenti sugli animali e negli studi clinici iniziali, ma alla fine sono stati richiamati quando l'uso clinico "reale" ha dimostrato la loro inferiorità alla3a generazione DES8. Pertanto, è necessario migliorare la biocompatibilità degli stent bare metal per ottenere risultati migliori per i pazienti.
CD47 è una proteina transmembrana espressa onnipresente che inibisce la risposta immunitaria innata quando è legata al suo recettore imparentato Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. Il recettore SIRPα ha un dominio ITIM (Immune Cell Tyrosine Inhibitory Motif) e gli eventi di segnalazione sull'interazione SIRPα - CD47 alla fine si traducono nella downregolazione dell'attivazione cellulareinfiammatoria 10,,11,,12,,13. La ricerca nel nostro laboratorio ha dimostrato che il CD47 ricombinante o la sua derivata peptidica, corrispondente al dominio Ig aminoacido 22 della regione extracellulare di CD47 (pepCD47), può ridurre la risposta immunitaria dell'ospite a una gamma di biomateriali clinicamenterilevanti 14,,15,,16. Recentemente, abbiamo dimostrato che pepCD47 può essere immobilizzato su superfici stent in acciaio inossidabile e ridurre significativamente la risposta fisiopatofitica associata alla restenosi. Si noti che le superfici modificate pepCD47 sono adattabili alle condizioni di utilizzo rilevanti come lo stoccaggio a lungo termine e la sterilizzazione dell'ossido dietilene 17. A tal fine, pepCD47 può essere un utile bersaglio terapeutico per affrontare i limiti clinici degli stent endovascolari.
La strategia per l'attacco covalente di pepCD47 a una superficie metallica comporta una serie di nuove modifiche chimiche della superficie metallica. Le superfici metalliche sono rivestite per la prima volta con bisfosfonato di poliallammina con gruppi tioli latenti (PABT), seguiti dalla deprotezione dei tioli e dall'attacco della polietileneimina (PEI) con gruppi piridilditio installati (PDT). I gruppi PDT di PEI non consumati nella reazione con tioli PABT deprotetti vengono quindi reagiti con pepCD47 incorporando tioli nei residui terminali di cisteina, con conseguente legame del pepCD47 alla superficie metallica attraverso un legame disolfuro14,,17,18. Abbiamo usato un pepCD47 coniugato al fluoroforo (TAMRA-pepCD47) per determinare la concentrazione di ingresso del peptide che si traduce nella massima immobilizzazione superficiale del peptide. Infine, abbiamo valutato la capacità antinfiammatoria acuta e cronica delle superfici metalliche rivestite in pepCD47, ex vivo, utilizzando rispettivamente l'apparato ad anello Chandler e il test di attacco monocito / espansione del macrofago.
Questo documento fornisce un protocollo sistematico per l'attacco di peptidi tiolati alla superficie metallica; determinare la massima densità di immobilizzazione del peptide; e valutare le proprietà antinfiammatorie delle superfici metalliche rivestite in pepCD47 esposte al sangue intero e ai monociti isolati.
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Protocol
Tutti i campioni umani per questo esperimento sono stati ottenuti in conformità con l'IRB del Children's Hospital di Filadelfia. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti previa approvazione da parte della IACUC del Children's Hospital di Filadelfia.
1. Rivestimento di superfici bare metal con PEI-PDT
- Lavare i tagliandi in lamina di acciaio inossidabile (1 cm x 1 cm o 0,65 cm x 1 cm) o i dischi in rete in acciaio inossidabile con 2-isopropanolo in uno shaker (60 °C, velocità di 200 giri/min) per 5 min. Eseguire questo passaggio 2x. Quindi lavare 2 volte con cloroformio (60 °C, velocità di 200 giri/min) per 10 minuti ciascuno.
- Posizionare i campioni di acciaio inossidabile puliti in un forno a 220 °C per 30 minuti.
- Preparare 5 mL dello 0,5% della soluzione PABT sciogliendo 25 mg di bisfosfonato di poliallammina con gruppi latali latenti (PABT) e 5 mg di bicarbonato di potassio (KHCO3)in 5 mL di DDW e incubare a 72 °C in uno shaker a 200 giri/min per 30 minuti.
NOTA: Per la sintesi PABT fare riferimento alla letteratura precedentementepubblicata 18. - Immergere i fogli al forno o i dischi a rete in una soluzione acquosa allo 0,5% di PABT e incubare in uno shaker (72 °C, velocità di 200 giri/min) per 1 h.
- Lavare i campioni modificati con PABT con acqua distillata deionizzata (DDW) per 5x, trasferire i campioni in una nuova fiala e lavare di nuovo con DDW per 5x.
- Preparare un totale di 5 mL di soluzione di TCEP (12 mg/mL) sciogliendo 60 mg di cloridrato di fosfina tris (2-carbossietile) (TCEP) in 5 mL di tampone acetico da 0,1 M (0,57 mL di acido acetico glaciale, 820 mg di acetato di sodio in 100 mL di DDW).
- Trattare i campioni modificati con PABT con TCEP per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) su uno shaker.
NOTA: Il TCEP viene utilizzato per deproteggere i gruppi tiolo. - Degas DDW in un pallone inferiore rotondo utilizzando un dispositivo di generazione del vuoto, come un liofilizzatore e lavare i fogli trattati con TCEP o dischi a rete con DDW degassato per 5x. Trasferire i campioni in una nuova fiala e lavare inoltre 5 volte con DDW degassato.
NOTA: È fondamentale lavorare velocemente per prevenire l'ossidazione dei tioli sulla superficie metallica da parte dell'ossigeno atmosferico. - Preparare 5 mL di soluzione PEI-PDT all'1% di diluizione di 212,5 μL di PEI-PDT stock e 125 μL di acetato di sodio 0,4 M in DDW degassato. Eseguire il passaggio 1.9 contemporaneamente al passaggio 1.8 per ridurre al minimo l'esposizione dei campioni all'aria atmosferica.
NOTA: La sintesi di PEI-PDT è descritta nella letteratura precedentemente pubblicata18. - Incubare i provini in acciaio inossidabile lavati con l'1% di PEI-PDT. Sostituire l'aria con gas argon, sigillare i flaconcini ermetici e mescolare su uno shaker a RT per 1 h. Procedere immediatamente con la coniugazione peptidica o conservare a 4 °C fino a 1 settimana.
2. Attaccamento e valutazione qualitativa/quantitativa della ritenzione di pepCD47 coniugata al fluoroforo sulla superficie metallica mediante microscopia a fluorescenza e fluorimetria
- Lavare i tagliandi foil o i dischi a rete preparati come descritto nella sezione 1, passaggi 1.1-1.10 precedenti con DDW 5x. Trasferire i campioni su un nuovo flaconcino e lavare con DDW per ulteriori 5x. Infine lavare 2x con etanolo degassato e 2x con dimetil formamide degassata (DMF).
- Preparare la soluzione stock di pepCD47 coniugata con tetrametillrhodamina (TAMRA) sciogliendo la polvere pepCD47 coniugata tamra nella dimetilformamide degassata (DMF) a una concentrazione finale di 1 mg/mL. Aliquota la soluzione stock in assegnazioni da 1 mL. Conservare in tubi ben sigillati in atmosfera argon a -20 °C.
- Diluire 1 mg/mL della soluzione stock di pepCD47 coniugato con TAMRA utilizzando DMF degassato per preparare le seguenti concentrazioni di pepCD47 coniugato al fluoroforo - 10, 30, 100 e 200 μg/mL.
NOTA: Se il pepCD47 coniugato da TAMRA sembra precipitato, ridurre la soluzione pepCD47 coniugata da TAMRA in magazzino utilizzando perline TCEP nel rapporto 1:1, a RT per 20 minuti. Si noti che prima di aggiungere il pepCD47 coniugato TAMRA alle perline TCEP, ruotare la soluzione di perline TCEP, rimuovere il supernatante e quindi procedere con l'aggiunta del pepCD47 coniugato TAMRA. - Incubare i tagliandi in foil modificati PEI-PDT con 10, 30, 100 o 200 μg/mL di pepCD47 coniugato DA TAMRA in triplicati per ogni condizione su uno shaker a RT in atmosfera argon per 1 ora. Incubare dischi mesh modificati PEI-PDT, così come il disco mesh non modificato oltre il passaggio 1.2 (controlli bare metal) con 100 μg/mL di pepCD47 coniugato TAMRA in triplicati a RT in atmosfera argon su uno shaker per 1 h.
NOTA: Da questo passaggio in poi, le fiale sono avvolte in un foglio di alluminio per proteggere il contenuto dalla luce. - Lavare le superfici rivestite di pepCD47 coniugate al fluoroforo per rimuovere il peptide non covalentemente attaccato nel seguente ordine: DMF (3x), DMF/DDW a 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS in 20 mM Tris pH 7.4 (3x, 5 min ciascuno a 70 °C su uno shaker), DDW (3x), cambiare flaconcini e un lavaggio DDW finale.
- Posizionare il controllo e i dischi a rete coniugati covalentemente su un vetro del microscopio, aggiungere 50 μL di PBS e posizionare una coverlip. Dischi a rete di immagini che utilizzano un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un set di filtri romammina. Scatta immagini rappresentative con ingrandimento 100x.
- Preparare 15 mL di soluzione TCEP da 12 mg/mL sciogliendo 180 mg di TCEP in miscela 1:1 v/v di metanolo e tampone acetico da 0,1 M.
- Incubare ogni foglio lavato con 1 mL di soluzione TCEP su uno shaker a RT per 15 minuti.
- Preparare i seguenti standard diluire in serie lo stock di pepCD47 coniugato tamra (1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,01 μg/mL. Utilizzare la soluzione TCEP come diluente.
- Analizzare il pepCD47 coniugato TAMRA rilasciato dalla superficie metallica rispetto alla curva di calibrazione generata utilizzando gli standard della fluorimetria a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione a 544/590 nm.
3. Fissaggio di pepCD47 umano a superfici modificate PEI-PDT
- Lavare i campioni rivestiti in PEI-PDT formulati come descritto nella sezione 1, passaggi 1.1-1.10 precedenti, con DDW 5x degassato, cambiare il flaconcino e lavare con DDW 5x degassato.
- Preparare la soluzione di brodo pepCD47 umano (1 mg/mL) sciogliendo la polvere di pepCD47 umano in acido acetico degassato al 50% per ottenere una concentrazione di 1 mg/mL.
- Preparare la concentrazione di lavoro del pepCD47 umano (100 μg/mL) sciogliendo 500 μL dello stock di pepCD47 umano in 4.500 μL di saline tamponata con fosfato degassato (PBS).
- Incubare i campioni rivestiti in PEI-PDT lavati con 100 μg/mL di pepCD47 a RT con scuotimento per 1 h.
- Lavare i campioni rivestiti con pepCD47 umano per rimuovere il peptide in eccesso nel seguente ordine PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min ciascuno), DDW (3x), cambiare flaconcini e lavaggio DDW finale.
NOTA: Le superfici rivestite in pepCD47 umano possono essere conservate asciutte a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
4. Rivestire le superfici modificate PEI-PDT con sequenza strapazzata (Scr)
- Sciogliere la polvere di sequenza strapazzata in acido acetico degassato dello 0,1% per preparare una soluzione stock di 1 mg/mL.
- Preparare una soluzione di 100 μg/mL di peptide strapazzato sciogliendo 500 μL di acido acetico in 4.500 μL di acido acetico degassato allo 0,1%.
- Rivestire i campioni di PEI-PDT lavati con 100 μg/mL di peptide strapazzato a RT con scuotimento per 1 h.
- Per rimuovere il peptide strapazzato non attaccato, lavare le superfici nel seguente ordine 0,01% acido acetico (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), cambiare flaconcini e un lavaggio DDW.
5. Ciclo Chandler per l'analisi dell'attacco cellulare alle superfici metalliche
- Rivestire le lamine metalliche (0,65 cm x 1 cm) con pepCD47 umano o peptide strapazzato secondo la descrizione della sezione 1 seguita da 3 o 4.
- Tagliare tubi in PVC da 1/4" in tre pezzi lunghi 38 cm.
- Inserire fino a 8 fogli metallici modificati peptidici o pepCD47 non modificati in tre tubi diversi.
- Raccogliere 30 mL di sangue da donatori umani sani senza farmaci anti-piastrinica secondo il protocollo istituzionale IRB. Precaricare la siringa con 1 ml di citrato di sodio al 4% per prevenire la coagulazione del sangue raccolto.
- Mettere 10 ml di sangue in ogni tubo utilizzando una siringa da 10 ml e collegare le estremità con adattatori metallici. Posizionare i tubi pieni di sangue sulle ruote dell'apparato ad anello Chandler.
- Passare il sangue lungo le lamine metalliche per rotazione della ruota a 37 °C alla velocità calcolata per produrre la cesoia di 25 dyns/ cm2 per 4 ore.
- Scolare il sangue dai tubi e smaltire il sangue secondo i requisiti IRB.
- Tagliare i tubi usando il bisturi per recuperare le pellicole da ogni tubo.
- Preparare la soluzione di glutaraldeide al 2% diluire i 10 ml di soluzione di glutaraldeide al 4% utilizzando 10 ml di tampone di cacodilato di sodio con cloruro di sodio da 0,1 M.
- Incubare i fogli in soluzione di glutaraldeide al 2% per 15 minuti e conservare a 4 °C durante la notte. Prima di analizzare, lavare le pellicole metalliche 3 volte con PBS.
6. Analisi dell'attacco cellulare alle superfici metalliche utilizzando il colorante CFDA
- Caldo 8 ml di PBS in tubo da 15 mL in un bagno d'acqua impostato su 37 °C.
- Preparare la soluzione di colorante CFDA (carbossi-fluoresceina diacetato, estere succinimidilico) come segue - aggiungere 90 μL di DMSO a una fiala colorante CFDA per ottenere una concentrazione di scorte di 10 mM. Successivamente, preparare la concentrazione di lavoro di 93,75 μM aggiungendo 75 μL del CFDA stock a 8 mL di PBS caldo. Mescolare invertendo i tubi un paio di volte e coprire il tubo con un foglio di alluminio.
NOTA: Si consiglia di preparare al momento il colorante CFDA prima di ogni utilizzo. - Incubare ogni foglio con 1 mL di colorante CFDA in una piastra da 24 pozza. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare la piastra a 37 °C per 15 minuti.
- Lavare i fogli metallici 3x con PBS per rimuovere il colorante in eccesso. Immagine che utilizza il microscopio a fluorescenza invertita.
7. Attacco monocito ed espansione del macrofago sulle superfici pepCD47 modificate e bare metal
- Raccogliere 10 mL di sangue periferico attraverso l'accesso vena cava durante il sacrificio di un topo Sprague-Dawley maschio da 400-450 g. Mescolare immediatamente con 1.000 UI di eparina di sodio per prevenire la coagulazione.
- Pipetta 10 mL di mezzo gradiente di densità in un tubo conico da 50 ml. Mescolare il sangue con 5 mL di PBS e sovrapporre accuratamente il sangue diluito sul mezzo gradiente di densità utilizzando una pipetta Pasteur. Centrifuga in un rotore a benna oscillante a 800 x g e 18-25 °C per 20 minuti con impostazioni minime di accelerazione e decelerazione.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, raccogliere uno strato opaco di cappotto buffy sull'interfaccia tra plasma e Ficoll. Diluire il mantello buffy 1:3 con PBS e centrifuga a 550 x g e 4 °C per 10 min per le cellule del mantello buffy.
- Sospendere di nuovo le cellule del mantello di buffy in 3 mL di tampone di lysis ACK per lizzare gli eriociti contaminanti. Incubare sul ghiaccio per 4 minuti. Aggiungere 12 mL di buffer di separazione cellulare (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
- Centrifuga a 550 x g e 4 °C per 10 min. Sospendere di nuovo il pellet in 10 mL di CSB.
- Centrifuga a 200 x g e 4 °C per 10 minuti per eliminare le piastrine. Ripeti due volte.
- Sospendere di nuovo il pellet in 500 μL di CSB. Aggiungere 10 μg di ciascuno dei seguenti anticorpi anti-ratto del mouse: CD8a (clone OX-8), anti-CD5 (clone OX-19), anti-CD45RA (clone OX-33) e anti-CD6 (clone OX-52).
- Incubare a 4 °C su un rotatore verticale del tubo per 1 h. Aggiungere 9,5 mL di CSB. Centrifuga a 300 x g e 4 °C per 10 min. Scartare il supernatante, sospendere di nuovo il pellet in 10 mL di CSB e ripetere la centrifugazione.
- Sospendere di nuovo il pellet in 500 μL di CSB. Aggiungere 150 μL di microperline IgG di capra anti-topo. Incubare a 4 °C su un rotatore verticale del tubo per 20 min. Centrifuga a 300 x g e 4 °C per 10 min.
- Scartare il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet in 1 mL di CSB.
- Posizionare una colonna LS in un separatore magnetico. Innescare la colonna LS con 3 mL di CSB. Eliminare la velocità effettiva della colonna. Aggiungere 1 mL di pellet di cella ri-sospeso dal passo 7.10. Inizia a raccogliere la velocità effettiva. Dopo l'interruzione del flusso, aggiungere 5 mL di CSB e continuare a raccogliere la velocità effettiva della colonna fino all'interruzione del flusso.
- Centrifugare la velocità effettiva della colonna (6 mL) contenente monociti selezionati negativamente a 300 x g e 4 °C per 10 min. Sospendere nuovamente il piccolo pellet risultante in 2 mL di mezzo RPMI-1640 integrato con 10% FCS, 1% penna/streptocondo e 100 ng/mL ratto macrofago colonia fattore stimolante (M-CSF).
- Conta i monociti usando l'emocitometro. Regolare la concentrazione di monociti a 5 x 105 celle/mL.
- Aggiungere 1 mL di volumi di sospensione monocitare ai singoli pozzi di una piastra da 12 pozzali con i campioni di lamina di acciaio inossidabile nudo (N=3) o campioni di acciaio inossidabile modificati con pepCD47 di ratto (N=3) come da 1.1-1.10 e 3.1-3.6.
- Cambiare il mezzo nei giorni 3 e 5 dopo la semina. Il giorno 6 dopo la semina lavare le cellule con PBS e fissare con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 15 min. Lavare due volte con PBS per 5 minuti.
- Rimuovere le lamine in acciaio inossidabile e posizionarle singolarmente in una nuova piastra da 12 pozza. Non capovolgere i fogli.
- Incubare in 0,5% Tween-20/PBS per 15 minuti per permeabilizzare le cellule. Lavare due volte con PBS per 5 minuti.
- Blocca nel siero di capra al 10% / PBS per 20 minuti. Aspirare il siero. Non lavare. Aggiungere l'anticorpo CD68 anti-ratto del topo (diluito 1:100 in 1%BSA/PBS). Incubare a temperatura ambiente per 1 h. Lavare 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere capra anti-mouse IgG Alexa Fluor 546 (diluito 1:200 in 1% BSA/PBS). Incubare al buio a temperatura ambiente per 45 minuti. Lavare in PBS per 5 minuti. Controsostenibile con colorante Hoechst 33342 da 1 μg/mL al buio a temperatura ambiente per 10 min. Lavare 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
- Capovolgere le pellicole e l'immagine utilizzando un microscopio fluorescente con l'ottica invertita. Acquisisci immagini con ingrandimento 200x con impostazioni del filtro blu e rosso.
- Contare i monociti allegati nelle singole immagini e calcolare le medie di gruppo e le deviazioni standard.
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Representative Results
Le superfici metalliche sono rese tiolo-reattive per l'attacco peptidico attraverso una serie di modifiche chimiche, come illustrato nella figura 1. L'incubazione PABT seguita dal trattamento PEI-PDT rende la superficie metallica suscettibile per l'attacco peptidico. Peptide CD47 (pepCD47) contenente residui di cisteina a C-terminale uniti alla sequenza pepCD47 del nucleo attraverso un ponte duale AEEAc flessibile è collegato covalentemente alle superfici tiolo-reattive tramite legami disolfuro. Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato che pepCD47 rimane stabilmente attaccato alla superficie metallica per un massimo di sei mesi e può resistere alle normali sollecitazioni fisiologiche di taglio e alle procedure disterilizzazione 17.
La massima ritenzione peptidica è stata determinata aggiungendo pepCD47 coniugato da TAMRA alla superficie metallica seguita dal lavaggio ese esteso per eliminare peptide non legato in modo covalente, scissione di TAMRA-pepCD47 mediante riduzione dei ponti disolfuro che legano il peptide alla superficie e quantificazione analitica utilizzando un saggio fluorimetrico. In particolare, l'aumento delle quantità di input di pepD47 coniugato da TAMRA (1 mL di soluzione da 10 a 200 μg/mL) è stato aggiunto alle superfici rivestite PEI-PDT e lavato più volte per rimuovere il peptide non legato in modo covalente. La concentrazione di pepCD47 coniugato TAMRA covalentemente legato è stata determinata utilizzando un agente riducente TCEP per rilasciare il peptide collegato covalentemente e valutandone la fluorescenza rispetto agli standard. La concentrazione di ingresso di 10, 30, 100 e 200 μg/mL ha dimostrato una ritenzione peptidica di 28 ± 2, 78 ± 2, 182 ± 14 e 157 ± 25 ng/cm2 rispettivamente (figura 2). Pertanto, la massima densità di immobilizzazione del pepCD47 sulla superficie metallica è stata trovata di circa 180 ng/cm2 che è stata raggiunta con una concentrazione di ingresso di 100 μg/mL. La corretta immobilizzazione del pepCD47 coniugato TAMRA sulle superfici metalliche modificate PABT/PEI-PDT è stata ulteriormente corroborata dalla microscopia a fluorescenza (Figura 3) che ha dimostrato una fluorescenza uniforme emessa dalla superficie dei dischi di rete trattati con pepCD47 coniugati da TAMRA (Figura 3A). Sulla superficie delle maglie di controllo prive di modifica PABT/PEI-PDT (Figura 3B) è stata rilevata solo una fluorescenza minima, escludendo così un pepCD47 coniugato TAMRA non specificamente legato come principale fonte di fluorescenza.
Successivamente, abbiamo valutato la capacità delle superfici rivestite di pepCD47 di prevenire l'attacco cellulare acuto ematico rispetto alle superfici modificate peptidiche di sequenza non modificata e strapazzate. Il peptide scramble ha la stessa composizione di amminoacidi di pepCD47 ma in un ordinediverso 14,,17. L'attacco cellulare ematico è stato valutato dalla rotazione del sangue da volontari umani sani su superfici modificate non modificate, strapazzate e pepCD47 nell'apparato ad anello Chandler seguite dal lavaggio per rimuovere le cellule non attaccate, la fissazione e la colorazione con colorante CFDA. Le superfici sono state visualizzate mediante microscopia a fluorescenza. Coerentemente con i nostri datiprecedentemente pubblicati,,le superfici rivestite in pepCD4717 mostrano una drastica riduzione dell'attaccamento delle cellule ematiche rispetto ai controlli criptati modificati e non modificati (Figura 4).
Per espandere gli effetti della modifica della superficie pepCD47 sull'attacco e la proliferazione delle cellule infiammatorie, abbiamo utilizzato l'immunoselezione negativa delle cellule del mantello di buffy del ratto per isolare imonociti 19e coltivato i monociti isolati su bare metal e fogli di acciaio inossidabile modificati pepCD47 per 6 giorni in presenza di M-CSF. I risultati di questo studio mostrano un'attenuazione combinata del 58% dell'attacco monocito acuto, la loro conversione fenotipico in macrofagi e la proliferazione dei macrofagi sulle superfici funzionalizzate pepCD47 (Figura 5A) rispetto ai controlli bare metal(figura 5 B,C).
Figura 1: Rappresentazione schematica dei passaggi necessari per aggiungere pepCD47 alle superfici metalliche. (A) I campioni di metallo pulito sono stati cotti a 220 °C per ossidare la superficie metallica. I gruppi bisfosfonati del bisfosfonato di polililammina con gruppi tiolo latenti (PABT) formavano legami coordinati con gli ossidi metallici e rivestivano le superfici metalliche per formare un monostrato funzionalizzato. Le superfici metalliche rivestite pabt sono state ulteriormente trattate con TCEP per la deprotezione dei gruppi tiolo. (B) La struttura del PEI-PDT e la rappresentazione simbolica. (C) Le superfici rivestite con PABT e tcep sono state trattate con PEI-PDT che ha amplificato il numero totale di gruppi tiolo-reattivi disponibili per il fissaggio del peptide tiolato. Infine, le superfici rivestite in PEI-PDT sono state reagite con gruppi di cisteina terminale di pepCD47, e il peptide è stato attaccato alla superficie tramite legami disolfuro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Determinazione della densità di immobilizzazione del pepCD47 sulla superficie metallica. Fogli metallici da 1 cm x 1 cm sono stati modificati utilizzando concentrazioni crescenti (10, 30, 100 e 200 μg/mL) di pepCD47 coniugato al fluoroforo. Il peptide in eccesso è stato rimosso utilizzando diversi passaggi di lavaggio quindi trattati con soluzione TCEP da 1 mL per scindere il fluoroforo coniugato al fluoroforo. La concentrazione del peptide legato covalentemente alla superficie metallica è stata analizzata fluorimetricamente utilizzando una curva standard preparata con concentrazioni definite di pepCD47 coniugato al fluoroforo. La densità di immobilizzazione era rappresentata come ng/cm² di peptide attaccato alla superficie metallica. I dati sono espressi come ± SEM ed è rappresentativo di almeno tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging a microscopia a fluorescenza della superficie in acciaio inossidabile modificata con pepCD47 coniugato TAMRA. Dischi in rete in acciaio inossidabile, modificati consecutivamente con PABT, TCEP, PEI-PDT (A) o non modificati(B) sono stati reagite con pepCD47 coniugato TAMRA. Le maglie bare metal correttamente coniugate e di controllo sono state ampiamente lavate e immagini con ingrandimento 100x. La lunghezza della barra di scala è di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione delle funzioni antinfiammatorie acute e anti-trombotiche del pepCD47. Fogli metallici da 0,65 cm x 1 cm sono stati rivestiti con 100 μg/mL di pepCD47 umano o peptide strapazzato ed esposti al sangue nell'apparato ad anello Chandler. Le cellule non unite sono state rimosse lavando con PBS e le lamine sono state fissate in glutaraldeide al 2%. Le superfici modificate pepCD47 non modificate, strapazzate e umane sono state poi incubate con il colorante CFDA per 15 minuti a 37 °C, lavate con PBS e analizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Prevalenza di macrofagi positivi al CD68 sulle superfici metalliche bare e pepCD47. I monociti periferici derivati dal sangue del ratto sono stati isolati dalla centrifugazione a densità gradiente seguita da immunoselezione negativa con microperline magnetiche. 5 x 105 monociti sono stati aggiunti nei pozzi di una piastra di 12 pouf con campioni di lamina di metallo nudo posizionati individualmente (N=3) o i campioni derivati con pepCD47 di ratto. La differenziazione dei macrofagi è stata stimolata da 100 ng/ml di M-CSF. Sei giorni dopo la semina le cellule sono state fissate, e immunostained con anticorpo CD68 anti-ratto, anticorpo coniugato Alexa Fluor-546 (rosso) secondario e controsostenuto con colorante nucleare Hoechst 33342 (blu). Le immagini rappresentative delle superfici bare metal (A) e pepCD47-funzionalizzate(B) sono state catturate con ingrandimento 200x e fuse. La lunghezza della barra di scala è di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dimostriamo e descriviamo una strategia chimica relativamente nuova per aggiungere moieties peptidiche terapeutiche a una superficie in acciaio inossidabile con l'obiettivo generale di ridurre la reattività della superficie con cellule infiammatorie trovate nel sangue. La chimica del bisfosfonato descritta nel presente documento comporta la coordinazione della formazione di legami tra gli ossidi metallici e i gruppi bisfosfonati del PABT. Lo spessore del monostrato di polibisfosfonato formato sulla superficie metallica non supera i 5 nm18e, pertanto, è insignificante per i potenziali effetti proinfiammatori dei rivestimenti polimerici spessi20. La deprotezione del gruppo tiolo latente nelle catene laterali alifatiche del PABT innesca le superfici metalliche per ulteriori modifiche chimiche con composti tiolo-reattivi. La PEI-PDT è polietilenimina ramificata (media Mw=25.000) in cui ~20% dei legami etileneimina vengono modificati con gruppi piridilditio tiolo-reattivi. Poiché solo una minoranza di gruppi PDT in PEI-PDT viene consumata nella reazione con i tioli derivati dal PABT, la chimica superficiale dopo il tethering PEI-PDT viene cambiata in tiolo-reattivo per consentire l'attacco di peptidi tiolati18. Questa strategia chimica è stata sviluppata e ampiamente utilizzata nel nostro laboratorio per l'attacco di diverse biomolecole, come proteine ricombinanti14,peptidi14,,17e vettori genetici virali18 alla superficie metallica. Sebbene, per la maggior parte del nostro lavoro abbiamo utilizzato superfici in acciaio inossidabile, PABT può interagire con altre leghemetalliche 21 e quindi ha il potenziale per migliorare la biocompatibilità e il potenziale terapeutico di una vasta gamma di biomateriali metallici.
La nostra metodologia attuale indica che la densità massima di immobilizzazione del pepCD47 coniugato al fluoroforo sulle superfici metalliche è di 180 ng / cm2, che è inferiore rispetto ai nostri datiprecedentemente pubblicati 17. Attribuiamo questa discrepanza alle diverse strategie di lavaggio utilizzate in entrambi gli studi. Nel nostro attuale protocollo abbiamo utilizzato SDS che rimuove completamente peptidi non legati in modo covalente rispetto a Tween-20 che è stato utilizzato nei nostri studi iniziali. Tuttavia, 180 ng/cm2 corrisponde a circa 4 x 106 molecole/μm2 di pepCD47. Questa densità di immobilizzazione è molto più elevata dei livelli fisiologici di CD47 sulle superfici cellulari che sono circa 390 molecole/μm2,22. Pertanto, prevediamo che condizioni di lavaggio rigorose non influenzerebbero in modo significativo le proprietà antinfiammatorie delle superfici metalliche modificate pepCD47.
Questa metodologia di attaccamento del pepCD47 al metallo è altamente riproducibile, tuttavia ci sono diversi passaggi nel protocollo che necessitano di un'attenta attenzione. In primo luogo, dopo aver rivestito la superficie metallica con PABT e averla riduzione con TCEP, i tioli sono soggetti ad ossidazione quando esposti all'aria. Pertanto, è della massima importanza che le superfici siano sempre immerse in acqua degassata. Per lo stesso motivo la soluzione PEI-PDT viene realizzata in acqua degassata e l'argon viene aggiunto ai flaconcini durante l'incubazione di fogli rivestiti con PEI-PDT. In secondo luogo, si deve considerare il potenziale per la precipitazione dei peptidi solubilizzati. PepCD47 ha un residuo terminale di cisteina, così come residui di cisteina nella sequenza. Pertanto, se conservati in modo improprio, c'è un'alta possibilità che i peptidi polimerizzino e precipitino fuori dalla soluzione. Per affrontare questo potenziale problema, si raccomanda di ridurre i peptidi utilizzando perline TCEP da 20 min a 1 h prima dell'incubazione con superfici rivestite in PEI-PDT. Il TCEP aiuterebbe a ridurre i peptidi e ad aumentare la loro solubilità nei rispettivi diluenti. Si consiglia inoltre di spostare l'aria ambiente con argon nelle fiale mentre si incubano i campioni rivestiti di PEI-PDT con peptide tiolato.
Se vengono seguite le precauzioni di cui sopra, la tecnica di rivestimento è riproducibile e l'unica potenziale limitazione per questo approccio è la mancata disponibilità commerciale di reagenti PABT e PEI-PDT.
Abbiamo utilizzato un apparato ad anello Chandler per fornire una prova ex vivo dell'analisi concettuale per comprendere l'interazione delle superfici metalliche modificate pepCD47 con le cellule del sangue ed è stato utilizzato con successo dal nostro laboratorio per mostrare le proprietà antinfiammatorie delle superfici rivestite in pepCD4714,,15,,17,,23. In questo studio, abbiamo usato il colorante CFDA che fluoresce solo dopo essere entrati nelle cellule quando i gruppi di acetati del colorante vengono scissi dall'esterasi intracellulare. I benefici di questa procedura di colorazione sono che macchia le piastrine anucleate e i globuli rossi, nonché le cellule nucleate come i leucociti. Pertanto, l'utilizzo del colorante CFDA fornisce una valutazione delle proprietà anti-trombotiche acute e antiadesive delle superfici rivestite in pepCD47. Una valutazione più dettagliata può essere acquisita attraverso la microscopia elettronica a scansione e / o l'immunostaining, entrambi dettagliati inprecedenza 24. I risultati dell'attuale studio convalidano che le superfici metalliche rivestite in pepCD47 umano siano anti-trombotiche e antiadesive rispetto ai controlli di sequenza non modificati e strapazzati.
Per indagare ulteriormente se le superfici modificate pepCD47 alterano le caratteristiche di crescita delle cellule infiammatorie attaccate, fogli di acciaio inossidabile bare metal o fogli formulati con pepCD47 sono stati esposti a monociti di ratto isolati in presenza di M-CSF sigeneico. Le cellule sono state coltivate in condizioni stazionarie per 6 giorni per consentire la conversione fenotipico e l'espansione dei macrofagi. In conformità con i nostri precedenti risultati osservati nelle diverse impostazioni sperimentali14, nello studio attuale è stata dimostrata una profonda diminuzione del numero di cellule infiammatorie sulle superfici funzionalizzate pepCD47.
Pertanto, i nostri studi alla fine dimostrano che la nuova chimica del polibisfosfonato per il rivestimento dei metalli con pepCD47 è un modo efficace per migliorare la biocompatibilità delle superfici metalliche e può essere applicata in altre applicazioni biomediche, come le articolazioni artificiali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo sviluppo del protocollo e gli studi presentati in questo documento sono stati supportati dai finanziamenti NIH (NBIB) R01 (# EB023921) a IF e SJS e dai finanziamenti NIH (NHLBI) R01 (# HL137762) a IF e RJL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH - 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
References
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