Summary
本文详细介绍了如何构建大鼠肝相（肝缺血）动物模型，促进肝移植后缺血-输液损伤的基础研究。
Abstract
大鼠的正畸肝移植 （OLT） 是一种经过验证的动物模型，用于术前、术中和术后研究，包括肝外器官的缺血-输液损伤 （IRI）。此模型需要大量的实验和设备。肝相的持续时间与移植后开发 IRI 的时间密切相关。在这个实验中，我们利用血动力学的变化诱导大鼠的肝外器官损伤，并确定了最大耐受时间。对于不同的器官来说，直到最严重的器官损伤的时间各不相同。这种方法可以很容易地复制，也可用于研究肝移植后肝外器官的IRI。
Introduction
缺血性输液损伤（IRI）是肝脏移植后常见的并发症。肝 IRI 是一个病理过程，涉及缺血介导细胞损伤和肝脏再输液异常恶化。肝ARI和局部与生俱来的免疫反应可分为冷热ARI，根据临床环境的差异1。热 IRI 是由干细胞损伤引起的，通常由肝脏移植、休克和创伤2引起。冷ARI是由内皮细胞和外周循环3引起的肝移植并发症。临床报告显示，肝IRI与10%的早期器官衰竭有关，并可能增加急性和慢性排斥的发病率4，5。此外，肝ARI也可能诱发多种器官功能障碍综合征或全身炎症反应综合征，死亡率高6.肝外器官介入的患者往往在医院停留更长的时间，花更多的钱，并有一个更差的预后7。并发症的发展与肝移植8的肝移植阶段的长度密切相关。
1973年，美国李教授首次报道了大鼠骨科肝移植（OLT）。实验操作采用缝合法模拟临床肝移植步骤、血管和普通胆管（CBD）的解剖步骤。这个过程是困难和耗时的，成功率低9。1979年，Kamada等人创造性地使用"双袖法"对门户静脉进行解剖，在26分钟内控制肝炎期，从而大大改善了大鼠的OLT。同年，齐默尔曼提出了"单胆汁支架法"。在李安工作的基础上，齐默尔曼利用聚乙烯管直接对捐赠人和接受者的CBD进行解剖，简化了CBD的重建，保留了括约肌的功能，使之成为OLT模型11的胆汁重建标准。1980年，宫田等人提出了"三袖法"，即门户静脉（PV）、超肝静脉卡瓦（SVC）和内皮静脉卡瓦（IVC）被袖口法麻醉。然而，有扭曲的管子与这种方法的风险，这可能导致阻碍劣质的静脉曲道倒流12。1983年，"双袖法"被提出使用袖口法进行光伏和IVC的解剖，但采用SVC13的缝合方法。这种方法被全球学者采用，以建立OLT模型。此后，袖口解剖步骤得到改善，缩短了肝病期，提高了14只大鼠的存活率。同样，改进的方法用于临床实践，以缩短肝阶段15。然而，肝移植后对IRI的基础研究表明，存活率与肝外器官的损伤程度成反比。因此，需要进一步的研究，需要一个简单和可重复的动物模型来模拟肝移植后的IRI。
基于肝相的定义，我们模拟了肝移植的造血变化，导致大鼠肝外器官的IRI。在此，我们提供了如何建立大鼠肝相（肝缺血）动物模型的详细描述，以促进肝移植后对IRI的基础研究。
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Protocol
动物伦理委员会批准了广西医科大学（No20190920）的实验。所有动物均由广西医科大学动物实验中心提供。我们使用SPF雄性斯普拉格道利大鼠（200-250克，10-12周），保持在室温下25±2°C和湿度50±10%。喂食在手术前24小时停止：然而，提供了水。
注：一名操作员无需显微外科或手术显微镜即可执行所有操作。
1. 操作
- 称量后，用异氟化物麻醉大鼠 （5%）使用动物麻醉机。
- 1-2分钟后，用钳子轻轻夹住老鼠的脚趾。如果大鼠在捏捏后没有反应，它已进入麻醉状态。使用兽医软膏的眼睛，以防止干燥。使用动物加热灯将大鼠的体温保持在37-38°C。
- 腹部消毒（波维酮碘溶液）后，将鼠固定在动物解剖台上。使用钳子和剪刀在 xiphoid 工艺下方 3 厘米处切口中位数。
- 打开腹腔，用缩管暴露肝脏，并调动肝胃韧带。使用棉签轻轻地翻转肝脏的中叶，并向上转动以暴露肝炎。识别中央商务区、光伏和医管局。
- 用棉签将小肠向左下腹腔推，用湿纱布盖住，并将内湿静脉卡瓦移到右肾静脉。
- 用眼内镜片和用3-0丝线标记的钳子隔离入口静脉、肝动脉和右肾静脉上方的劣质静脉卡瓦，每个都带有一个滑结。
- 切开左下肢皮肤，用眼钳露出股骨静脉。慢慢地通过股骨静脉注射低分子量肝素625 IU/kg，使整个身体肝素化。
- 用3-0号缝合的右肾静脉上方的入口静脉、肝动脉和劣质静脉卡瓦，持续45分钟（图1）。更换腹腔中的小肠，用纱布盖住。减少这些期间的吸入麻醉。
- 45分钟后，释放入口静脉、肝动脉和右肾静脉上方的劣质静脉卡瓦。
- 缝合肌肉和皮肤，一层一层，并终止吸入麻醉。每4小时使用皮下吗啡5毫克/千克提供术后镇痛。
- 观察大鼠，直到它清醒，并在25±2°C的温度和50±10%的湿度下喂养。动物加热灯是必要的。
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Representative Results
老鼠对肝缺血的耐受性
在这个动物模型中，在操作过程中血管被放出的部位显示在图1中。大鼠被随机分成5组进行缺血15分钟（I15组）、30分钟（I30组）、45分钟（I45组）、60分钟（I60组）和假组，每组10只大鼠。手术后14天观察到每组的存活率。所有老鼠在I15组、I30组和假组存活下来。在I45组，有8人存活了14天，在I60组中只有2人幸存下来。这些结果表明，大鼠可以忍受肝相最多45分钟（表1）。
血管结结对大鼠循环的影响
在实验中，生物系统记录了肝相前后的心率和血压（右内胡萝卜动脉导管）。我们发现大鼠的心率和平均动脉压力（MAP）在血管结结后发生了巨大变化（图2）。
对肝外器官的影响
肝缺血性充血和水肿发现于肠道、胃静脉曲张和连体后脾脏。80只大鼠被随机分成8组进行缺血45分钟（T0）、6小时（T6）、12小时（T12）、24小时（T24）、48小时（T48）、72小时（T72）、7天（D7）和14天（D14）。大鼠被牺牲后，肾脏、胰腺、小肠、心脏和肺部的组织被取走并染上血红素-eosin（HE）。整个染色过程由五个步骤组成：除垢、染色、脱水、透明和密封。除了心脏，病理分数被分配为先前描述的16，17，18，19。
肝外器官受最大伤害的时间各不相同：胰腺手术后6-24小时，肺部手术24-48小时。肠道和肾脏在缺血45分钟后受了重伤。手术后24小时肠道粘膜没有明显异常，肾脏在48小时后恢复。输液后，在手术后24-48小时内发现局部心肌细胞坏死、细胞分裂和溶解、炎症细胞渗透以及局部血管增生和充血（图3）。
肺
缺血后在肺组织中发现中性粒细胞渗透。随着输液时间（T0，T6）的增加，支气管流明的粘液也可以在肺组织中看到。炎症细胞渗入发生在白杨壁上，严重变厚。在一些组织中也可以看到白体的崩塌和白体腔的消失。在白杨壁上没有明显的水肿或毛细木堵塞。手术后24-48小时，他们受了重伤，一些大鼠在手术后7天出现呼吸困难和其他表现。HE染色结果表明，气道内淋巴腺炎、气道壁中轻度炎症细胞渗入以及局部出血（图3A，图4）。
肾脏
在T0期缺血后，在肾脏管中发现了少量嗜酸物质，但没有发现炎症细胞渗透和其他异常。然而，肿胀的肾管上皮细胞，多孔或真空细胞质，坏死细胞在几个流明，卡约皮克尼病，碎片，刷边界损失，和管状酸性组在许多流明手术后6-48小时看到。此外，在手术后48小时内，还看到少量肾管上皮细胞出现颗粒变性，多孔和轻微染色的细胞质出现。发现明显的间歇性端粒体，但没有严重的炎症细胞渗透（图3B，图5）。
小肠
小肠在缺血（T0）后伤势最重。有严重的炎症细胞渗透，粘膜上皮脱落，和端粒体。随着输液时间的增加，伤势迅速痊愈。手术后24小时，粘膜上皮完全恢复，只看到轻微的炎症细胞渗入（图3C，图6）。
胰腺
严重炎症细胞在T0阶段渗透到胰腺组织周围。然而，胰腺病变并不均匀。十分之六的人在手术后24小时有胰腺坏死和炎症渗透，另外4人没有明显的异常。手术后24小时，除了炎症细胞的渗透外，还有水肿、间歇空间扩大、出血、少量阴囊细胞坏死、细胞分界线不明确、核分裂和溶解，以及视觉领域轻度炎症细胞渗入。然后，炎症慢慢消失（图3D，图7）。
心
到T0阶段，心脏肌细胞定期排列，具有清晰的分界、正常的细胞形态、局部间质充血和温和的棕黄色色素沉积。此外，在心肌间歇和近膜区域观察到炎症细胞渗透。随着输液时间的增加，手术后24-48小时内，在组织内发现了局部心肌细胞坏死、细胞分裂和溶解、炎症细胞渗透、局部血管化和充血。在一些标本中可以看到心室扩张、多孔结构、心肌间活动增加和轻度炎症细胞渗透。48小时后，局部心肌细胞消失，取而代之的是少量纤维结缔组织，具有轻度炎症细胞渗透。到那时，没有发现其他明显的异常（图8）。
血动力学变化对肝脏、肾脏、胰腺和心脏血清学指数的影响
收集血清，通过自动生化分析仪检测出亚氨基氨基转移酶（ALT）、阿斯巴酸盐氨基转移酶（AST）、肌氨酸和淀粉酶的水平。与病理变化不同，所有指标均在24-48小时内达到峰值。虽然这些水平在手术后48小时正常，但病理损伤仍在继续（图9）。
图1：连体位置：光伏、HA、IVC右肾静脉上部。请点击这里查看此图的较大版本。
| 组 | n | 生存在24小时，n（%） | 生存在7天，n（%） | 生存在14 d，n（%） |
| 假 | 10 | 10 | — | — |
| I 15分钟 | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| I 30分钟 | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| I 45分钟 | 10 | 8/10 | 8/10 (80) | 8/10 (80) |
| I 60分钟 | 10 | 2/10 | 2/10 (20) | 2/10 (20) |
表1：大鼠对肝缺血的耐受性
图2：I45分钟组的血型变化。请点击这里查看此图的较大版本。
图3：器官组织学的分数。 （A） 肺：（B） 肾脏：（C） 肠子：（D） 胰腺：*与假组（P <0.05）相比，统计学意义显著。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：手术后肺部的病理变化。（A） 沙姆集团：（B） 缺血组（T0组）：（C） 输液 6 小时 （T6） 组：（D） 输液 12 小时 （T12） 组：（E） 输液 12 小时 （T12） 组：（F） 24小时（T24）组：（G） 输液 48 小时 （T48） 组：（H） 输液 7 天 （D7） 组：（I） 输液 14 天 （D14） 组 （缩放 50μm）。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图5：手术后肾脏的病理变化。（A） 沙姆集团：（B） 缺血组（T0组）：（C） 输液 6 小时 （T6） 组：（D） 输液 12 小时 （T12） 组：（E） 输液 12 小时 （T12） 组：（F） 24小时（T24）组：（G） 输液 48 小时 （T48） 组：（H） 输液 7 天 （D7） 组：（I） 输液 14 天 （D14） 组 （缩放 50μm）。请点击这里查看此数字的较大版本。
图6：手术后小肠的病理变化。 （B） 缺血组（T0组）：（C） 输液 6 小时 （T6） 组：（D） 输液 12 小时 （T12） 组：（E） 输液 12 小时 （T12） 组：（F） 24小时（T24）组：（G） 输液 48 小时 （T48） 组：（H） 输液 7 天 （D7） 组：（I） 输液 14 天 （D14） 组 （缩放 50μm）。请点击这里查看此数字的较大版本。
图7：手术后胰腺的病理变化。 （B） 缺血组（T0组）：（C） 输液 6 小时 （T6） 组：（D） 输液 12 小时 （T12） 组：（E） 输液 12 小时 （T12） 组：（F） 24小时（T24）组：（G） 输液 48 小时 （T48） 组：（H） 输液 7 天 （D7） 组：（一） 输液 14 天 （D14） 组（A和D比例尺 50μm：BCEFGHI比例尺 50 μm）。请点击这里查看此数字的较大版本。
图8：手术后心脏的病理变化。 （A） 沙姆集团：（B） 缺血组（T0组）：（C） 输液 6 小时 （T6） 组：（D） 输液 12 小时 （T12） 组：（E） 输液 12 小时 （T12） 组：（F） 24小时（T24）组：（G） 输液 48 小时 （T48） 组：（H） 输液 7 天 （D7） 组：（一） 输液14天（D14）组（A 级50μm： BC德菲希 规模100μm）。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图9：每组ALT、AST、肌氨酸（Cr）和淀粉酶的变化：*与假组（P<0.05）相比，统计学意义显著。请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
大鼠OLT是研究肝移植、IRI、移植排斥、免疫耐受性、移植病理学和药理学、同质移植和异种移植器官保存的理想模型。目前，它已广泛应用于肝移植的实验研究。
在试验性研究中，我们首先对五巴比妥钠进行腹膜内麻醉，发现这导致术后死亡率高，对血动性变化的耐受性短。因此，我们在随后的试验中使用吸入麻醉剂，以快速开始行动和快速排除 体外 特征。转向吸入麻醉显著改善了大鼠的耐受时间和术后存活率。调查人员应注意大鼠的呼吸和心率，以防止过量麻醉。生物系统可用于监测心率和血压。我们还观察到手术缝合厚度对血管连片的影响。虽然小于3-0的线条可以完全排出血管，但它们很难松动，并可能导致血管破裂。相反，大于 3-0 的线可能导致血管闭塞不完整，从而防止血动力学变化。这些物质问题将在今后的实验中得到改善。我们的协议存在一些限制。不建议热灯进行温度维护，因为热灯可能过热：建议替代加热建议，如再循环水毯，为动物的利益。
OLT后器官脱离损伤的原因有很多。首先，损伤可能是由体 外20的捐赠者肝脏的冷保存引起的。其次，当血液供应在长期缺血后恢复组织（输液）时，IRI可能发生并导致组织损伤。缺血是造成伤害的主要原因，输液是造成伤害的过程。在肝病阶段同时阻断 IVC 和 PV 后，下肢和内脏出现大量血停滞。有效流通量（ECV）急剧下降，MAP减少。然而，由于迷走神经刺激，大鼠的心率没有补偿性增加。在这个实验中，我们发现大鼠在连体和血管释放后5分钟内发生了显著的血动力学变化，这符合缺血-输液综合征的定义。
缺血发生在肝脏外的一些组织中。肝相后，ECV增加。在 IVC 和 PV 被解除阻塞后，MAP 恢复正常，输液后在肝脏外发生伤害。此外，捐献者肝脏的IRI产生炎症调节剂（TNF-α，间质-1，内露金-6，内露金-8），攻击分离器官21。在本实验中，模拟了肝阶段的造血学，造成 IVC 和肾脏的被动充血、胃肠道屏障损伤、细菌转移、SVC 所在器官的缺血（例如肺、心脏、胰腺、肾脏等），以及 IRI 对肝外器官的 IRI。
病理学结果表明，缺血损伤的高峰期和恢复时间各有不同。虽然在这项研究中无法模拟由免疫因子引起的冷储存和损伤，但可以复制和与其他动物模型进行肝外器官损伤研究。我们的模型和OLT模型可以比较和观察，为研究肝外器官损伤提供依据。此外，我们的模型类似于一些临床肝脏手术，如希拉尔胆管癌。希拉尔胆管癌是一种恶性肿瘤，经常侵入光伏或 IVC，在手术22期间经常需要光伏夹紧。进行了肝门户重建：当肿瘤侵入 IVC 时，还需要对 IVC 进行术内夹紧，由此产生的血动力学变化与我们的模型一致。
综上所述，我们的大鼠模型易于使用，简单明了，无需显微外科，为肝缺血后肝外器官IRI的基础研究提供了依据。
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Disclosures
这份手稿的作者没有利益冲突可以披露。
Acknowledgments
我们要感谢广西医科大学第二附属医院的李文涛博士和吴继华博士提出的有益建议。作者要感谢我们的队友们的有益评论和讨论。作者还要感谢JoVE的匿名评论者和编辑们的评论。特别感谢袁医生的父母们的不断支持和鼓励。这项工作得到了宁波市自然科学基金委员会（2014A610248）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde solution | Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd | P804536 | |
| air drying oven | Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd. | BPG | |
| Alanine aminotransferase (ALT)Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K235-S | |
| ammonia | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10002118 | |
| amylase Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K005-M | |
| anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 100092183 | |
| Animal anesthesia machine | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | R640 | |
| aspartate aminotransferase (AST)kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03040 | |
| automatic biochemical analyzer. | SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd. | 2400 | |
| Biosystems (when nessary) | Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd. | BL-420F | |
| Centrifuge | Baiyang Medical Instrument Co., Ltd. | BY-600A | |
| cover glass | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd | 10212432C | |
| creatinine Kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03076 | |
| dewatering machine | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Donatello Series 2 | |
| embedding machine | Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd. | KH-BL1 | |
| frozen machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| hematoxylin-eosin dye solution | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| high-efficiency paraffin wax | Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd | Q/YSQN40-91 | |
| hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10011018 | |
| intraocular lens (IOL)forceps | Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd. | JTZRN | |
| Isoflurane | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | — | |
| micro Scissors(when nessary) | Shanghai Surgical Instrument Factory | WA1010 | |
| needle holders | Shanghai Surgical Instrument Factory | J32010 | |
| neutral gum | Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd. | — | |
| normal optical microscope | Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd | Nikon Eclipse CI | |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | J3CO30 | straight |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | JD1060 | bending |
| ophthalmic Scissors | Shanghai Surgical Instrument Factory | J1E0 | |
| pathological slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| pipettes | Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd. | 7010101008 | |
| retractors | Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd. | JNT-KXQ | |
| scanner | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Pannoramic 250 | |
| slide | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G6004 | |
| xylene | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 1330-20-7 |
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