Summary
Dieses Papier enthält eine detaillierte Beschreibung, wie man ein Tiermodell der anhepatischen Phase (Leberischämie) bei Ratten baut, um die Grundlagenforschung zur Ischämie-Reperfusionsverletzung nach einer Lebertransplantation zu erleichtern.
Abstract
Orthotopische Lebertransplantation (OLT) bei Ratten ist ein bewährtes Tiermodell, das für präoperative, intraoperative und postoperative Studien verwendet wird, einschließlich Ischämie-Reperfusionsverletzungen (IRI) von extrahepatischen Organen. Dieses Modell erfordert zahlreiche Experimente und Geräte. Die Dauer der anhepatischen Phase hängt eng mit der Zeit zusammen, iri nach der Transplantation zu entwickeln. In diesem Experiment verwendeten wir hämodynamische Veränderungen, um extrahepatische Organschäden bei Ratten zu induzieren und die maximale Toleranzzeit zu bestimmen. Die Zeit bis zur schwersten Organverletzung variierte für verschiedene Organe. Diese Methode kann leicht repliziert werden und kann auch verwendet werden, um IRI der extrahepatischen Organe nach lebertransplantation zu studieren.
Introduction
Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist eine häufige Komplikation nach Lebertransplantation. Hepatische IRI ist ein pathologischer Prozess mit Ischämie-vermittelten Zellschäden und abnormale Verschlechterung der Leberreperfusion. Leber-IRI und die lokale angeborene Immunantwort können in heiße und kalte IRI unterteilt werden, je nach Unterschieden in der klinischen Umgebung1. Hot IRI wird durch Stammzellverletzungen induziert, in der Regel als Folge von Lebertransplantation, Schock und Trauma2. Cold IRI ist eine Komplikation der Lebertransplantation, die durch Endothelzellen und periphere Zirkulation verursacht wird3. Klinische Berichte haben gezeigt, dass Leber IRI mit 10% der frühen Organversagen verbunden ist und kann die Inzidenz von akuter und chronischer Abstoßung erhöhen4,5. Darüber hinaus kann Leber IRI auch mehrere Organdysfunktionssyndrome oder systemische Entzündliche Reaktionssyndrom induzieren, mit hoher Mortalität6. Patienten mit extrahepatischer Organbeteiligung neigen dazu, länger im Krankenhaus zu bleiben, mehr Geld auszugeben und eine schlechtere Prognose7zu haben. Die Entwicklung von Komplikationen ist eng mit der Länge der anhepatischen Phase der Lebertransplantation8verbunden.
Orthotopische Lebertransplantation (OLT) bei Ratten wurde erstmals 1973 vom amerikanischen Professor Lee berichtet. Die experimentelle Operation simulierte die Schritte der klinischen Lebertransplantation und die Anastomose der Blutgefäße und den gemeinsamen Gallengang (CBD) mit der Nahtmethode. Das Verfahren ist schwierig und zeitaufwändig mit einer geringen Erfolgsrate9. 1979 verbesserten Kamada et al. olT bei Ratten deutlich, indem sie kreativ die "Zwei-Manschetten-Methode" für anastomose der Portalvene nutzten, um die anhepatische Phase innerhalb von 26 Minuten10zu kontrollieren. Im selben Jahr schlug Zimmermann die "Single Biliary Stent-Methode" vor. Auf der Grundlage von Lees Arbeit verwendete Zimmermann Polyethylenrohre, um das CBD des Spenders und Empfängers direkt zu anastomose, vereinfachte die Rekonstruktion von CBD und bewahrte die Funktion des Schließmuskels, und diese Methode wurde zum Standard für die Gallenrekonstruktion der OLT-Modelle11. 1980 schlugen Miyata et al. die "Drei-Manschetten-Methode" vor, bei der die Portalvene (PV), die suprahepatische Vena cava (SVC) und die intrahepatische Vena cava (IVC) durch die Manschettenmethode anastomosed wurden. Es besteht jedoch die Gefahr einer Verzerrung der Kanüle mit dieser Methode, die zur Obstruktion eines minderwertigen Vena-Cava-Refluxs12führen kann. 1983 wurde die "Zwei-Manschetten-Methode" mit der Manschettenmethode für die Anastomose der PV und IVC vorgeschlagen, aber die Nahtmethode für den SVC13übernommen. Diese Methode wurde von Wissenschaftlern weltweit angenommen, um OLT-Modelle zu etablieren. Seitdem wurden die Anastomoseschritte der Manschette verbessert, um die anhepatische Phase zu verkürzen und die Überlebensrate der Ratten14zu verbessern. In ähnlicher Weise werden verbesserte Methoden in der klinischen Praxis verwendet, um die anhepatische Phase15zu verkürzen. Die Grundlagenforschung zu IRI nach einer Lebertransplantation hat jedoch gezeigt, dass die Überlebensrate umgekehrt mit dem Grad der Verletzung von extrahepatischen Organen zusammenhängt. Daher ist weitere Forschung erforderlich, und ein einfaches und reproduzierbares Tiermodell ist erforderlich, um IRI nach einer Lebertransplantation zu simulieren.
Basierend auf der Definition der anhepatischen Phase simulierten wir die hämodynamischen Veränderungen in der Lebertransplantation, die zu IRI von extrahepatischen Organen bei Ratten führten. Hierin bieten wir eine detaillierte Beschreibung, wie man ein Tiermodell der anhepatischen Phase (Leberischämie) bei Ratten baut, um die Grundlagenforschung zu IRI nach einer Lebertransplantation zu erleichtern.
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Protocol
Die Tierethikkommission genehmigte das Experiment der Guangxi Medical University (No20190920). Alle Tiere wurden vom Animal Experiment Center der Guangxi Medical University versorgt. Wir verwendeten SPF Männchen Sprague Dawley Ratten (200-250 g, 10-12 Wochen), gehalten unter der Raumtemperatur von 25 ± 2°C und Feuchtigkeit von 50 ± 10%. Die Fütterung wurde 24 Stunden vor dem Betrieb gestoppt; wasserversorgt war.
HINWEIS: Ein Bediener kann alle Operationen ohne Mikrochirurgie oder chirurgisches Mikroskop durchführen.
1. Betrieb
- Nach dem Wiegen die Ratten mit Isofluran ansien (5%) mit einer Tieranästhesiemaschine.
- Nach 1-2 Minuten die Zehen der Ratte vorsichtig mit einer Pinzette einklemmen. Wenn die Ratte nach dem Kneifen nicht reagiert, ist sie in einen Zustand der Anästhesie eingetreten. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern. Verwenden Sie Tierheizungslampen, um die Körpertemperatur der Ratten bei 37-38 °C zu halten.
- Nach der Abdominaldesinfektion (Povidon-Jodlösung) die Ratte auf dem Tierseziertisch fixieren. Machen Sie einen mittleren Schnitt von 3 cm unter dem xiphoiden Prozess mit Zangen und Schere.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle, setzen Sie die Leber mit einem Retraktor aus und mobilisieren Sie das hepatogastrische Band. Verwenden Sie Wattestäbchen, um den mittleren Lappen der Leber sanft umzudrehen und drehen Sie ihn nach oben, um die Porta hepatis freizulegen. Identifizieren Sie CBD, PV und HA.
- Schieben Sie den Dünndarm mit Wattestäbchen in Richtung der linken unteren Bauchhöhle, bedecken Sie ihn mit nasser Gaze und bewegen Sie die intrahepatische Vena cava in die rechte Nierenvene.
- Isolieren Sie die Portalvene, die Leberarterie und die untere Vena cava oberhalb der rechten Nierenvene mit einer Intraokularlinse und Zangen, die mit 3-0 Seidenfaden markiert sind, jeweils mit einem Schlupfknoten.
- Schneiden Sie die linke und rechte untere Extremität san und belichten Sie die Oberschenkelvene mit ophthalmologischen Zangen. Injizieren Sie langsam niedermolekulares Heparin 625 I.E./kg durch die Femoralvene, um den ganzen Körper zu heparinisieren.
- Ligate die Portalvene, Leberarterie, und unterlegene Vena Cava über der rechten Nierenvene mit Nr. 3-0 Nähte, dauere 45 Minuten (Abbildung 1). Ersetzen Sie den Dünndarm in der Bauchhöhle und bedecken Sie ihn mit Gaze. Reduzieren Sie die Inhalationsanästhesie während dieser Perioden.
- Nach 45 Minuten, lassen Sie die Portalvene, leberarteriende arterien, und die unterlegene Vena cava über der rechten Nierenvene.
- Den Muskel und die Haut schichtenund befolgen und die inhalative Anästhesie beenden. Stellen Sie postoperative Analgesie mit subkutanem Morphin von 5 mg/kg alle 4 Stunden zur Verfügung.
- Beobachten Sie die Ratte, bis sie wach ist, und füttern Sie sie unter einer Temperatur von 25 ± 2 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 ± 10 %. Tierheizungslampen sind notwendig.
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Representative Results
Rattentoleranz gegenüber Leber-Ischämie
In diesem Tiermodell sind die Stellen, an denen Blutgefäße während des Betriebs ligiert wurden, in Abbildung 1dargestellt. Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in 5 Gruppen für Ischämie für 15 Minuten (I15-Gruppe), 30 Minuten (I30-Gruppe), 45 Minuten (I45-Gruppe), 60 Minuten (I60) und Scheingruppe mit 10 Ratten in jeder Gruppe eingeteilt. Die Überlebensrate jeder Gruppe wurde 14 Tage nach der Operation beobachtet. Alle Ratten überlebten in der I15-Gruppe, I30-Gruppe und Scheingruppe. Acht überlebten 14 Tage in der I45-Gruppe, und nur 2 überlebten in der I60-Gruppe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ratten die anhepatische Phase für maximal 45 Minuten vertragen könnten (Tabelle 1).
Auswirkungen der Gefäßligation auf den Kreislauf bei Ratten
Während des Experiments zeichnete Biosystems die Herzfrequenz und den Blutdruck (rechte interne Karotisarterienintubation) vor und nach der anhepatischen Phase auf. Wir fanden heraus, dass sich die Herzfrequenz und der mittlere arterielle Druck (MAP) von Ratten nach der Gefäßligation dramatisch veränderten (Abbildung 2).
Auswirkungen auf extrahepatische Organe
Hepatische Ischämie Überlastung und Ödeme wurden im Darm gefunden., Magenvarizen, und Splenomegalie nach Ligation. Achtzig Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in 8 Gruppen für Ischämie für 45 Minuten (T0), Reperfusion für 6 Stunden (T6), 12 Stunden (T12), 24 Stunden (T24), 48 Stunden (T48), 72 Stunden (T72), 7 Tage (D7) und 14 Tage (D14) eingeteilt. Nachdem die Ratten geopfert wurden, wurden Gewebe aus der Niere, der Bauchspeicheldrüse, dem Dünndarm, dem Herzen und der Lunge entnommen und mit Hämatoxylin-Eosin (HE) befleckt. Der gesamte Färbeprozess besteht aus fünf Schritten: Entwachsung, Färbung, Austrocknung, Transparenz und Versiegelung. Mit Ausnahme des Herzens wurden pathologische Partituren wie zuvor beschrieben16,17,18,19zugeordnet.
Die Zeit bis zur maximalen Verletzung der extrahepatischen Organe variierte; es war 6-24 Stunden nach der Operation für die Bauchspeicheldrüse und 24-48 Stunden für die Lunge. Der Darmtrakt und die Niere wurden nach 45 Minuten Ischämie am schwersten verletzt. Es gab keine offensichtliche Anomalie der Darmschleimhaut 24 Stunden nach der Operation, und die Nieren erholten sich nach 48 Stunden. Nach der Reperfusion wurden lokale Myokardzellnekrose, Zellfragmentierung und -auflösung, entzündliche Zellinfiltration und lokale Vasodilatation und Verstopfung im Herzen 24-48 Stunden nach der Operation gefunden (Abbildung 3).
Lunge
Neutrophile Infiltration wurde im Lungengewebe nach Ischämie gefunden. Mit der Erhöhung der Reperfusionszeit (T0,T6) konnte auch Schleim des Bronchiallumens im Lungengewebe beobachtet werden. In der Alveolarwand kam es zu einer entzündlichen Zellinfiltration, die stark verdickte. Alveolar Kollaps und Verschwinden der Alveolarhöhle konnten auch in einigen Geweben gefunden werden. Es gab keine signifikantealen Alveolarödeme oder Kapillarstaus in den Alveolarwänden. Sie wurden am schwersten verletzt 24-48 Stunden nach der Operation, mit einigen Ratten zeigen Dyspnoe und andere Manifestationen 7 Tage nach der Operation. HE-Färbungsergebnisse deuteten auf Lymphadenitis in der Atemwege, leichte entzündliche Zellinfiltration in der Alveolarwand und lokale Blutungen hin (Abbildung 3A, Abbildung 4).
Nieren
Eine kleine Menge eosinophilesubstanz wurde in Nierentubuli nach Ischämie in Phase T0 gefunden, aber keine entzündliche Zellinfiltration und andere Anomalien wurden gesehen. Allerdings wurden geschwollene renale tubuläre Epithelzellen, poröses oder vakuoliertes Zytoplasma, nekrotische Zellen in wenigen Lumen, Karyopyknose, Fragmentierung, Pinselrborderverlust und röhrenförmige saure Gruppe in vielen Lumen 6-48 Stunden nach der Operation beobachtet. Darüber hinaus wurde eine kleine Anzahl von renalen tubulären Epithelzellen mit granularer Degeneration und poröses und leicht gefärbtes Zytoplasma 48 Stunden nach der Operation beobachtet. Es wurde eine signifikante interstitielle Telangiektasien, aber keine schwere entzündliche Zellinfiltration gefunden (Abbildung 3B, Abbildung 5).
Dünndarm
Der Dünndarm wurde nach Derischämie (T0) am schwersten verletzt. Es gab schwere entzündliche Zellinfiltration, Schleimhaut-Epithel-Abwurf, und Telangiektasien. Mit der Erhöhung der Reperfusionszeit verheilte die Verletzung schnell. Das Schleimhautepithel wurde 24 Stunden nach der Operation vollständig wiederhergestellt, und es wurde nur eine leichte entzündungshemmende Zellinfiltration beobachtet (Abbildung 3C, Abbildung 6).
Bauchspeicheldrüse
Schwere entzündliche Zellen infiltrierten sich in Phase T0 um das Bauchspeicheldrüsengewebe. Die Bauchspeicheldrüsenläsionen waren jedoch nicht einheitlich. Sechs von zehn hatten 24 Stunden nach der Operation Bauchspeicheldrüsennekrose und entzündliche Infiltration, und die anderen 4 hatten keine offensichtlichen Anomalien. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation gab es neben der Infiltration von Entzündungszellen Ödeme, Eine Verbreiterung des interlobulären Raumes, Blutungen, Nekrose einer kleinen Anzahl von Acinarzellen, unklare Abgrenzung der Zellen, nukleare Fragmentierung und Auflösung sowie eine leichte Entzündungszellinfiltration im Gesichtsfeld. Dann verschwand die Entzündung langsam (Abbildung 3D, Abbildung 7 ).
Herzen
In Phase T0 wurden Herzmyozyten regelmäßig mit klarer Abgrenzung, normaler Zellmorphologie, lokaler interstitielle Verstopfung und milder braun-gelber Pigmentabscheidung angeordnet. Darüber hinaus wurde eine entzündliche Zellinfiltration in interstitiellen und perivaskulären Regionen beobachtet. Mit der Erhöhung der Reperfusionszeit wurden lokale Myokardzellnekrose, Zellfragmentierung und -auflösung, entzündliche Zellinfiltration, lokale Vasodilatation und Verstopfung in Geweben 24-48 Stunden nach der Operation gefunden. Ventrikuläre Dilatation, poröse Struktur, erhöhte Myokardinterstitium, und leichte entzündliche Zellinfiltration wurden in einigen Proben beobachtet. Nach 48 Stunden verschwanden lokale Kardiomyozyten und wurden durch eine kleine Menge faseriges Bindegewebe mit leichter entzündlicher Zellinfiltration ersetzt. Zu diesem Zeitpunkt wurden keine anderen offensichtlichen Anomalien beobachtet (Abbildung 8).
Auswirkungen hämodynamischer Veränderungen auf Leber,Niere, Bauchspeicheldrüse und serologische Indizes des Herzens
Serum wurde gesammelt, und die Konzentrationen von Alanin-Aminotransferase(ALT), Aspartat-Aminotransferase (AST), Kreatinin und Amylase wurden von einem automatischen biochemischen Analysator nachgewiesen. Alle Indikatoren erreichten einen Höchststand von 24-48 Stunden, im Gegensatz zu den pathologischen Veränderungen. Obwohl diese Werte 48 Stunden nach der Operation normal waren, setzten sich die pathologischen Schäden fort (Abbildung 9).
Abbildung 1: Lage der Ligatur: PV, HA, IVC oben der rechten Nierenvene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gruppe | N | Überleben bei 24 h, n (%) | Überleben bei 7 d, n (%) | Überleben bei 14 d, n (%) |
| Sham | 10 | 10 | — | — |
| I 15 Min. | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| I 30 Min. | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| I 45 Min. | 10 | 8/10 | 8/10 (80) | 8/10 (80) |
| I 60 Min. | 10 | 2/10 | 2/10 (20) | 2/10 (20) |
Tabelle 1: Toleranz der Ratten gegenüber Leberischämie
Abbildung 2:Hämodynamische Änderungen in der Gruppe I45 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Partituren der Organhistologie. (A) Lunge; (B) Niere; (C) Darm; (D) Bauchspeicheldrüse; *Statistisch signifikant im Vergleich zur Scheingruppe (P < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Pathologische Veränderungen in der Lunge nach der Operation. (A) Scheingruppe; (B) Ischemia-Gruppe (T0-Gruppe); (C) Reperfusion 6 Stunden (T6) Gruppe; (D) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (E) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (F) Reperfusion 24 Stunden (T24) Gruppe; (G) Reperfusion 48 Stunden (T48) Gruppe; (H) Reperfusion 7 Tage (D7) Gruppe; (I) Reperfusion 14 Tage (D14) Gruppe (Skala 50 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Pathologische Veränderungen in den Nieren nach der Operation. (A) Scheingruppe; (B) Ischemia-Gruppe (T0-Gruppe); (C) Reperfusion 6 Stunden (T6) Gruppe; (D) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (E) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (F) Reperfusion 24 Stunden (T24) Gruppe; (G) Reperfusion 48 Stunden (T48) Gruppe; (H) Reperfusion 7 Tage (D7) Gruppe; (I) Reperfusion 14 Tage (D14) Gruppe (Skala 50 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Pathologische Veränderungen im Dünndarm nach der Operation. (A) Scheingruppe; (B) Ischemia-Gruppe (T0-Gruppe); (C) Reperfusion 6 Stunden (T6) Gruppe; (D) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (E) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (F) Reperfusion 24 Stunden (T24) Gruppe; (G) Reperfusion 48 Stunden (T48) Gruppe; (H) Reperfusion 7 Tage (D7) Gruppe; (I) Reperfusion 14 Tage (D14) Gruppe (Skala 50 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Pathologische Veränderungen in der Bauchspeicheldrüse nach der Operation. (A) Scheingruppe; (B) Ischemia-Gruppe (T0-Gruppe); (C) Reperfusion 6 Stunden (T6) Gruppe; (D) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (E) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (F) Reperfusion 24 Stunden (T24) Gruppe; (G) Reperfusion 48 Stunden (T48) Gruppe; (H) Reperfusion 7 Tage (D7) Gruppe; (I) Reperfusion 14 Tage (D14) Gruppe (A- und D-Skala 50 m; BCEFGHI-Skala 50 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Pathologische Veränderungen im Herzen nach der Operation. (A) Scheingruppe; (B) Ischemia-Gruppe (T0-Gruppe); (C) Reperfusion 6 Stunden (T6) Gruppe; (D) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (E) Reperfusion 12 Stunden (T12) Gruppe; (F) Reperfusion 24 Stunden (T24) Gruppe; (G) Reperfusion 48 Stunden (T48) Gruppe; (H) Reperfusion 7 Tage (D7) Gruppe; (I) Reperfusion 14 Tage (D14) Gruppe (A Skala 50 m; BCDEFGHI-Skala 100 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Veränderungen von ALT, AST, Kreatinin (Cr) und Amylase in jeder Gruppe; *Statistisch signifikant im Vergleich zur Scheingruppe (P<0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
OLT bei Ratten ist ein ideales Modell für die Untersuchung der Organkonservierung bei Lebertransplantation, IRI, Transplantationsabstoßung, Immuntoleranz, Transplantationspathologie und Pharmakologie, Homotransplantation und Xenotransplantation. Derzeit ist es weit verbreitet in der experimentellen Forschung der Lebertransplantation verwendet.
Während Pilotstudien verabreichten wir zunächst pentobarbitales Natriumintraperitonealanästhesie und fanden heraus, dass dies zu einer hohen postoperativen Mortalität und einer kurzen Toleranz gegenüber hämodynamischen Veränderungen führte. So verwendeten wir Inhalationsanästhesie in nachfolgenden Studien für schnelles Eingreifen und schnellen Ausschluss von In-vitro-Eigenschaften. Der Wechsel zur Inhalationsanästhesie verbesserte die Toleranzzeit und das postoperative Überleben von Ratten signifikant. Die Ermittler sollten auf die Atmung und die Herzfrequenz der Ratte achten, um eine Überbezäunung des Anästhetikums zu verhindern. Biosysteme können verwendet werden, um die Herzfrequenz und den Blutdruck zu überwachen. Wir beobachteten auch die Auswirkungen der chirurgischen Nahtdicke auf die Ligation der Blutgefäße. Obwohl Linien kleiner als 3-0 die Blutgefäße perfekt ligand, waren sie schwer zu lösen und können zum Bruch der Blutgefäße führen. Im Gegenteil, Linien größer als 3-0 können zu unvollständigen Gefäßverschluss führen, die hämodynamische Veränderungen verhindert. Diese materiellen Probleme werden in zukünftigen Experimenten verbessert. Es gibt einige Einschränkungen für unser Protokoll. Wärmelampen werden wegen ihres Überhitzungspotenzials nicht für die Temperaturerhaltung empfohlen; Alternative Heizvorschläge, wie z.B. Umwälzwasserdecken, werden zum Wohle des Tieres empfohlen.
Es gibt viele Gründe für distale Organverletzungen nach OLT. Erstens kann eine Verletzung durch die kalte Konservierung der Spenderleber in vitro20verursacht werden. Zweitens kann IRI auftreten und Gewebeschäden verursachen, wenn die Blutversorgung nach einer langen Zeit der Ischämie in das Gewebe zurückkehrt (Reperfusion). Ischämie ist die Hauptursache für Verletzungen, und Reperfusion ist der Prozess, wo die Verletzung auftritt. Nach gleichzeitiger Blockierung von IVC und PV während der anhepatischen Phase trat eine große Menge an Blutstase in den unteren Gliedmaßen und inneren Organen auf. Das effektive Zirkulierende Volumen (ECV) ging stark zurück, und der MAP verringerte sich. Aufgrund der Vagusnervstimulation gab es jedoch keine kompensatorische Erhöhung der Herzfrequenz bei Ratten. In diesem Experiment fanden wir heraus, dass Ratten innerhalb von 5 Minuten nach Ligation und Gefäßfreisetzung signifikante hämodynamische Veränderungen erlitten, die der Definition des Ischämie-Reperfusionssyndroms entsprachen.
Ischämie trat in einigen Geweben außerhalb der Leber auf. Nach der anhepatischen Phase erhöhte sich der ECV. MAP normalisierte sich wieder, nachdem DIE IVC und PV entsperrt wurden, wobei Verletzungen außerhalb der Leber nach der Reperfusion auftraten. Darüber hinaus produzierte IRI der Leber des Spenders entzündliche Mediatoren (TNF-α, Interleukin-1, Interleukin-6, Interleukin-8), die die distalen Organe angegriffen21. In diesem Experiment wurde die Hämodynamik während der anhepatischen Phase simuliert, die die passive Verstopfung von IVC und Niere, Schäden an der Magen-Darm-Barriere, bakterielle Translokation, Ischämie der Organe (z. B. Lunge, Herz, Bauchspeicheldrüse, Niere usw.), wo sich der SVC befindet, und IRI an den extrahepatischen Organen verursachte.
Die pathologischen Befunde zeigten, dass der Höhepunkt der ischämischen Verletzung und die Erholungszeit in jedem Organ unterschiedlich waren. Obwohl Kältespeicherung und Schäden durch Immunfaktoren in dieser Studie nicht simuliert werden konnten, kann anhepatische IRI repliziert und mit anderen Tiermodellen verglichen werden, um extrahepatische Organverletzungen zu erforschen. Unser Modell und OLT-Modell können verglichen und beobachtet werden, um eine Grundlage für die Forschung über extrahepatische Organverletzungen zu bilden. Darüber hinaus ähnelt unser Modell einigen klinischen Leberoperationen, wie z. B. dem für das Hilar-Choliorzinom. Hilar Cholangiocarcinom ist ein bösartiger Tumor, der häufig in die PV oder das IVC eindringt und häufig PV-Klemmung während der Operationerfordert 22. Leberportal Rekonstruktion durchgeführt wurde; Wenn der Tumor in das IVC eindringt, ist auch eine intraoperative Klemmung des IVC erforderlich, und die daraus resultierenden hämodynamischen Veränderungen stimmen mit unserem Modell überein.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Modell bei Ratten einfach zu bedienen und unkompliziert ist, ohne Mikrochirurgie, und bietet die Grundlage für die Grundlagenforschung zu IRI von extrahepatischen Organen nach Leberischämie.
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Disclosures
Die Autoren dieses Manuskripts haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir möchten die nützlichen Vorschläge von Dr. Wen-tao Li und Dr. Ji-hua Wu vom Second Affiliated Hospital der Guangxi Medical University würdigen. Die Autoren danken unseren Teamkollegen für nützliche Kommentare und Diskussionen. Die Autoren bedanken sich auch bei den anonymen Rezensenten und Redakteuren von JoVE für ihre Kommentare. Ein besonderer Dank gilt den Eltern von Dr. Yuan für ihre kontinuierliche Unterstützung und Ermutigung. Die Arbeit wurde von der Ningbo Natural Science Foundation (2014A610248) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde solution | Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd | P804536 | |
| air drying oven | Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd. | BPG | |
| Alanine aminotransferase (ALT)Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K235-S | |
| ammonia | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10002118 | |
| amylase Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K005-M | |
| anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 100092183 | |
| Animal anesthesia machine | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | R640 | |
| aspartate aminotransferase (AST)kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03040 | |
| automatic biochemical analyzer. | SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd. | 2400 | |
| Biosystems (when nessary) | Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd. | BL-420F | |
| Centrifuge | Baiyang Medical Instrument Co., Ltd. | BY-600A | |
| cover glass | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd | 10212432C | |
| creatinine Kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03076 | |
| dewatering machine | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Donatello Series 2 | |
| embedding machine | Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd. | KH-BL1 | |
| frozen machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| hematoxylin-eosin dye solution | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| high-efficiency paraffin wax | Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd | Q/YSQN40-91 | |
| hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10011018 | |
| intraocular lens (IOL)forceps | Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd. | JTZRN | |
| Isoflurane | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | — | |
| micro Scissors(when nessary) | Shanghai Surgical Instrument Factory | WA1010 | |
| needle holders | Shanghai Surgical Instrument Factory | J32010 | |
| neutral gum | Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd. | — | |
| normal optical microscope | Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd | Nikon Eclipse CI | |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | J3CO30 | straight |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | JD1060 | bending |
| ophthalmic Scissors | Shanghai Surgical Instrument Factory | J1E0 | |
| pathological slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| pipettes | Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd. | 7010101008 | |
| retractors | Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd. | JNT-KXQ | |
| scanner | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Pannoramic 250 | |
| slide | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G6004 | |
| xylene | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 1330-20-7 |
References
- Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
- Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
- Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
- Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
- Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
- Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
- Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
- Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
- Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
- Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
- Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
- Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933 (2018).
- Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662 (2015).
- Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
- Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
- Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
- Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
- Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818 (2019).
- Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
- Blaire, A., et al.
